一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法
【專利摘要】一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，步驟如下：a、斜面培養(yǎng)：將地衣芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)24h；b、制備菌懸液：用無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成菌懸液；c、一級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟b中制備的菌懸液接種于裝有種子培養(yǎng)基的一級(jí)種子罐中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h；d、補(bǔ)料分批發(fā)酵：將步驟c中制備的一級(jí)種子按照體積比10％的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1.0vvm的條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，開始勻速流加補(bǔ)料，補(bǔ)料結(jié)束后控制pH7.0-7.5，40h終止發(fā)酵；e、檢測(cè)發(fā)酵單位：檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位并與不補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)的桿菌肽的發(fā)酵單位進(jìn)行比較。
【專利說明】一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桿菌肽屬多肽類抗生素，是由多種氨基酸結(jié)合而成的不穩(wěn)定的多肽，對(duì)革蘭氏陽性菌和部分陰性菌有強(qiáng)烈的抑制作用，它可以抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，影響其蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞膜功能，從而達(dá)到消除病原菌的目的。桿菌肽由多個(gè)氨基酸組成，由于其高效、無毒副作用、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性及交叉耐藥性、排泄快等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。
[0003]桿菌肽發(fā)酵生產(chǎn)使用地衣芽孢桿菌，以玉米淀粉、豆柏粉為主要碳、氮源，培養(yǎng)溫度為37°C，經(jīng)40h耗氧發(fā)酵培養(yǎng)生物合成桿菌肽，但發(fā)酵水平不高，生產(chǎn)能耗和生產(chǎn)成本高，目前對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)桿菌肽的研究主要是發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，或者發(fā)酵條件的優(yōu)化，并沒有取得很好的效果；也有的工廠通過傳統(tǒng)的誘變育種來篩選高產(chǎn)桿菌肽的菌株，雖然發(fā)酵單位有了一定的提高，但是菌株的活力卻在不斷的下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提高發(fā)酵單位，降低生產(chǎn)能耗和生產(chǎn)成本。
[0005]本發(fā)明為實(shí) 現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，包括以下操作步驟:
[0007]a、斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)24h ；
[0008]b、制備菌懸液:用無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成菌懸液；
[0009]C、一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟b中制備的菌懸液接種于裝有種子培養(yǎng)基的一級(jí)種子罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ；
[0010]d、補(bǔ)料分批發(fā)酵:將步驟c中制備的一級(jí)種子按照體積比10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1.0vvm的條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，開始勻速流加補(bǔ)料，補(bǔ)料結(jié)束后控制PH7.0-7.5,40h終止發(fā)酵；
[0011]e、檢測(cè)發(fā)酵單位:發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位，并與不補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)的桿菌肽的發(fā)酵單位進(jìn)行比較。
[0012]步驟a中所用斜面培養(yǎng)基(m/v)的成分及用量為:葡萄糖I %、蛋白胨1.5 %、牛肉膏I %、酵母浸出粉0.2 %、瓊脂2.0%，培養(yǎng)基的pH7.0。
[0013]步驟c中所用種子培養(yǎng)基(m/v)的原料及用量為:黃豆餅粉3%、玉米粉2%、玉米淀粉I %、玉米漿0.5%、硫酸銨0.15%、碳酸鈣0.3%，培養(yǎng)基的pH6.8。
[0014]步驟d中所用發(fā)酵培養(yǎng)基(m/v)的成分及用量為:豆柏粉9%、玉米粉2%、玉米淀粉3%、硫酸銨0.3%、硫酸鎂0.003%、碳酸鈣0.5%，培養(yǎng)基的pH7.2，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵罐容積的50-80%。[0015]步驟d所述的補(bǔ)料(m/v)成分及用量為:豆柏粉6-9%、玉米粉0.5_1%、玉米淀粉2-3%、玉米漿0.3-0.5%、葡萄糖5-8%，補(bǔ)料pH為5.5-6.5，補(bǔ)料流加速度為每小時(shí)流加發(fā)酵液體積的1-2%，共流加發(fā)酵液總體積的10% -20%。
[0016]步驟d中補(bǔ)料結(jié)束后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制pH7.0-7.5。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的方法提高了發(fā)酵水平，并且補(bǔ)料成分簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本被耗盡，同時(shí)緩解了對(duì)數(shù)期速效營(yíng)養(yǎng)不足的矛盾，有利于生物量的提高，降低生產(chǎn)能耗和生產(chǎn)成本，與不補(bǔ)料相比桿菌肽產(chǎn)量有較大幅度的提聞。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明提供了一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提高發(fā)酵單位，降低生產(chǎn)能耗和生產(chǎn)成本，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 [0019]具體實(shí)施例1，一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，包括以下操作步驟:
[0020]a、斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)24h ；
[0021]b、制備菌懸液:用無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成菌懸液；
[0022]C、一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟b中制備的菌懸液接種于裝有IOL種子培養(yǎng)基的15L —級(jí)種子罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ；
[0023]d、補(bǔ)料分批發(fā)酵:將步驟c中制備的一級(jí)種子按照體積比10%的接種量接種于裝有30L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1.0vvm的條件下培養(yǎng)3h后，開始以0.3L/h的速率勻速流加成分及含量為豆柏粉6%、玉米粉0.5%、玉米淀粉3%、玉米漿0.3%、葡萄糖7%的補(bǔ)料(m/v)，共流加3L補(bǔ)料，13h流加結(jié)束，然后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速將pH控制在7.0-7.5的范圍之內(nèi)，40h終止發(fā)酵；
[0024]e、檢測(cè)發(fā)酵單位:發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為959U/ml，不補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)的桿菌肽的發(fā)酵單位為830U/ml。
[0025]具體實(shí)施例2，一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，包括以下操作步驟:
[0026]a、斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)24h ；
[0027]b、制備菌懸液:用無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成菌懸液；
[0028]C、一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟b中制備的菌懸液接種于裝有IOL種子培養(yǎng)基的15L —級(jí)種子罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ；
[0029]d、補(bǔ)料分批發(fā)酵:將步驟c中制備的一級(jí)種子按照體積比10%的接種量接種于裝有30L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1.0vvm的條件下培養(yǎng)3h后，開始以0.6L/h的速率勻速流加成分及含量為豆柏粉9%、玉米粉0.6%、玉米淀粉
2.3%、玉米漿0.5%、葡萄糖5%的補(bǔ)料(m/v)，共流加5L補(bǔ)料，11.5h流加結(jié)束，然后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速將PH控制在7.0-7.5的范圍之內(nèi)，40h終止發(fā)酵；
[0030]e、檢測(cè)發(fā)酵單位:發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為1036U/ml，不補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)的桿菌肽的發(fā)酵單位為830U/ml。[0031]具體實(shí)施例3，一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，包括以下操作步驟:
[0032]a、斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)24h ；
[0033]b、制備菌懸液:用無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成菌懸液；
[0034]C、一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟b中制備的菌懸液接種于裝有IOL種子培養(yǎng)基的15L —級(jí)種子罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ；
[0035]d、補(bǔ)料分批發(fā)酵:將步驟c中制備的一級(jí)種子按照體積比10%的接種量接種于裝有30L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，在溫度37 °C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1.0vvm的條件下培養(yǎng)4h后，開始以0.4L/h的速率勻速流加成分及含量為豆柏粉8 %、玉米粉I %、玉米淀粉2 %、玉米漿0.5%、葡萄糖6%的補(bǔ)料(m/v)，共流加4L補(bǔ)料，14h流加結(jié)束，然后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速將pH控制在7.0-7.5的范圍之內(nèi)，40h終止發(fā)酵；
[0036]e、檢測(cè)發(fā)酵單位:發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為1100U/ml，不補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)的桿菌肽的發(fā)酵單位為830U/ml。
[0037]本發(fā)明提供的方法提高了發(fā)酵水平，并且補(bǔ)料成分簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本被耗盡，同時(shí)緩解了對(duì)數(shù)期速效營(yíng)養(yǎng)不足的矛盾，有利于生物量的提高，降低生產(chǎn)能耗和生產(chǎn)成本，與不補(bǔ)料相比桿菌肽產(chǎn)量有較大幅度的提高。
【權(quán)利要求】
1.一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其特征在于包括以下操作步驟: a、斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)24h； b、制備菌懸液:用無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成菌懸液； C、一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟b中制備的菌懸液接種于裝有種子培養(yǎng)基的一級(jí)種子罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ； d、補(bǔ)料分批發(fā)酵:將步驟c中制備的一級(jí)種子按照體積比10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1.0vvm的條件下進(jìn)行發(fā)酵,當(dāng)菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，開始勻速流加補(bǔ)料，補(bǔ)料結(jié)束后控制pH7.0-7.5,40h終止發(fā)酵； e、檢測(cè)發(fā)酵單位:發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位，并與不補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)的桿菌肽的發(fā)酵單位進(jìn)行比較。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其特征在于，步驟a中所用斜面培養(yǎng)基(m/v)的成分及用量為:葡萄糖1%、蛋白胨1.5%、牛肉膏I %、酵母浸出粉0.2 %、瓊脂2.0%，培養(yǎng)基的pH7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其特征在于，步驟c中所用種子培養(yǎng)基(m/v)的原料及用量為:黃豆餅粉3%、玉米粉2%、玉米淀粉I %、玉米漿0.5%、硫酸銨0.15%、碳酸鈣0.3%，培養(yǎng)基的pH6.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其特征在于，步驟d中所用發(fā)酵培養(yǎng)基(m/v)的成分及用量為:豆柏粉9%、玉米粉2%、玉米淀粉3%、硫酸銨0.3%、硫酸鎂0.003%、碳酸鈣0.5%，培養(yǎng)基的pH7.2，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵罐容積的50-80%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其特征在于，步驟d所述的補(bǔ)料(m/v)成分及用量為:豆柏粉6-9%、玉米粉0.5-1%、玉米淀粉2-3%、玉米漿0.3-0.5%、葡萄糖5-8%，補(bǔ)料pH為5.5-6.5，補(bǔ)料流加速度為每小時(shí)流加發(fā)酵液體積的1-2%，共流加發(fā)酵液總體積的10% -20%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種連續(xù)流加補(bǔ)料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價(jià)的方法，其特征在于，步驟d中補(bǔ)料結(jié)束后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制pH7.0-7.5。
【文檔編號(hào)】C12P21/04GK103882081SQ201410163024
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】林青, 郭耀光 申請(qǐng)人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司