一種鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的微衛(wèi)星標(biāo)記與特異性引物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖中群體鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種鑒定鰱與鳙的微衛(wèi)星標(biāo)記與特異性引物及其在鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體鑒定中的應(yīng)用。即提供18個鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星位點，其核苷酸序列為SEQIDNO：1-18中的任一個，本發(fā)明還提供針對上述微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物，PCR擴增結(jié)果具有種間特異性，能夠準(zhǔn)確、有效地對鰱、鳙及其雜交和遺傳漸滲個體進行鑒定，并可用來對自然水域和繁殖場親本群體基因庫純度進行實時監(jiān)測。本發(fā)明還公開了用于上述鰱、鳙及其雜交和遺傳漸滲個體進行鑒定的試劑盒。本發(fā)明的鑒定方法具有準(zhǔn)確度高、分辨率高和速度快的優(yōu)勢。
【專利說明】一種鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的微衛(wèi)星標(biāo)記與特異I生引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖中群體鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種鑒定鰱與鳙的微衛(wèi)星標(biāo)記與特異性引物及其在鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體鑒定中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]微衛(wèi)星(microsatellites)或稱簡單序列重復(fù)(simplesequence repeats, SSR)是指由I~6個核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復(fù)DNA序列。迄今研究過的所有生物種類中都發(fā)現(xiàn)了它的存在，并且分布密度很大。由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于PCR擴增等特點，已成為近年來最引人注目的新型DNA標(biāo)記，并廣泛應(yīng)用于生物資源的家系譜系認(rèn)證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。
[0003]鰱、鳙在我國已有上千年的養(yǎng)殖歷史，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，由于這兩種魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)量高、成本低、病害少、管理簡單，它們已被引入多個國家和地區(qū)作為人類食物來源或調(diào)控水體水質(zhì)。然而，由于國外環(huán)境與它們原產(chǎn)地的棲息環(huán)境有差異，鰱、鳙間雜交和遺傳漸滲在很多國家和地區(qū)都有報道(Kolar CS et al.Asian Carps ofthe Genus Hypophthalmichthys(Pisces, Cyprinidae) - A Biological Synopsis andEnvironmental Risk Assessment.2005, Report to IL S.Fish and Wildlife Service perInteragency Agreement94400-3_0128 ；Tatrai I et al.Studies on the biologicalrole and effects of Asian carps in Lake Balaton.A Balaton kutatasanak, 2006, evieredmenyei Magyar Tu domanyos Akademia Budapest ISSN1419 — 1075 ；VeriginBV et al.A case of natural hybridization between Hypophthalmichthysmolitrix and Aristichthys nobilis(Pisces, Cyprinidae).ZoologicheskiiZhurnal, 1979，58:190 - 196.)。此外，在我國也曾發(fā)現(xiàn)有鰱、鳙雜交個體，但僅限于人工繁殖場內(nèi)(龔珞軍等.叼汊湖養(yǎng)殖場出現(xiàn)鳙鰱雜交現(xiàn)象.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991,12:41.)。
[0004]鰱、鳙雜交個體生長速度均比鰱、鳙慢，其它方面也沒有顯示優(yōu)勢(龔珞軍等.叼汊湖養(yǎng)殖場出現(xiàn)鳙鰱雜交現(xiàn)象.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991,12:41.)。因此，鰱、鳙之間的雜交和遺傳漸滲勢必會導(dǎo)致這兩者經(jīng)濟性狀的退化，這對我國“四大家魚”的養(yǎng)殖業(yè)來說是一個巨大的潛在威脅。因此必須采取行之有效的方法來鑒定鰱、鳙雜交及遺傳漸滲個體，并將這些個體清除，以保持我國鰱、鳙優(yōu)良的基因庫。然而，僅僅依靠形態(tài)學(xué)方法并不能準(zhǔn)確判斷鰱、鳙純種個體及其雜交和遺傳漸滲個體，因為很多鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體并不表現(xiàn)出這二者的中間性狀，而是表現(xiàn)出傾向于這二者之一的表型，多代遺傳漸滲的個體有可能在形態(tài)特征上難以準(zhǔn)確鑒定。因此，需要建立一種快速、準(zhǔn)確的方法，對鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體進行有效鑒定。Mia等曾采用3個鰱、鳙間無共有等位基因的微衛(wèi)星標(biāo)記來檢測孟加拉國養(yǎng)殖場中的雜交個體(Mia MY, et al.Detection of hybridizationbetween Chinese carp species(Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthysnobilis)in hatchery broodstock in Bangladesh, using DNA microsatellite loc1.Aquaculture, 2005, 247:267 - 273.)。然而，該方法存在不足之處，因為僅憑3個位點很難準(zhǔn)確判斷待測個體屬于種間雜交還是遺傳漸滲個體，甚至無法確定純種鰱、鳙，需要多個標(biāo)記位點組合加以分析，才能有效區(qū)別，標(biāo)記位點檢測得越多，識別就會越準(zhǔn)確。因此本發(fā)明開發(fā)了 18個鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星標(biāo)記，通過這些位點的綜合分析，可以更加精確地鑒別鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種鑒定鰱與鳙的微衛(wèi)星標(biāo)記與特異性引物，即提供18個對鰱、鳙物種特異性的微衛(wèi)星標(biāo)記以及相應(yīng)的多態(tài)性引物，為鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體提供有效的工具。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]本發(fā)明一方面提供對鰱、鳙物種特異性的微衛(wèi)星標(biāo)記，其核酸序列為SEQIDNO:1-18中的任一個。
[0008]本發(fā)明另一方面還提供針對上述18個微衛(wèi)星標(biāo)記設(shè)計的引物對，其序列為SEQ IDNO: 19-54。
[0009]本發(fā)明的微衛(wèi)星引物對用于鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的檢測方法，包括如下步驟:
[0010]I)基因組DNA的提取:提取目標(biāo)個體基因組DNA ；
[0011]2)微衛(wèi)星PCR擴增:采用本發(fā)明設(shè)計的引物，目標(biāo)個體基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得目標(biāo)個體微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物；
[0012]3)電泳檢測擴增產(chǎn)物:采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及溴化乙錠染色法檢測微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物；
[0013]4)基因型分析:根據(jù)每個個體微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，若某一個體在所有18個微衛(wèi)星位點均表現(xiàn)為鰱等位基因，則該個體為純種鰱；若某一個體在所有18個位點均表現(xiàn)為鳙等位基因，則該個體為純種鳙；若某一個體在所有18個位點均同時顯現(xiàn)鰱、鳙等位基因，則該個體為鰱、
[0014]鳙雜交個體；若某一個體在18個位點中的至少I個位點同時顯現(xiàn)鰱、鳙等
[0015]位基因,則該個體為鰱、鳙遺傳漸滲個體。
[0016]對上述技術(shù)方案的改進:提取目標(biāo)個體基因組DNA，將其稀釋為20_50ng/yL，每個PCR反應(yīng)中加入I μ L，反應(yīng)總體積為12.5 μ L。
[0017]對上述技術(shù)方案的進一步改進:所述PCR擴增的加樣參數(shù)為:每個PCR反應(yīng)體系總體積 12.5μ L，包含 20-50ng 的模板DNA，0.4U Taq DNA聚合酶，1.25 μ LlO X PCR Buffer,0.4yL dNTP(2.5mM)，0.4yL正反向混合引物(各2.5μΜ)，最后加適量滅菌超純水至12.5 μ L ;使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為:94°C預(yù)變性5分鐘，(94°C變性35秒、50~60°C退火35秒、72°C延伸40秒)35個循環(huán)；最后72°C終延伸8分鐘，PCR產(chǎn)物于4°C保存。
[0018]對上述技術(shù)方案的 進一步改進:將PCR產(chǎn)物在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，30W恒功率電泳2h進行分離；將膠板通過1%的溴化乙錠(EB)溶液顯色5-10分鐘，即可得到目標(biāo)個體在18個基因座位的基因分型。
[0019]本發(fā)明還提供了上述對鰱、鳙及其雜交和遺傳漸滲個體進行鑒定的試劑盒，該試劑盒包含上述用于鰱、鳙及其雜交和遺傳漸滲個體進行鑒定的微衛(wèi)星引物。根據(jù)實際情況，所述的試劑盒進一步包含Taq DNA聚合酶、10XPCR Buffer、dNTPs、滅菌超純水、MgCl2。
[0020]當(dāng)引物的合成、基因組DNA的提取、dNTPs和Taq DNA聚合酶試劑來自不同批次時，PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度等都會發(fā)生一定的變化。所以每次進行大批量PCR前，都要選擇少量個體進行溫度梯度、引物濃度梯度PCR，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增效果，以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。此外，確定好單個標(biāo)記引物PCR的退火溫度(Tm)之后，可以根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小，適當(dāng)對部分引物進行組合，再摸索多重PCR反應(yīng)的條件。由于所用到的引物對應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物片段不超過300bp，所以循環(huán)中的延伸時間均控制在45秒左右。
[0021]應(yīng)用上述引物和檢測技術(shù)可以高效鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體，可對鰱、鳙自然群體和繁殖親本的基因庫純度進行實時監(jiān)測，并可取代在其他物種中一直沿用的同工酶及多態(tài)微衛(wèi)星位點等進行雜交和遺傳漸滲的檢測方法。
[0022]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
[0023]1.操作簡單，判斷準(zhǔn)確；
[0024]2.檢測速度快，由于等位基因數(shù)目少、易區(qū)分，無需進行復(fù)雜計算即可作出判斷；
[0025]3.分辨率高。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的方法開發(fā)出相應(yīng)的檢測試劑盒，用于鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體鑒定，本試劑盒具有使用方法簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，不需要特殊的儀器，適合常規(guī)實驗室檢測的需要，且檢測結(jié)果可靠、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，為高效鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體提供便利。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為純種鰱個體(左側(cè))和純種鳙(右側(cè))個體在3個鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星位點的聚丙烯酰胺電泳帶型圖。
[0028]圖2為鰱、鳙人工雜交家系個體在2個鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星位點的聚丙烯酰胺電泳帶型圖(第I泳道為DNA Marker,第2、3泳道分別為鰱、鳙親本。)。圖3為一個遺傳漸滲個體和一個雜交個體在隨機選取的10個鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星位點的聚丙烯酰胺電泳帶型圖(圖A為遺傳漸滲個體，圖B為雜交個體，兩側(cè)為PBR322DNA Marker。)。
[0029]圖4為根據(jù)18個鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星標(biāo)記對形態(tài)學(xué)上判斷的鰱、鳙及其雜交個體鑒定結(jié)果的柱形圖(圖中白色代表鳙特有的等位基因，黑色代表鰱特有等位基因，每條豎線代表一個個體，豎線全為同一種顏色表示該個體為純種鰱或鳙；若某一個體白色和黑色長度相等，則該個體為雜交個體，若長度不等則為遺傳漸滲個體。)。
[0030]圖5為根據(jù)8個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記對形態(tài)學(xué)上判斷的鰱、鳙及其雜交個體鑒定結(jié)果的柱形圖(圖中白色代表能夠在鳙中檢測到的等位基因，黑色代表能夠在鰱中檢測到的等位基因，每條豎線代表一個個體。)?！揪唧w實施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)，或按照制造廠商所建議的條件。
[0032]【實施例1】微衛(wèi)星位點的篩選
[0033]本發(fā)明中的18個鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星標(biāo)記是通過三次嚴(yán)格篩選所獲得。本實驗室先前的研究中已通過磁珠富集法構(gòu)建了鰱、鳙微衛(wèi)星富集文庫，并通過克隆測序獲得了含微衛(wèi)星重復(fù)的序列。從含有微衛(wèi)星的序列中，選取核心重復(fù)5次以上并符合引物設(shè)計要求的序列，采用Primer Premier5.0進行引物設(shè)計。主要參數(shù)設(shè)置為:引物長度20_25bp,PCR產(chǎn)物片段長度范圍120-350bp，最適退火溫度50_60°C。GC含量一般在40%_60%之間，盡量避免二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。最終成功獲得了 227個可穩(wěn)定擴增的鰱、鳙微衛(wèi)星標(biāo)記。
[0034]將這227個微衛(wèi)星標(biāo)記在鰱、鳙各5個來自不同群體的個體中進行擴增，如果某一微衛(wèi)星標(biāo)記在鰱、鳙間無共有等位基因，則將該位點保留用于下一輪篩選，若有共有等位基因則直接淘汰。通過第一輪篩選后，再將篩選出的微衛(wèi)星標(biāo)記在14個鰱群體和15個鳙群體各8個個體中進行檢測，如果某一微衛(wèi)星標(biāo)記仍在鰱、鳙間無共有等位基因(圖1)，則將該位點保留備用，而如果出現(xiàn)了共有等位基因，則將其淘汰。通過第二輪篩選后，將篩選出的微衛(wèi)星標(biāo)記在2個鰱、鳙正、反交人工雜交家系各40個個體中篩選，如果某一標(biāo)記在所有個體中均同時表現(xiàn)出鰱、鳙特異等位基因，則該標(biāo)記可作為鰱、鳙種間特異性微衛(wèi)星標(biāo)記，并可應(yīng)用于鰱、鳙的分子鑒定(圖2);而如果在某些個體中只表現(xiàn)出鰱或鳙的等位基因，則該位點可能含零等位基因，如果用于鰱、鳙鑒定可能會造成誤差，因此這種微衛(wèi)星標(biāo)記也被排除。最終篩選出18個可用于對鰱、鳙及其雜交和遺傳漸滲個體進行分子鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記，SEQ ID NO:1-19，各標(biāo)記 的引物(SEQ ID NO: 19-54)信息如下表所示:
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定鰱與鳙的微衛(wèi)星位點，其特征在于，包括核酸序列為SEQ ID N0:l-18中的任一個。
2.微衛(wèi)星引物對，所述的引物對是根據(jù)權(quán)利要求1所述微衛(wèi)星位點設(shè)計的，其特征在于，所述的微衛(wèi)星引物包括下述引物對，核酸序列為SEQ ID NO: 19-54:
3.權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對用于鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的檢測方法，其特征在于包括如下步驟: 1)基因組DNA的提取:提取目標(biāo)個體基因組DNA； 2)微衛(wèi)星PCR擴增:采用權(quán)利要求2的引物，目標(biāo)個體基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得目標(biāo)個體微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物； 3)電泳檢測擴增產(chǎn)物:采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及溴化乙錠染色法檢測微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物； 4)基因型分析:根據(jù)每個個體微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，若某一個體在所有18個微衛(wèi)星位點均表現(xiàn)為鰱等位基因，則該個體為純種鰱；若某一個體在所有18個位點均表現(xiàn)為鳙等位基因,則該個體為純種鳙；若某一個體在所有18個位點均同時顯現(xiàn)鰱、鳙等位基因，則該個體為鰱、鳙雜交個體；若某一個體在18個位點中的至少I個位點同時顯現(xiàn)鰱、鳙等位基因，則該個體為鰱、鳙遺傳漸滲個體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微衛(wèi)星引物對用于鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的檢測方法，其特征在于，提取目標(biāo)個體基因組DNA，將其稀釋為20-50ι^/μL，每個PCR反應(yīng)中加入IyL,反應(yīng)總體積為12.5 μ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的微衛(wèi)星引物對用于鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的加樣參數(shù)為:每個PCR反應(yīng)體系總體積12.5 μ L，包含20-50ng 的模板 DNA，0.4U Taq DNA 聚合酶，1.25 μ LlO X PCR Buffer, 0.4 μ LdNTP (2.5mM),0.4 μ L正反向混合引物(各2.5 μ Μ)，9.4 μ L滅菌超純水；使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為:94°C預(yù)變性5分鐘；(94°C變性35秒、50~60°C退火35秒、72°C延伸40秒)35個循環(huán)；最后72°C終 延伸8分鐘，PCR產(chǎn)物于4°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的微衛(wèi)星引物對用于鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的檢測方法，其特征在于，對PCR產(chǎn)物的檢測:將PCR產(chǎn)物在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠30W恒功率電泳2h進行分離；將膠板通過1%的溴化乙錠溶液顯色5-10分鐘，即可得到目標(biāo)個體在18個基因座位的基因分型。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微衛(wèi)星引物對用于鑒定鰱、鳙雜交和遺傳漸滲個體的檢測方法，其特征在于，對PCR產(chǎn)物的檢測:將PCR產(chǎn)物在10 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠，30W恒功率電泳2h進行分離；將膠板通過1%的溴化乙錠溶液顯色5-10分鐘，即可得到目標(biāo)個體在18個基因座位的基因分型。
8.一種用于鰱、鳙及其雜交和遺傳漸滲個體進行鑒定的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含權(quán)利要求2所述的用于鰱、鳙及其雜交和遺傳漸滲個體進行鑒定的微衛(wèi)星引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒進一步包含TaqDNA聚合酶、10 X PCR Buffer、dNTPs、滅菌超純水、MgCl2。
【文檔編號】C12N15/11GK103866043SQ201410146788
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】童金茍, 朱傳坤, 俞小牧, 張旺 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所