通過(guò)添加錳降低培養(yǎng)物粘度的制作方法
【專利摘要】一種在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生產(chǎn)一種感興趣的酶的方法，該方法包括：a)將一種微生物在一種有益于其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中該微生物產(chǎn)生該感興趣的酶；并且b)在該培養(yǎng)過(guò)程中，向該培養(yǎng)基中添加一種錳化合物一次或多次。
【專利說(shuō)明】通過(guò)添加錳降低培養(yǎng)物粘度
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在生產(chǎn)一種感興趣的酶的發(fā)酵過(guò)程中降低發(fā)酵液粘度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌微生物和真菌微生物是工業(yè)微生物學(xué)的主力，因?yàn)樗鼈冇糜谠S多不同治療劑(例如青霉素和頭孢菌素)、藥物蛋白(例如胰島素)、酶(例如蛋白酶和淀粉酶)、以及大宗化學(xué)品(例如檸檬酸)的商業(yè)化生產(chǎn)。
[0003]在相同條件(例如相同的壓力、溫度、通氣、以及攪拌)下，與具有較低粘度的培養(yǎng)相比，具有高粘度的培養(yǎng)液的培養(yǎng)具有減少的氧傳遞。在消耗氧的過(guò)程中，不得不用增加的通氣和/或攪拌(通常很昂貴)對(duì)增加的粘度進(jìn)行補(bǔ)償，從而在培養(yǎng)基中保持相同的氧張力。可替代地，不得不降低耗氧量，這通常導(dǎo)致不太有效的工藝并且由此降低所希望的產(chǎn)物
的產(chǎn)量。
[0004]為了降低補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的粘度已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試，例如，W003/029439披露了一種通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中以一種循 環(huán)脈沖定量給料/暫停方式來(lái)添加碳水化合物從而降低發(fā)酵液粘度的方法，其中脈沖定量給料時(shí)間短于暫停時(shí)間。
[0005]已知錳化合物在培養(yǎng)基中作為微量元素的用途，參見(jiàn)例如，《生物技術(shù)的電子期刊》，第 5 卷，2002，110-117 頁(yè)。
[0006]發(fā)明概述
[0007]諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中添加一種錳化合物來(lái)顯著降低培養(yǎng)基的發(fā)酵液粘度，因此我們要求:
[0008]一種在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生產(chǎn)一種感興趣的酶的方法，該方法包括:
[0009]a)將一種微生物在一種有益于其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中該微生物產(chǎn)生該感興趣的酶；并且
[0010]b)在該培養(yǎng)過(guò)程中，向該培養(yǎng)基中添加一種猛化合物一次或多次。
[0011]發(fā)明的詳細(xì)披露
[0012]本發(fā)明披露了一種在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生產(chǎn)一種感興趣的酶的方法，其中在培養(yǎng)過(guò)程中，向該培養(yǎng)基中添加一種猛化合物。
[0013]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加該錳化合物的培養(yǎng)相比，培養(yǎng)基的粘度可以得以降低。
[0014]還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加該錳化合物的培養(yǎng)相比，該感興趣的化合物的產(chǎn)量可以得以增加。
[0015]感興趣的酶
[0016]在本發(fā)明的背景下的酶可以是通過(guò)發(fā)酵可獲得的任何酶或不同酶的組合。因此，當(dāng)引用“一種酶”時(shí)，這通常將被理解為包括一種單一的酶以及多于一種酶的組合兩者。
[0017]應(yīng)該理解的是，酶變體(例如由重組技術(shù)產(chǎn)生)被包括在術(shù)語(yǔ)“酶”的意義之內(nèi)。
[0018]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，這種感興趣的酶是一種水解酶(根據(jù)EnzymeNomenclature (酶命名法)；Recommendations of the Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry (國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)的建議)為EC3類)。
[0019]在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施例中，以下水解酶是優(yōu)選的:
[0020]a -淀粉酶(3.2.1.1)、@ -淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1，4- a -葡糖苷酶(3.2.1.3)、纖維素酶(3.2.1.4)、內(nèi)切 _1，3 (4) - ^ -匍聚糖酶(3.2.1.6)、內(nèi)切-1，4- @ -木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、殼多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、(6-葡糖苷酶(3.2.1.21)、a -半乳糖苷酶(3.2.1.22)、
半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1，6-葡糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1，4-0-木糖苷酶(3.2.1.37)、匍聚糖內(nèi)切-1, 3_ @ -D-匍糖昔酶(3.2.1.39)、糊精內(nèi)切-1，6_ a -匍糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖a-葡糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖內(nèi)切-l，3_a-葡糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1，4- P -葡糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖內(nèi)切-1，6- P -葡糖苷酶(3.2.1.75)、阿聚糖內(nèi)切-1，5-a-L-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、殼聚糖酶(3.2.1.132)、葡聚糖1，4- a -麥芽糖水解酶(3.2.1.133)、木糖異構(gòu)酶(5.3.1.5)、以及蛋白酶(3.4)。
[0021]在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施例中，以下水解酶是優(yōu)選的:
[0022]淀粉酶:
[0023]一種淀粉酶可以是根據(jù)本發(fā)明而生產(chǎn)的所希望的酶。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。對(duì)于本發(fā)明的淀粉酶的來(lái)源沒(méi)有限制。因此，術(shù)語(yǔ)淀粉酶不僅包括天然或野生型淀粉酶，還包括其展現(xiàn)出淀粉酶活性的任何突變體、變體、片段等，以及合成的淀粉酶，例如經(jīng)改組的淀粉酶和共有淀粉酶?？梢园凑毡绢I(lǐng)域中公知的方法，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變、PCR(在PCR反應(yīng)中使用含有所希望突變的PCR片段作為引物之一)、或隨機(jī)誘變來(lái)制備此類經(jīng)基因工程改造的淀粉酶。淀粉酶包括a-淀粉酶、3 -淀粉酶以及麥芽糖淀粉酶。
[0024]a -淀粉酶可以來(lái)源于芽胞桿菌屬，例如來(lái)源于地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(B.sultilis)以及嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株。其他a-淀粉酶包括來(lái)源于芽孢桿菌屬菌株NC皿2289、NC皿2512、NCIB12513或DSM9375的a -淀粉酶，所有的這些詳細(xì)描述在 W095/26397 中，或 Tsukamoto (冢本)等，Biochemical and BiophysicalResearch Communications (《生物化學(xué)和生物物理研究通訊》)，151 (1988)，25-31頁(yè)中描述的a-淀粉酶。
[0025]其他a-淀粉酶包括來(lái)源于絲狀真菌、優(yōu)選曲菌屬菌株(例如米曲霉和黑曲霉)的a _淀粉酶。
[0026]所希望的酶還可以是一種P -淀粉酶，例如披露于W.M.Fogarty (ff.M.福格蒂)和C.T.Kelly (C.T.凱利)，Progress in Industrial Microbiology (《工業(yè)微生物進(jìn)展》)，第15卷，112-115頁(yè)，1979中的任何植物以及微生物的P -淀粉酶。
[0027]所希望的酶還可以是一種麥芽糖淀粉酶?！胞溠刻堑矸勖浮?葡聚糖l，4-a-麥芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯獬蒩構(gòu)型的麥芽糖。一種感興趣的麥芽糖淀粉酶是來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株NCIBl 1837的麥芽糖淀粉酶。麥芽糖a-淀粉酶描述于美國(guó)專利號(hào)4，598, 048 ;4，604，355 ;以及6，162,628中。
[0028]可商購(gòu)的淀粉酶是DURAMYL?、TERMAMYL?、FUNGAMYL?、NATALASE?、TERMAMYLLC?、TERMAMYLSC?、LIQUIZYME-X?、NOVAMYL?、以及 BAN?(Novozymes A/S(諾維信公司))、RAPIDASE? 以及 HJRASTAR?(來(lái)自 Genencor International Inc.(杰能科國(guó)際公司))。
[0029]纖維素酶:
[0030]適合的纖維素酶包括細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源的那些纖維素酶。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。適合的纖維素酶包括來(lái)自芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢霉屬、梭孢殼菌屬、枝頂孢屬、以及木霉屬的纖維素酶，例如，由特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲菌、尖孢鐮刀菌以及里氏木霉產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
[0031]脂肪酶:
[0032]適合的脂肪酶包括細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源的那些脂肪酶。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬(同物異名詞為嗜熱絲孢菌屬)，例如來(lái)自柔毛腐質(zhì)霉(疏棉狀嗜熱絲孢菌)或來(lái)自特異腐質(zhì)霉的脂肪酶。其他有用的脂肪酶是假單胞菌屬脂肪酶，例如，來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌、類產(chǎn)堿假單胞菌、洋蔥假單胞菌、施氏假單胞菌、螢光假單胞菌、或威斯康辛假單胞菌(P.wisconsinensis)的脂肪酶。其他有用的脂肪酶是從芽孢桿菌，例如從枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或短小芽孢桿菌獲得的。
[0033]蛋白酶:
[0034]適合的蛋白酶包括動(dòng)物、 植物或微生物來(lái)源的那些蛋白酶。優(yōu)選微生物來(lái)源。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。對(duì)于本發(fā)明的蛋白酶的來(lái)源沒(méi)有限制。因此，術(shù)語(yǔ)蛋白酶不僅包括天然或野生型蛋白酶，還包括其展現(xiàn)出蛋白酶活性的任何突變體、變體、片段等，以及合成的蛋白酶，例如經(jīng)改組的蛋白酶和共有蛋白酶?？梢园凑毡绢I(lǐng)域中公知的方法，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變、PCR(在PCR反應(yīng)中使用含有所希望突變的PCR片段作為引物之一)、或隨機(jī)誘變來(lái)制備經(jīng)基因工程改造的蛋白酶。
[0035]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，這種蛋白酶是一種酸性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。
[0036]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，這種蛋白酶是一種枯草桿菌蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶是一種使用了由Asp32、His64以及Ser221 (枯草桿菌蛋白酶BPN’編號(hào))組成的催化三聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶。它包括屬于NC-1UBMB酶分類:EC3.4.21.62的任何酶。
[0037]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，這種枯草桿菌蛋白酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:嘉士伯枯草桿菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)、枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309以及枯草桿菌蛋白酶1168。
[0038]優(yōu)選的可商購(gòu)的枯草桿菌蛋白酶包括ALCALASE?、SAVINASE?、ESPERASE?、PRIMASE?、DURALASE?、RELASE?EVERLASE?、0V0ZYME?、C0R0NASE?、P0LARZYME?、以及KANNASE?(Novozymes A/S(諾維信公司));MAXATASEtm、MAXACALtm、MAXAPEMtm、PROPERASE?、PURAFECT?、PURAFECT OXP?、FN2?、FN3?、以及 FM? (Genencor International Inc.(杰能科國(guó)際公司))；以及BLAPXTM(Henkel (漢高公司))。
[0039]淀粉葡糖苷酶:
[0040]適合的淀粉葡糖苷酶包括真菌來(lái)源的那些淀粉葡糖苷酶，尤其是來(lái)自絲狀真菌或酵母菌的那些淀粉葡糖苷酶，例如埃默森籃狀菌、黑曲霉以及泡盛曲霉。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。[0041]其他優(yōu)選的水解酶是碳水化合物水解酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、異構(gòu)酶、以及連接酶。
[0042]微牛物
[0043]表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的感興趣的酶的微生物可以是任何可在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的微生物。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的微生物可以是一種細(xì)菌菌株，例如革蘭氏陽(yáng)性菌株，例如芽孢桿菌、梭菌、腸球菌、地芽孢桿菌、乳酸桿菌、乳球菌、海洋芽孢桿菌(Oceanobacillus)、葡萄球菌、鏈球菌、或鏈霉菌菌株；或革蘭氏陰性菌株，例如彎曲桿菌、大腸桿菌、黃桿菌、梭桿菌、螺桿菌、泥桿菌(Ilyobacter)、奈瑟菌、假單胞菌、沙門(mén)氏菌、或尿素原體菌株。
[0045]在一個(gè)方面中，該菌株是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇蕓金芽孢桿菌菌株，特別是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。
[0046]在另一個(gè)方面中，該菌株是似馬鏈球菌、化膿性鏈球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸疫亞種囷株。
[0047]在另一個(gè)方面中，該菌株是產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、或變鉛青鏈霉菌菌株。
[0048]該微生物可以是一種真菌菌株。例如，該菌株可以是酵母菌株，例如假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或亞羅酵母屬菌株；或絲狀真菌菌株，例如枝頂孢屬、傘菌屬、交鏈孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、葡萄座腔菌屬(Botryospaeria)、擬臘菌屬(Ceripo`riopsis)、毛_殼屬、金孢屬、麥角菌屬、旋孢腔菌屬、鬼傘屬、乳白蟻屬(Coptotermes)、棒囊殼屬、隱叢赤殼屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、線黑粉酵母屬、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲(chóng)屬、腐質(zhì)霉屬，耙菌屬、香菇屬、小球腔菌屬(Leptospaeria)、巨座殼屬、Melanocarpus、亞灰樹(shù)花菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬，脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤(pán)菌屬、假披發(fā)蟲(chóng)屬(Pseudotrichonympha)、根毛霉屬、裂裙菌屬、柱頂孢霉屬(Scytalidium)、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬、輪枝孢屬、小包腳菇屬、或炭角菌屬菌株。
[0049]在另一個(gè)方面中，該菌株是卡爾酶母、釀酒酶母、糖化酶母、道格拉斯酵母、克魯弗酵母、諾地酶母或卵形酵母菌株。
[0050]在另一個(gè)方面中，該菌株是解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、Chrysosporium inops、嗜角質(zhì)金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum> 熱帶金抱子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、桿抱狀鍵抱(Fusariumbactridioides)、禾谷鍵抱(Fusarium cerealis)、庫(kù)威鍵抱(Fusarium crookwelIense)、大刀鍵抱(Fusarium cuImorum)、禾本科鍵抱(Fusarium graminearum)、禾赤鍵抱(Fusarium graminum)、異抱鍵抱(Fusarium heterosporum)、合歡木鍵抱(Fusariumnegundi)、尖鍵抱(Fusarium oxysporum)、多枝鍵抱(Fusarium reticulatum)、粉紅鍵?包(Fusarium roseum)、接骨木鍵抱(Fusarium sambucinum)、膚色鍵抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱鍵抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色鍵抱(Fusariumsulphureum)、圓鍵抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱鍵抱(Fusarium trichothecioides)、壤片鍵抱(Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、白囊祀齒菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無(wú)色梭抱殼(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭抱殼(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimet1、小抱梭抱殼(Thielavia microspora)、卵抱梭抱殼(Thielavia ovispora) > Thielaviaperuviana、毛梭抱殼(Thielavia setosa)、瘤抱梭抱殼(Thielavia spededonium)、亞嗜熱梭抱殼(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭抱殼(Thielavia terrestris)、哈茨木霉、康氏木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉囷株。
[0051]這些物種的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)為公眾所得到，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)、荷蘭真菌菌種保藏中心(Ccntraalbureau Voor Schimmelcultures, CBS)、和美國(guó)北方農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, NorthernRegional Research Center, NRRL)。
[0052]遞
[0053]本發(fā)明對(duì)于工業(yè)規(guī)模的任何補(bǔ)料分批發(fā)酵可以是有用的，例如用于具有至少50升、優(yōu)選至少100升、更優(yōu)選至少500升、甚至更優(yōu)選至少1000升、特別是至少5000升的培
養(yǎng)基的任何發(fā)酵。
[0054]可以通過(guò)本領(lǐng)域中任何已知的方法來(lái)發(fā)酵微生物。發(fā)酵培養(yǎng)基可以是復(fù)合培養(yǎng)基，包括復(fù)合的氮源和/或碳源，例如大豆粉`、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米漿、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、馬鈴薯蛋白、馬鈴薯蛋白水解物、糖蜜、等。發(fā)酵培養(yǎng)基可以是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，例如在W098/37179中所定義的培養(yǎng)基。
[0055]可以使用碳限制條件來(lái)進(jìn)行發(fā)酵。碳限制條件意為通過(guò)碳源的添加來(lái)控制微生物的生長(zhǎng)。
[0056]如果該微生物除了產(chǎn)生感興趣的酶之外，還產(chǎn)生一種胞外DNA酶，那么本發(fā)明的方法可以是有用的。DNA酶可以是天然DNA酶，或一個(gè)拷貝的DNA酶可以已經(jīng)插入感興趣的微生物中。
[0057]已知許多DNA酶需要二價(jià)陽(yáng)離子以發(fā)揮作用。根據(jù)本發(fā)明，如果該微生物除了產(chǎn)生感興趣的酶之外，還產(chǎn)生一種胞外DNA酶，那么與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的DNA的量可以是更低的。
[0058]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，感興趣的酶的產(chǎn)量得以增加；具體地，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)3天之后，感興趣的酶的產(chǎn)量得以增加。
[0059]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種猛化合物的培養(yǎng)相比，粘度得以降低；具體地，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)5小時(shí)后粘度得以降低；具體地，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)10小時(shí)后粘度得以降低；具體地，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)15小時(shí)后粘度得以降低；具體地，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)20小時(shí)后粘度得以降低；具體地，與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加這種錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)25小時(shí)后粘度得以降低。
[0060]錳化合物
[0061]這種錳化合物可以是本領(lǐng)域中已知的任何錳化合物。這種錳化合物尤其可以選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:硫酸錳、碳酸錳、乙酸錳以及氯化錳。
_2] 錳化合物的添加
[0063]可以在培養(yǎng)過(guò)程中，單獨(dú)地添加錳化合物；或可以在發(fā)酵過(guò)程中，將錳化合物與碳水化合物一起作為補(bǔ)料培養(yǎng)基來(lái)添加。
[0064]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將知道針對(duì)具體的培養(yǎng)，如何在培養(yǎng)過(guò)程中優(yōu)化添加錳化合物的最佳方式:可以添加這種錳化合物一次或多次?？梢栽谂囵B(yǎng)過(guò)程中添加這種錳化合物一次；或可以在培養(yǎng)過(guò)程中添加它兩次；或可以在培養(yǎng)過(guò)程中添加它三次；或可以在培養(yǎng)過(guò)程中添加它四次；或可以在培養(yǎng)過(guò)程中添加它五次；等等。
[0065]還可以在發(fā)酵過(guò)程中連續(xù)地添加這種錳化合物。
[0066]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以在培養(yǎng)已經(jīng)剛剛開(kāi)始之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始I小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始2小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始3小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始4小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始5小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始6小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始7小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始8小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始9小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始10小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始11小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始12小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始13小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始14小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始15小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始16小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始17小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始18小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始19小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始20小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始21小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始22小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始23小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始24小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始25小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始26小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始27小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始28小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始29小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始30小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始31小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始32小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始33小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始34小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始35小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始36小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始37小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始38小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始39小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始40小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始41小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始42小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始43小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始44小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物；或可以在培養(yǎng)已經(jīng)開(kāi)始45小時(shí)之后開(kāi)始添加這種錳化合物。
[0067]可以典型地以IO-1OOmg/升起始培養(yǎng)基/天的量來(lái)添加這種錳化合物(按MnS04, 1H20計(jì)算)。更多細(xì)節(jié)，參見(jiàn)實(shí)例I。
[0068]粘度
[0069]粘度是由于剪應(yīng)力亦或張應(yīng)力正在變形的流體的阻力的量度。在日常術(shù)語(yǔ)中，粘度是“厚度”或“內(nèi)摩擦”。因此，水是“薄的”，具有較低的粘度；而蜂蜜是“厚的”，具有較高的粘度。簡(jiǎn)而言之，流體的粘度越低，它就越容易運(yùn)動(dòng)(流動(dòng)性)。
[0070]粘度描述了流體對(duì)抗流動(dòng)的內(nèi)部阻力并且可以被認(rèn)為是流體摩擦的量度。
[0071]動(dòng)態(tài)粘度的SI物理單位是帕斯卡-秒(Pa ? s)(相當(dāng)于N ? s/m2,或kg/ (m ? s))。如果將具有一 Pa ? s的粘度的流體放置于兩塊平板之間，并且用一帕的剪應(yīng)力向一側(cè)推動(dòng)一塊平板，那么它在一秒鐘內(nèi)移動(dòng)的距離等于兩塊平板之間的層的厚度。在20°C時(shí)，水的粘度是 0.001002Pa ? S。
[0072]感興趣的化合物的回收
[0073]本發(fā)明的另一方面涉及發(fā)酵液的下游處理。在發(fā)酵過(guò)程結(jié)束之后，可以使用針對(duì)感興趣的化合物研發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將感興趣的酶從發(fā)酵液中回收。有待應(yīng)用的相關(guān)下游處理技術(shù)取決于感興趣的化合物的性質(zhì)。
[0074]用于將感興趣的酶從發(fā)酵液中回收的過(guò)程將典型地(但不限于)涉及以下步驟中的一些或全部:
[0075]I)發(fā)酵液的預(yù)處理(例如絮凝)
[0076]2)將細(xì)胞和其他固體物料從發(fā)酵液中除去(初級(jí)分離)
[0077]3)過(guò)濾
[0078]4)濃縮
[0079]5)穩(wěn)定化并且標(biāo)準(zhǔn)化。
[0080]除了以上列舉的單元操作之外，還可以應(yīng)用許多其他回收程序，例如pH-調(diào)節(jié)、溫度的變化、結(jié)晶、用活性炭處理包括感興趣的化合物的溶液、使用層析、以及使用不同的吸附劑。
[0081]在以下實(shí)例中進(jìn)一步闡明本發(fā)明，該實(shí)例不以任何方式限制所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
[0082]實(shí)施例1
[0083]使用Mn++的連續(xù)添加的地衣芽孢桿菌的補(bǔ)料分批發(fā)酵
[0084]如下所述，進(jìn)行許多產(chǎn)生感興趣的淀粉酶的地衣芽孢桿菌補(bǔ)料分批發(fā)酵。
[0085]淀粉酶序列披露于SEQ ID NO:1中(包括信號(hào)序列)。[0086]所有培養(yǎng)基通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行滅菌。除非另外描述，使用自來(lái)水。在下面的配方中提及的成分濃度是任何接種之前的濃度。
_7]第一接種物培養(yǎng)基:
[0088]SSB4 瓊脂:
[0089]大豆蛋白胨SE50MK (DMV) 10g/l ;
[0090]蔗糖10g/l ；
[0091]二水磷酸氫二鈉，5g/l ;
[0092]磷酸二氫鉀2g/l ； [0093]檸檬酸0.2g/l ；
[0094]維生素(鹽酸硫胺素11.4mg/l ;核黃素0.95mg/l ;煙酰胺7.8mg/l ;D_泛酸鈣9.5mg/l;鹽酸吡卩多醒1.9mg/l ；D-生物素0.38mg/l ;葉酸2.9mg/l)；
[0095]微量金屬(MnS04，H209.8mg/l ;FeS04，7H2039.3mg/l ;CuS04，5H203.9mg/l ;ZnS04,7H208.2mg/l)；
[0096]瓊脂25g/l。
[0097]使用去離子水。
[0098]使用NaOH將pH調(diào)節(jié)至pH7.3至7.4。
[0099]轉(zhuǎn)移緩沖液:
[0100]M-9緩沖液(使用去離子水):
[0101]二水磷酸氫二鈉8.8g/l ；
[0102]磷酸二氫鉀3g/l ；
[0103]氯化鈉4g/l;
[0104]七水硫酸鎂0.2g/l。
[0105]接種物搖瓶培養(yǎng)基(濃度是接種之前的濃度):
[0106]PRK-50:
[0107]110g/l 大豆粒；
[0108]二水磷酸氫二鈉5g/l;
[0109]在滅菌之前，使用Na0H/H3P04將pH調(diào)節(jié)至8.0。
[0110]組成培養(yǎng)基(濃度是接種之前的濃度):
[0111]胰蛋白胨(來(lái)自Difco的酪蛋白水解物)30g/l ；
[0112]七水硫酸鎂4g/l ；
[0113]磷酸氫二鉀7g/l;
[0114]二水磷酸氫二鈉7g/l;
[0115]硫酸二銨4g/l;
[0116]硫酸鉀5g/l ;
[0117]檸檬酸0.78g/l;
[0118]維生素(鹽酸硫胺素34.2mg/l ;核黃素2.8mg/l ;煙酰胺23.3mg/l ；Calcium D-泛酸?丐 28.4mg/l ；
[0119]鹽酸批P多醒5.7mg/l ；
[0120]D-生物素 1.lmg/1 ;[0121]葉酸2.5mg/l);
[0122]微量金屬(MnS04,H2039.2mg/l ;FeS04, 7H20157mg/l ;CuS04, 5H2015.6mg/l ;ZnS04, 7H2032.8mg/l)；
[0123]消泡劑(SB2121)1.25ml/l ；
[0124]在滅菌之前，使用Na0H/H3P04將pH調(diào)節(jié)至6.0。
[0125]補(bǔ)料培養(yǎng)基:
[0126]蔗糖708g/l;或
[0127]鹿糖708g/l+200mg/l —水硫酸猛
[0128]用于接種物步驟的程序:
[0129]首先，在37°C下，使菌株在SSB-4瓊脂斜面上生長(zhǎng)I天。
[0130]然后，使用M-9緩沖液洗滌瓊脂，并且在650nm處測(cè)量所得細(xì)胞懸浮液的光密度(OD)。
[0131]使用OD (650nm) Xml細(xì)胞懸浮液=0.1的接種物來(lái)接種接種物搖瓶(PRK-50)。
[0132]將搖瓶在37 °C下、在300rpm處培養(yǎng)20hr。
[0133]通過(guò)用來(lái)自該搖瓶的生長(zhǎng)培養(yǎng)物接種主發(fā)酵罐來(lái)開(kāi)始主發(fā)酵罐(發(fā)酵器)中的發(fā)酵。接種體積是組成培養(yǎng)基的11%(對(duì)于720ml組成培養(yǎng)基而言，是80ml)。
[0134]發(fā)酵罐設(shè)備:
[0135]使用配備以下項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐:溫度控制系統(tǒng)；使用氨水和磷酸的pH控制；以及用于貫穿整個(gè)發(fā)酵過(guò)程測(cè)量氧飽和度的溶氧電極。
[0136]發(fā)酵參數(shù):
[0137]溫度:38°C
[0138]使用氨水和磷酸將pH保持在6.8與7.2之間
[0139]控制:6.8 (氨水)；7.2磷酸
[0140]通氣:1.5升/min/kg發(fā)酵液重量
[0141]攬祥:1500rpm
[0142]補(bǔ)料策略:
[0143]Ohr:接種之后,0.05g/min/kg初始發(fā)酵液
[0144]8hr:接種之后,0.156g/min/kg初始發(fā)酵液
[0145]結(jié)束:接種之后,0.156g/min/kg初始發(fā)酵液
[0146]實(shí)驗(yàn)設(shè)置:
[0147]通過(guò)將包含20g/l的一水硫酸猛的10ml/l的母液無(wú)菌過(guò)濾進(jìn)包含708g/l鹿糖的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)料中來(lái)制備包含硫酸錳的進(jìn)料。通過(guò)這種添加沒(méi)有補(bǔ)償1%的進(jìn)料的稀釋。培養(yǎng)以恒定攪拌運(yùn)行三天。在培養(yǎng)I天之后，對(duì)發(fā)酵液粘度進(jìn)行離線測(cè)量。
[0148]Mn的添加:
[0149]在取得第一樣品之前的第一個(gè)20hr期間添加的Mn的量是6mg Mn。平均添加量是
11.5mg/升起始體積/天。所有的這些數(shù)字以mg Mn計(jì)算。MnSO4, IH2O的量是35.5mg/升起始體積/天。
[0150]結(jié)果:
[0151]表1示出了與對(duì)于沒(méi)有添加Mn的參比培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的活性相比，作為相對(duì)活性[%]而給出的產(chǎn)量(在第3天):
[0152]
【權(quán)利要求】
1.一種在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生產(chǎn)一種感興趣的酶的方法，該方法包括: a)將一種微生物在一種有益于其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中該微生物產(chǎn)生該感興趣的酶；并且 b)在該培養(yǎng)過(guò)程中，向該培養(yǎng)基中添加一種猛化合物一次或多次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該感興趣的酶是一種淀粉酶或一種蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該微生物是一種真菌或一種細(xì)菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中該細(xì)菌是一種芽孢桿菌菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中該芽孢桿菌菌株是一種地衣芽孢桿菌菌株或一種枯草芽孢桿菌菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該錳化合物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:硫酸錳、碳酸錳、乙酸錳以及氯化錳。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將該錳化合物與一種碳水化合物一起作為一種補(bǔ)料培養(yǎng)基添加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將該錳化合物在該培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)地添加。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該微生物除了產(chǎn)生該感興趣的酶之外，還產(chǎn)生一種胞外DNA酶 。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加該錳化合物的培養(yǎng)相t匕，該感興趣的酶的產(chǎn)量得以增加。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加該錳化合物的培養(yǎng)相t匕，粘度得以降低。
12.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中與在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加該錳化合物的培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的DNA的量更低。
【文檔編號(hào)】C12P21/00GK103764836SQ201280039393
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月12日
【發(fā)明者】J.M.珀森, N.班克 申請(qǐng)人:諾維信公司