專利名稱：利用補(bǔ)料分批發(fā)酵法通過Phaffiarhodozyma制備蝦青素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供利用補(bǔ)料分批發(fā)酵系統(tǒng)，根據(jù)細(xì)胞生長、碳源消耗和類胡蘿卜素產(chǎn)生采用新的補(bǔ)料方法由Phaffia rhodozyma(P.rhodozyma)進(jìn)行高產(chǎn)量蝦青素生產(chǎn)的方法。
已知為一種類胡蘿卜素的蝦青素是葉黃素，其通常作為海洋環(huán)境中的紅色或橙色色素而被發(fā)現(xiàn)。由于這種色素被認(rèn)為是諸如鮭魚、甲殼類和鱒魚等不能重新合成β-胡蘿卜素的海洋動(dòng)物的特征性顏色，需要將蝦青素加入所述動(dòng)物的飲食中以使得它們具有吸引消費(fèi)者的適當(dāng)顏色。這種類胡蘿卜素也可用于使其它動(dòng)物的肉體或產(chǎn)物和諸如禽肉和蛋，各種乳制品，小吃等的其它食物著色。只有一些微生物合成蝦青素，其中酵母菌P.rhodozyma由于其高蝦青素含量而是可能用于商業(yè)化生產(chǎn)的候選菌。P.rhodozyma已知為產(chǎn)類胡蘿卜素(carotenogenic)的酵母菌，其特異性產(chǎn)生蝦青素。與另一種產(chǎn)胡蘿卜素的酵母菌Rhodotorula spec不同，P.rhodozyma可發(fā)酵一些糖類例如D-葡萄糖。這對(duì)于工業(yè)應(yīng)用是重要的特征。在最近的分類學(xué)研究中，揭示了P.rhodozyma的有性周期(sexual Cycle)并將其遠(yuǎn)距離刺激變性的狀態(tài)命名為Xanthophyllomyces dendrorhous。
然而，P.rhodozyma的天然分離株產(chǎn)生的蝦青素很少(通常為100-300份/百萬(ppm))，使得它們不能作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的實(shí)用型或經(jīng)濟(jì)型色素源。如果Phaffia菌株可以是經(jīng)濟(jì)上可行的飼料添加劑而用于使水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物著色或用于其它任何可能的食物(動(dòng)物或其它)，那么必須研發(fā)過量產(chǎn)生蝦青素的菌株。天然存在的“野生型”Phaffia的突變體已經(jīng)在文獻(xiàn)中有所描述，據(jù)稱其產(chǎn)生的蝦青素水平高于野生型酵母菌。據(jù)報(bào)道這些菌株產(chǎn)生的蝦青素水平在具體的條件高于野生型分離株。
除了需要研發(fā)適合用于類胡蘿卜素的商業(yè)化生產(chǎn)的P.rhodozyma菌株以外，還需要研發(fā)能在大的發(fā)酵罐中最大化類胡蘿卜素生產(chǎn)的P.rhodozyma培養(yǎng)方法。
本發(fā)明提供了通過Phaffia菌株高產(chǎn)量產(chǎn)生蝦青素的方法，包括根據(jù)細(xì)胞生長、碳源消耗和類胡蘿卜素產(chǎn)生、以補(bǔ)料分批的模式應(yīng)用新的營養(yǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)料方法。具體地，通過基于碳源消耗應(yīng)用新的營養(yǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)料方法，可縮短發(fā)酵期并可明顯提高蝦青素產(chǎn)量。
本發(fā)明涉及通過Phaffia菌株高產(chǎn)量產(chǎn)生蝦青素的發(fā)酵方法，所述方法根據(jù)細(xì)胞生長、碳源消耗和類胡蘿卜素產(chǎn)生在補(bǔ)料分批發(fā)酵系統(tǒng)中應(yīng)用新的營養(yǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)料方法。
已知通過P.rhodozyma生產(chǎn)類胡蘿卜素是常見的非生長(non-growth)相關(guān)的模式發(fā)酵(type fermentation)。認(rèn)為在生長期獲得較高的細(xì)胞產(chǎn)量與消耗的碳源之比(Yx/s)，并在生產(chǎn)期獲得較低的Yx/s。本發(fā)明提供了新的補(bǔ)料(feeding)策略，其包括結(jié)合碳源濃度控制的指數(shù)補(bǔ)料方法和基于碳源消耗率的補(bǔ)料方法，以在Yx/s較高的生長期極大提高細(xì)胞生長，并在生產(chǎn)期調(diào)節(jié)細(xì)胞生長并將葡萄糖有效地轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素。
本發(fā)明涉及通過P.rhodozyma菌株利用補(bǔ)料分批發(fā)酵系統(tǒng)高產(chǎn)量產(chǎn)生蝦青素的發(fā)酵方法。具體地，構(gòu)建了基于細(xì)胞生長、碳源消耗和類胡蘿卜素產(chǎn)生的新的補(bǔ)料方法。
Phaffia菌株通過從斜面轉(zhuǎn)移到含有50ml營養(yǎng)培養(yǎng)基的500ml的Erlenmeyer燒瓶進(jìn)行增殖，其中所述細(xì)胞在充分通氣的條件下在20-22℃于震搖下培養(yǎng)3天。將這樣的種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有100ml營養(yǎng)培養(yǎng)基的500ml Erlenmeyer燒瓶中，并在充分通氣的條件下在20-22℃于渦旋震搖器上培養(yǎng)2天。這些細(xì)胞培養(yǎng)物的等分試樣隨后用來接種到培養(yǎng)罐中。
將種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有1.75L營養(yǎng)培養(yǎng)基的5L培養(yǎng)罐中。所述培養(yǎng)物在20-22℃分批生長直到獲得1g/L的酵母干物質(zhì)含量。此后，開始提供糖溶液并在20-22℃進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。
所述營養(yǎng)培養(yǎng)基基本上含有葡萄糖或蔗糖作為碳源以及補(bǔ)充了可同化形式的各種維生素和礦物質(zhì)的氮源。這些維生素和礦物質(zhì)的常見形式為硫酸銨，磷酸鉀，硫酸鎂，硫酸鋅，硫酸鐵銨，硫酸銅，肌醇，鹽酸吡哆醇，硫銨，泛酸鈣，生物素等。包括葡萄糖和酵母提取物在內(nèi)的這些物質(zhì)的組合和濃度可根據(jù)需要改變。如果需要，可將抗泡劑和/或其它添加物摻入培養(yǎng)基或與其一同使用。在補(bǔ)料分批發(fā)酵中加入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基含有多糖如葡萄糖或蔗糖。
所述營養(yǎng)培養(yǎng)基含有聚合物形式的葡萄糖，蔗糖和其它多糖，糖蜜和玉米糖漿，甘油和其它多元醇，羧酸來作為能量源。同時(shí)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基還含有酵母提取物，肉提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浸液(steep liquor)，尿素，氨基酸，硝酸鹽，銨鹽等作為營養(yǎng)源。
含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐經(jīng)高壓滅菌。工作體積不受限，且可以在小規(guī)模到工業(yè)大規(guī)模進(jìn)行發(fā)酵。所述培養(yǎng)基的pH通常保持在4.5-7.0，溫度為15-24℃。所述培養(yǎng)基通常和過濾滅菌后的空氣一同噴出，并被持續(xù)攪拌。所述菌株在NH4OH溶液和/或NaOH溶液控制pH為4.5-7.0的發(fā)酵罐中增殖。溫度可設(shè)定在15-24℃并通過攪拌和氣流控制DO為10％-90％。
1.常見補(bǔ)料方法用于營養(yǎng)培養(yǎng)基的常見補(bǔ)料方法公開于美國專利6,015,684。在生長期，含有葡萄糖或蔗糖的補(bǔ)料培養(yǎng)基被加入主發(fā)酵罐中以使酵母菌細(xì)胞的比生長速率μ達(dá)到0.01-0.10h-1。且所述補(bǔ)料速率逐漸增加以便使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和乙醇不在培養(yǎng)液中累積。獲得所需的酵母固體以后和營養(yǎng)源開始累積以前，將生長期的補(bǔ)料速率降低到最大補(bǔ)料速率的50％。在降低營養(yǎng)物質(zhì)源補(bǔ)料的這一階段，即生產(chǎn)期，所述酵母細(xì)胞繼續(xù)產(chǎn)生蝦青素，但細(xì)胞數(shù)目的增加受限。發(fā)酵通常持續(xù)4-9天，并定期取樣用于分析細(xì)胞生長和蝦青素生產(chǎn)。
可計(jì)算比葡萄糖消耗率(q)和比生長率(μ)。在q和μ的關(guān)系中，μ隨q增加而增加。斜率μ/q表示細(xì)胞產(chǎn)量與消耗的葡萄糖之比，如等式(1)所示。
μ/q＝{(1/X).(dX/dt)}/{(1/X).(dS/dt)}＝dX/dS＝Y(jié)x/s(1)X細(xì)胞濃度(g-干細(xì)胞/L)S碳源濃度(g/L)2.與C/N比相關(guān)的指數(shù)補(bǔ)料方法當(dāng)補(bǔ)料速率在生長期呈線性增長時(shí)，q高于臨界點(diǎn)，如實(shí)施例1所述，且Yx/s為0.200-0.500。另一方面，當(dāng)補(bǔ)料速率在生產(chǎn)期直線降低時(shí)，Yx/s低于0.200。此外，在該階段蝦青素生產(chǎn)增加并獲得最大生產(chǎn)速率。已知通過P.rhodozyma產(chǎn)生蝦青素是常見的非生長相關(guān)的模式發(fā)酵。在生長期獲得較高的Yx/s，在生產(chǎn)期獲得較低的Yx/s。因此，為了在具有較高Yx/s的生長期極大提高細(xì)胞生長，可在生長期采用指數(shù)補(bǔ)料方法。
此外，在生產(chǎn)期為了限制細(xì)胞生長并將葡萄糖有效地轉(zhuǎn)化成蝦青素，可在生產(chǎn)期控制葡萄糖濃度。
當(dāng)在生長期采用指數(shù)補(bǔ)料法時(shí)，μ可設(shè)定為0.01-0.1小時(shí)-1。生長期的補(bǔ)料速率(F)通過以下等式(2)表示F＝(q.Vo.Xo.eμt)/(SF-S) (2)Vo初始體積(L)Xo初始細(xì)胞濃度(g-干細(xì)胞/L)SF補(bǔ)料培養(yǎng)基中的碳源濃度(g/L)S培養(yǎng)液中的碳源濃度(g/L)此外，基于常見的補(bǔ)料分批發(fā)酵法(對(duì)照方法)的結(jié)果的NH4OH加入量和葡萄糖消耗之間的關(guān)系適用于培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度控制。葡萄糖濃度控制的意思是基于NH4OH加入量(用于保持pH)的、用于控制葡萄糖濃度的pH-start法。在生產(chǎn)期，葡萄糖濃度可控制在0-70g/L，優(yōu)選控制在0-10g/L。
例如，通過利用0g/L葡萄糖控制，終蝦青素濃度可高于對(duì)照方法中的終蝦青素濃度。最大蝦青素生產(chǎn)率可以比對(duì)照方法高30.0％以上。如實(shí)施例3所述，當(dāng)使用葡萄糖0g/L控制時(shí)，生產(chǎn)期的C/N比例比葡萄糖2.0g/L控制高1.08倍，這是由于葡萄糖0g/L控制中的NH4OH加入量低于葡萄糖2.0g/L控制中的NH4OH加入量。已知生產(chǎn)期增加補(bǔ)料培養(yǎng)基的C/N比可使蝦青素產(chǎn)量比使用同樣量葡萄糖進(jìn)行批發(fā)酵時(shí)高1.5倍。因此，認(rèn)為利用葡萄糖0g/L控制所得蝦青素產(chǎn)量高于利用葡萄糖2.0g/L控制所得的蝦青素產(chǎn)量。
此外，利用NaOH溶液作為生產(chǎn)期的pH控制試劑是通過利用葡萄糖0g/L控制的指數(shù)補(bǔ)料法生產(chǎn)蝦青素的有效方法，這是由于生產(chǎn)期的C/N比可以提高。通過使用NaOH溶液作為生產(chǎn)期的pH控制試劑來提高生產(chǎn)期的C/N比，平均蝦青素生產(chǎn)率比使用NH4OH溶液時(shí)高10.0％以上。利用葡萄糖0g/L控制、使用NaOH溶液作為pH控制試劑的指數(shù)補(bǔ)料法與對(duì)照方法相比可將總發(fā)酵期縮短26.0％以上。所述利用葡萄糖0g/L控制的指數(shù)補(bǔ)料法與對(duì)照方法相比可使蝦青素平均生產(chǎn)率提高至少13.0％。
3.修飾的指數(shù)補(bǔ)料法為了提高總蝦青素產(chǎn)量并利用指數(shù)補(bǔ)料法較高的蝦青素平均生產(chǎn)率，可通過增加葡萄糖的補(bǔ)料量改進(jìn)所述指數(shù)補(bǔ)料法，并將補(bǔ)料期延長10-50％。這樣延長補(bǔ)料期導(dǎo)致通過增加蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵中的葡萄糖補(bǔ)料量而得到“修飾的指數(shù)補(bǔ)料方法”。
在所述修飾的指數(shù)補(bǔ)料法中，在生長期使用指數(shù)補(bǔ)料法直到發(fā)酵中期。此后，使生產(chǎn)期的補(bǔ)料速率保持在生長期最大補(bǔ)料速率的10-100％。通過利用實(shí)施例5所述的修飾的指數(shù)補(bǔ)料法，其終蝦青素濃度比通過對(duì)照方法所得的濃度高5.8％，且總蝦青素產(chǎn)量比對(duì)照方法所得的蝦青素產(chǎn)量高至少29.0％。所述修飾的指數(shù)補(bǔ)料法可使干細(xì)胞中的蝦青素含量比對(duì)照方法所得的含量提高5.60％以上。
4.培養(yǎng)液中葡萄糖濃度對(duì)蝦青素生產(chǎn)的影響在修飾的指數(shù)補(bǔ)料法中，葡萄糖在發(fā)酵中期累積于培養(yǎng)液中。已知葡萄糖在培養(yǎng)液中累積減少蝦青素生產(chǎn)，尤其是相對(duì)于碳源的蝦青素產(chǎn)量(例如葡萄糖，蔗糖等)。估計(jì)乙醇的形成由Crabtree效應(yīng)誘導(dǎo)并降低蝦青素產(chǎn)量。從最大葡萄糖累計(jì)率和平均比蝦青素生產(chǎn)速率(p)之間的關(guān)系來看，當(dāng)葡萄糖開始在培養(yǎng)液中累積時(shí)，p逐漸降低到無葡萄糖累積期的平均比蝦青素生產(chǎn)速率的71.0％。
葡萄糖在培養(yǎng)液中的累積抑制了每個(gè)單位的細(xì)胞生產(chǎn)蝦青素的能力。因此，為了提高蝦青素產(chǎn)量，需要構(gòu)建新的補(bǔ)料方法以使得沒有葡萄糖累積于發(fā)酵液中。此外，為了盡量多地補(bǔ)充葡萄糖溶液，我們發(fā)現(xiàn)了基于葡萄糖消耗率的、源自指數(shù)補(bǔ)料法的新的補(bǔ)料方法。
5.葡萄糖消耗速率(GCR)補(bǔ)料法GCR補(bǔ)料法基于補(bǔ)料分批發(fā)酵法中的葡萄糖消耗速率(GCR)。實(shí)際總葡萄糖消耗圖譜可源自指數(shù)葡萄糖補(bǔ)料圖譜，例如實(shí)施例7所示。
根據(jù)該補(bǔ)料速率圖譜，可研究GCR補(bǔ)料法的效果。在GCR補(bǔ)料法中，培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度保持在約0g/L。盡管營養(yǎng)培養(yǎng)基的體積相同，GCR補(bǔ)料法的最終總蝦青素產(chǎn)量比使用指數(shù)補(bǔ)料法時(shí)高至少8.0％。GCR補(bǔ)料法的平均蝦青素生產(chǎn)率比指數(shù)補(bǔ)料法高7.0％以上。
這些結(jié)果顯示，GCR補(bǔ)料法比指數(shù)補(bǔ)料法更有效地提高蝦青素生產(chǎn)。在GCR補(bǔ)料法中，葡萄糖的補(bǔ)料量可增加并且補(bǔ)料期可延長。
6.最大(Max)GCR補(bǔ)料法此外，為了提高葡萄糖補(bǔ)料量并不使葡萄糖在發(fā)酵中累積，可通過研究補(bǔ)料圖譜的影響構(gòu)建基于最大葡萄糖消耗速率的新GCR補(bǔ)料法(最大GCR補(bǔ)料法)，所述圖譜結(jié)合了GCR補(bǔ)料和以生產(chǎn)期中GCR補(bǔ)料法的最大補(bǔ)料速率進(jìn)行的恒速補(bǔ)料。
葡萄糖在培養(yǎng)液中的累積影響蝦青素產(chǎn)量，所述產(chǎn)量相對(duì)于使用的葡萄糖而言低于使用對(duì)照方法時(shí)的產(chǎn)量。如果采用新的GCR補(bǔ)料法以避免葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)液中的累積，認(rèn)為可明顯提高蝦青素產(chǎn)量。為了研究最大GCR補(bǔ)料法，計(jì)算了基于結(jié)合了GCR補(bǔ)料和恒速補(bǔ)料的、如實(shí)施例8中所述的補(bǔ)料法的葡萄糖消耗速率以及基于葡萄糖消耗速率的補(bǔ)料速率圖譜。在實(shí)施例9中，最大葡萄糖補(bǔ)料速率圖譜通過結(jié)合GCR補(bǔ)料和恒速補(bǔ)料的實(shí)施例8所示的補(bǔ)料法計(jì)算。
最大葡萄糖補(bǔ)料速率圖譜可根據(jù)各種營養(yǎng)培養(yǎng)基或發(fā)酵條件的組合變化。首先，可根據(jù)最大葡萄糖補(bǔ)料速率圖譜采用利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法。最大GCR補(bǔ)料法的總蝦青素產(chǎn)量比對(duì)照方法的產(chǎn)量提高了至少4.0％。所得最大蝦青素生產(chǎn)速率比利用對(duì)照方法時(shí)高20％以上。
然而，該方法有時(shí)使葡萄糖在培養(yǎng)液中累積。因此，為避免葡萄糖在培養(yǎng)液中的累積，可采用僅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法。通過利用該方法，葡萄糖在培養(yǎng)液中的濃度可在整個(gè)發(fā)酵期中保持為0g/L。這種方法的終蝦青素產(chǎn)量可比對(duì)照方法高12％以上。
利用這種最大GCR補(bǔ)料法，蝦青素產(chǎn)量與所用葡萄糖的比例比對(duì)照方法增加了至少4.0％。所得平均蝦青素生產(chǎn)速率可比對(duì)照方法高至少21％以上。此外，僅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法可縮短發(fā)酵期(相對(duì)于對(duì)照方法發(fā)酵期至少縮短11％)并增加蝦青素產(chǎn)率。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例說明實(shí)施例1用于蝦青素生產(chǎn)的P.rhodozymaATCC96594突變菌株的常見培養(yǎng)1.種子培養(yǎng)物制備用P.rhodozyma ATCC96594突變菌株作為種子菌株。Phaffia菌株通過從斜面轉(zhuǎn)移到含有50ml YM培養(yǎng)基的500mlErlenmeyer燒瓶中增殖，其中細(xì)胞在充分通氣的條件下在震搖下于20-22℃培養(yǎng)3天。將該種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有100mlYM培養(yǎng)基的500mlErlenmeyer燒瓶中，并在渦旋搖床上在充分通氣的條件下于20-22℃保溫2天。
2.用于蝦青素生產(chǎn)的補(bǔ)料分批發(fā)酵法將200ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有1.75L營養(yǎng)培養(yǎng)基的5L的發(fā)酵罐中。使培養(yǎng)基在20-22℃批生長直到獲得1g/L的酵母干物質(zhì)含量。隨后，開始提供糖溶液并在20-22℃進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵法。
所述營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下20g/L的糖蜜，0.6g/L的硫酸二銨，0.8g/L的磷酸氫二銨和0.125g/L硫酸鎂，將它們和適量的水(5L增殖發(fā)酵罐中含1.75L水)一起在發(fā)酵罐中煮沸30分鐘。在補(bǔ)料分批發(fā)酵中補(bǔ)充到培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)基含有716.0g/L的葡萄糖或蔗糖。所有化學(xué)物質(zhì)都是食物級(jí)的。所述糖蜜是來自Midwest agriculture，US的甜菜糖(beet sugar)糖蜜。
在總體積為5L并具有頂部驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和溫度、pH、DO(溶解的氧)以及消耗氣體監(jiān)測器的D型發(fā)酵罐(Able，Tokyo，Japan)中進(jìn)行發(fā)酵。初始工作體積和補(bǔ)料體積分別為1.75L和2.0L。所述菌株在發(fā)酵罐中在pH 5.5的條件下進(jìn)行增殖，其中pH通過12.5w/v％NH4OH溶液和NaOH溶液來控制。溫度控制在20-22℃且DO通過攪拌和通氣控制在10％-90％飽和。在生長期，含有葡萄糖或蔗糖的補(bǔ)料培養(yǎng)基被加入主發(fā)酵罐中，以使酵母細(xì)胞的比生長率μ達(dá)到0.04-0.05h-1。逐漸增加補(bǔ)料速率以避免營養(yǎng)物質(zhì)和乙醇在培養(yǎng)液中累積。
獲得所需的酵母固體以后、營養(yǎng)源累積以前，將生長期補(bǔ)料速率降到最大補(bǔ)料速率的50％。在減少營養(yǎng)源補(bǔ)料期間，即生長期，酵母細(xì)胞繼續(xù)產(chǎn)生蝦青素，但細(xì)胞數(shù)目的增長被限制。例如，在生長期，補(bǔ)料速率直線降低到最大補(bǔ)料速率的約50％并持續(xù)約100小時(shí)。
實(shí)施例2細(xì)胞生長期和蝦青素生產(chǎn)期的補(bǔ)料策略在實(shí)施例1所述的常見蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵法中，可計(jì)算比葡萄糖消耗速率(q)和比生長速率(H)并通過圖顯示。當(dāng)q和μ分別為0.085小時(shí)-1和0.017小時(shí)-1時(shí)，圖線的斜率劇烈改變，且臨界點(diǎn)(q，H)＝(0.085，0.017)。斜率μ/q細(xì)胞產(chǎn)量與消耗的葡萄糖之比(Yx/s)，如上述等式(1)所示。
當(dāng)生長期補(bǔ)料速率直線上升時(shí)，μ高于0.085小時(shí)-1，且Yx/s為0.213-0.405。另一方面，當(dāng)補(bǔ)料速率在生產(chǎn)期直線下降時(shí)，Yx/s低于0.201。此外，在此期間蝦青素產(chǎn)量增加并達(dá)到最大生產(chǎn)速率。已知通過P.rhodozyma生產(chǎn)蝦青素是常見的非-生長相關(guān)的模式發(fā)酵。
在生長期獲得較高的Yx/s，在生產(chǎn)期獲得較低的Yx/s。因此，為在具有較高Yx/s的生長期極大提高細(xì)胞生長，并在生產(chǎn)期限制細(xì)胞生長和有效將葡萄糖轉(zhuǎn)化為蝦青素，將生長期指數(shù)補(bǔ)料法和生產(chǎn)期葡萄糖濃度控制用作蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵法的補(bǔ)料策略。
實(shí)施例3與C/N比對(duì)蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響有關(guān)的指數(shù)補(bǔ)料法當(dāng)在生長期采用指數(shù)補(bǔ)料時(shí)，μ設(shè)定在0.04小時(shí)-1。補(bǔ)料速率(F)在生長期通過上述等式(2)表示。
在本研究中，q，Vo，Xo，SF和S分別設(shè)定為0.08262小時(shí)-1，1.75L，9.92g-干細(xì)胞/L，716.0g/L和0g/L。因此，生長期的F根據(jù)以下等式(3)計(jì)算，F(xiàn)＝(0.08262.1.75.9.92.e004t)/(716.0-0)＝0.002003.e004t(3)此外，根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果研究NH4OH加入量和葡萄糖消耗量之間的關(guān)系。獲得了NH4OH加入量和葡萄糖消耗量之間兩種線性關(guān)系(I和II)，且發(fā)酵開始后80小時(shí)引入臨界點(diǎn)(NH4OH加入量，葡萄糖消耗量)＝(3.95，13.1)。在生長期，圖線的斜率較陡(I)，在生產(chǎn)期，斜率較溫和(II)。因此為了在生產(chǎn)期將葡萄糖控制為0g/L，采用來自斜率II的NH4OH加入量(用于保持pH)的培養(yǎng)基補(bǔ)料法，即用于控制葡萄糖濃度的pH-自動(dòng)調(diào)節(jié)法。通過如實(shí)施例1的方式在5L的發(fā)酵罐中將生產(chǎn)期的葡萄糖濃度控制在0和2.0g/L。此外，葡萄糖2.0g/L控制由即時(shí)葡萄糖控制器(the on-line biochemical℃ontroller BF-410Able，Tokyo，Japan)操作以便探索從發(fā)酵開始后C/N比對(duì)蝦青素生產(chǎn)的影響。
將這兩個(gè)條件與實(shí)施例1中所述的常見補(bǔ)料法(對(duì)照方法)比較。三個(gè)條件之間發(fā)酵活性的比較顯示于表1中。葡萄糖0g/L控制中的終蝦青素濃度比對(duì)照法高6.60％。葡萄糖2.0g/L控制中的終蝦青素濃度比對(duì)照方法中的低13.5％。
葡萄糖0g/L控制的最大蝦青素生產(chǎn)速率比對(duì)照方法的高32.9％。
當(dāng)使用葡萄糖0g/L控制時(shí)，生產(chǎn)期的C/N比例比利用葡萄糖2.0g/L控制時(shí)高1.08倍，這是由于葡萄糖0g/L控制中的NH4OH加入量小于葡萄糖2.0g/L控制的NH4OH加入量。通過增加生產(chǎn)期補(bǔ)料培養(yǎng)基的C/N比，利用葡萄糖0g/L控制產(chǎn)生的蝦青素多于利用葡萄糖2.0g/L控制產(chǎn)生的蝦青素。
表1利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵法的發(fā)酵活性
ASTA蝦青素；數(shù)據(jù)用相對(duì)值表示實(shí)施例4用于蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵的新的指數(shù)補(bǔ)料法和葡萄糖濃度控制此外，C/N比對(duì)具有葡萄糖0g/L控制的指數(shù)補(bǔ)料法的影響通過利用NaOH溶液作為pH控制試劑在5L的發(fā)酵罐中研究。以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行發(fā)酵。對(duì)于指數(shù)補(bǔ)料法，葡萄糖0g/L控制在生產(chǎn)期通過補(bǔ)料法進(jìn)行，其中補(bǔ)料速率呈直線從22.61下降到17.63g-補(bǔ)料溶液/小時(shí)。通過在生產(chǎn)期使用NaOH溶液控制pH以降低生產(chǎn)期的C/N比，平均蝦青素產(chǎn)率比使用NH4OH溶液時(shí)高13.5％。
表2顯示實(shí)施例1中所述常見補(bǔ)料法(對(duì)照方法)與指數(shù)補(bǔ)料法之間的比較，后者在以補(bǔ)料分批模式進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)時(shí)通過使用NaOH溶液控制生產(chǎn)期pH。指數(shù)補(bǔ)料法中的總發(fā)酵期比對(duì)照方法短41小時(shí)。發(fā)酵開始后175小時(shí)，通過指數(shù)補(bǔ)料法所得的蝦青素濃度比對(duì)照方法所得的蝦青素濃度高5.7％。指數(shù)補(bǔ)料法中蝦青素平均生產(chǎn)率比對(duì)照方法中高13.9％。
表2在以補(bǔ)料分批模式進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)時(shí)通過使用NaOH溶液控制生產(chǎn)期pH的指數(shù)補(bǔ)料法
ASTA蝦青素；所示數(shù)據(jù)為相對(duì)值實(shí)施例5用于蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵的修飾的指數(shù)補(bǔ)料法為增加總蝦青素產(chǎn)量并利用指數(shù)補(bǔ)料法較高的蝦青素平均生產(chǎn)率，通過增加葡萄糖補(bǔ)料量并將補(bǔ)料期從117個(gè)小時(shí)延長到156個(gè)小時(shí)來改進(jìn)指數(shù)補(bǔ)料法。研究了這種通過在蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵中增加葡萄糖補(bǔ)料量來延長補(bǔ)料期的方法即“修飾的指數(shù)補(bǔ)料法”的效果。在所述修飾的指數(shù)補(bǔ)料法中，生產(chǎn)期的補(bǔ)料速率從發(fā)酵開始直到第186.5小時(shí)(從發(fā)酵補(bǔ)料開始第156小時(shí))一直保持在19.7g/hr。
表3顯示了實(shí)施例1中所述的常見補(bǔ)料法(對(duì)照方法)和修飾的指數(shù)補(bǔ)料法之間的比較。
修飾的指數(shù)補(bǔ)料法所得的終蝦青素濃度比對(duì)照方法所得的終蝦青素濃度高5.8％。通過修飾的指數(shù)補(bǔ)料法所得的總蝦青素產(chǎn)量比對(duì)照方法高29.3％。盡管利用修飾的指數(shù)補(bǔ)料法時(shí)葡萄糖在第98-192小時(shí)在培養(yǎng)液中累積，補(bǔ)充的葡萄糖在發(fā)酵終點(diǎn)都被完全消耗。修飾的指數(shù)補(bǔ)料法中干細(xì)胞中的蝦青素含量比對(duì)照方法中的高5.60％。
表3修飾的指數(shù)補(bǔ)料法對(duì)以補(bǔ)料分批模式進(jìn)行的蝦青素生產(chǎn)的影響
ASTA蝦青素；所示數(shù)據(jù)為相對(duì)值實(shí)施例6培養(yǎng)液中的葡萄糖濃對(duì)蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響如實(shí)施例5中所述，通過利用指數(shù)補(bǔ)料法使葡萄糖在培養(yǎng)液中累積?？偽r青素生產(chǎn)和產(chǎn)量低于通過實(shí)施例1中所述對(duì)照方法進(jìn)行的生產(chǎn)。由于Crabtree效應(yīng)可誘導(dǎo)乙醇，蝦青素產(chǎn)量降低。因此，研究了最大葡萄糖累積速率和平均比蝦青素生產(chǎn)速率(p)之間的關(guān)系。
當(dāng)葡萄糖開始在培養(yǎng)液中累積時(shí)，p逐漸降低到?jīng)]有葡萄糖累積時(shí)的平均比蝦青素生產(chǎn)速率的71.0％。這些結(jié)果顯示葡萄糖在培養(yǎng)液中的累積抑制了單位量細(xì)胞產(chǎn)生蝦青素的能力。估計(jì)Crabtree效應(yīng)誘導(dǎo)乙醇形成且蝦青素產(chǎn)量降低。
實(shí)施例7通過基于葡萄糖消耗速率(GCR補(bǔ)料法)的新補(bǔ)料法進(jìn)行蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵為增加蝦青素產(chǎn)量，需要構(gòu)建新的補(bǔ)料法以避免葡萄糖在培養(yǎng)液中累積。此外，為了盡量多地補(bǔ)充葡萄糖溶液，我們研究了源自指數(shù)補(bǔ)料法的、基于葡萄糖消耗速率的補(bǔ)料法。
實(shí)際總葡萄糖消耗圖譜與指數(shù)葡萄糖補(bǔ)料圖譜不同。根據(jù)這一結(jié)果，計(jì)算實(shí)際葡萄糖消耗速率圖譜。
通過多次回歸分析將實(shí)際葡萄糖消耗速率圖譜表示為三次方程。從葡萄糖消耗速率圖譜來看，實(shí)際補(bǔ)料速率圖譜顯示建立了基于葡萄糖消耗的葡萄糖補(bǔ)料模式。
基于該補(bǔ)料速率圖譜，研究了GCR補(bǔ)料法的效果。表4顯示了指數(shù)補(bǔ)料法和GCR補(bǔ)料法之間的比較。在GCR補(bǔ)料法中，培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度保持在約0g/L。盡管起始體積均為1.75L且補(bǔ)料體積均為2.00L，通過GCR補(bǔ)料法得到的最終總蝦青素產(chǎn)量比使用指數(shù)補(bǔ)料法高8.99％。此外，GCR補(bǔ)料法的發(fā)酵期可設(shè)定為168小時(shí)，這于指數(shù)補(bǔ)料法的時(shí)間相同。GCR補(bǔ)料法的平均蝦青素生產(chǎn)率比利用指數(shù)補(bǔ)料法時(shí)高7.60％。
表4修飾的指數(shù)補(bǔ)料法對(duì)以補(bǔ)料分批模式進(jìn)行的蝦青素生產(chǎn)的影響
ASTA蝦青素；所示數(shù)據(jù)為相對(duì)值實(shí)施例8通過修飾的GCR補(bǔ)料法在蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵中提高葡萄糖補(bǔ)料量在GCR補(bǔ)料法中，葡萄糖補(bǔ)料量增加且補(bǔ)料時(shí)間延長到156小時(shí)。表5顯示修飾的GCR補(bǔ)料法對(duì)通過補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)的影響。
修飾的GCR補(bǔ)料法是這樣一種方法，其結(jié)合GCR補(bǔ)料法并保持到葡萄糖補(bǔ)料開始后111小時(shí)且在111小時(shí)后相對(duì)于對(duì)照方法如實(shí)施例1所述呈線性降低的補(bǔ)料法。通過修飾的GCR補(bǔ)料法的最終總蝦青素生產(chǎn)比對(duì)照方法高5.5％。此外，可在葡萄糖補(bǔ)料開始到第66小時(shí)之間采用結(jié)合GCR補(bǔ)料和保持GCR補(bǔ)料法中最大補(bǔ)料速率(所述最大速率在葡萄糖補(bǔ)料開始后第66小時(shí)達(dá)到)的恒速補(bǔ)料的補(bǔ)料圖譜，即GCR補(bǔ)料法，且可在第66-156小時(shí)之間采用保持在GCR補(bǔ)料法最大補(bǔ)料速率即30.4g-補(bǔ)充溶液/小時(shí)的恒速補(bǔ)料。
表5還顯示了結(jié)合GCR補(bǔ)料和恒速補(bǔ)料的補(bǔ)料法的效果。通過這種補(bǔ)料法產(chǎn)生的最終總蝦青素產(chǎn)量比利用對(duì)照法時(shí)高19.8％，且比修飾的GCR補(bǔ)料法時(shí)高14％。
表5修飾的GCR補(bǔ)料法對(duì)通過補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)的影響
ASTA蝦青素；所示數(shù)據(jù)為相對(duì)值實(shí)施例9通過最大GCR補(bǔ)料法進(jìn)行蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵在實(shí)施例8中從第120小時(shí)起葡萄糖開始在培養(yǎng)液中累積，且葡萄糖濃度在發(fā)酵開始后第192小時(shí)達(dá)到81.7g/L。最后，葡萄糖濃度在發(fā)酵終點(diǎn)為33.6g/L。培養(yǎng)液中的葡萄糖累積影響蝦青素產(chǎn)量。因此，構(gòu)建了基于最大葡萄糖消耗速率的新GCR補(bǔ)料法(最大GCR補(bǔ)料法)。為研究最大GCR補(bǔ)料法，計(jì)算了基于實(shí)施例8中所述的、結(jié)合GCR補(bǔ)料和恒速補(bǔ)料的補(bǔ)料法的葡萄糖消耗速率以及基于葡萄糖消耗速率的補(bǔ)料速率圖譜。
通過實(shí)施例8中所述結(jié)合GCR補(bǔ)料和恒速補(bǔ)料的補(bǔ)料法計(jì)算最大葡萄糖補(bǔ)料速率圖譜。
通過實(shí)際葡萄糖消耗速率計(jì)算的最大補(bǔ)料速率在葡萄糖補(bǔ)料開始后66小時(shí)為28.7g/hr。66小時(shí)后，由于葡萄糖消耗速率降低，所述補(bǔ)料速率設(shè)定為低于19.0g/hr以便保持葡萄糖濃度為約0g/L。因此，根據(jù)最大葡萄糖補(bǔ)料速率圖譜，采用利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法。初始體積和補(bǔ)料體積分別設(shè)定為1.50L和2.25L。
表6顯示利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法對(duì)通過補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)的影響。發(fā)酵開始后第216小時(shí)，最大GCR補(bǔ)料法所得總蝦青素產(chǎn)量比對(duì)照法高4.21％。
此外，在最大GCR補(bǔ)料法中，計(jì)算出的第95-122小時(shí)的蝦青素生產(chǎn)速率比對(duì)照方法的速率高20.1％。然而，利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法時(shí)培養(yǎng)液中的葡萄糖在發(fā)酵開始175小時(shí)后累積達(dá)19.9g/L。
利用最大GCR補(bǔ)料法時(shí)相對(duì)于所用葡萄糖的蝦青素生產(chǎn)產(chǎn)量低于利用對(duì)照方法的所述產(chǎn)量，這是由于葡萄糖累積于培養(yǎng)液中。
隨后，為了避免在培養(yǎng)液中累積葡萄糖，建立了利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法。
表7顯示僅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法對(duì)通過補(bǔ)料分批發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素的影響。在表7中，利用NH4OH溶液的最大GCR補(bǔ)料法可在整個(gè)發(fā)酵期將培養(yǎng)液中葡萄糖濃度保持在0g/L。發(fā)酵開始216后，通過這種方法產(chǎn)生的總蝦青素產(chǎn)量比利用對(duì)照方法高12.1％。
利用所述最大GCR補(bǔ)料法時(shí)相對(duì)于所用葡萄糖的蝦青素生產(chǎn)產(chǎn)量比用對(duì)照方法時(shí)高4.7％。在該最大GCR補(bǔ)料法中，平均蝦青素生產(chǎn)速率比對(duì)照方法的速率高21.9％。從總蝦青素生產(chǎn)圖譜來看，在生長期和蝦青素生產(chǎn)期均僅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法可將發(fā)酵期縮短(與對(duì)照方法相比發(fā)酵期縮短11.2％)并提高蝦青素生產(chǎn)率。
表6利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法對(duì)以補(bǔ)料分批模式進(jìn)行的蝦青素生產(chǎn)的影響
ASTA蝦青素；所示數(shù)據(jù)為相對(duì)值表7利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR補(bǔ)料法對(duì)以補(bǔ)料分批模式進(jìn)行的蝦青素生產(chǎn)的影響
ASTA蝦青素；所示數(shù)據(jù)為相對(duì)值
權(quán)利要求
1.利用Phaffia rhodozyma的蝦青素發(fā)酵法，包括以下步驟(a)在生長期，根據(jù)Phaffia rhodozyma細(xì)胞的比生長速率(μ)加入含有葡萄糖或蔗糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基，和(b)在蝦青素生產(chǎn)期，根據(jù)蝦青素生產(chǎn)速率補(bǔ)充營養(yǎng)培養(yǎng)基，同時(shí)在整個(gè)發(fā)酵期中保持發(fā)酵培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度為接近0g/L。
2.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述發(fā)酵在μ為0.01-0.10h-1的范圍進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中pH控制試劑為NH4OH溶液和/或NaOH溶液。
4.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述發(fā)酵在4.5-7.0的pH進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述發(fā)酵在15-24℃的溫度進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述發(fā)酵在10-90％的DO進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含聚合物形式的葡萄糖、蔗糖和其它多糖、糖蜜和玉米糖漿、甘油和其它多元醇、以及羧酸作為能量源，并包含酵母提取物、肉提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浸液、尿素、氨基酸、硝酸鹽、銨鹽等作為氮源。
8.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中D-葡萄糖或蔗糖的濃度為約10g/L-約800g/L。
9.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述發(fā)酵在通氣率為約0.01-約2.0氣體體積/培養(yǎng)基體積/分的條件下在培養(yǎng)容器中進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1的發(fā)酵法，其中所述Phaffia rhodozyma是Phaffiarhodozyma ATCC96594。
全文摘要
公開了利用Phaffia rhodozyma的蝦青素發(fā)酵法，包括以下步驟(a)在生長期，根據(jù)Phaffia rhodozyma細(xì)胞的比生長速率(μ)加入含有葡萄糖或蔗糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基，和(b)在蝦青素生產(chǎn)期，根據(jù)蝦青素生產(chǎn)速率補(bǔ)充營養(yǎng)培養(yǎng)基，同時(shí)在整個(gè)發(fā)酵期中保持發(fā)酵培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度為接近0g/L。
文檔編號(hào)C12P23/00GK1692159SQ03823013
公開日2005年11月2日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者星野達(dá)雄, 瀨戶口豐, 高木良智 申請人:Dsm Ip資產(chǎn)公司