專利名稱：一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法。
背景技術(shù)：
鮭科魚類具有肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、可食部分大、無(wú)肌間刺、易于加工等特點(diǎn)，最重要的是肌肉中蛋白含量高，并且含有大量的不飽和脂肪酸，因此目前已逐漸成為了我國(guó)乃至世界上重要的高品質(zhì)蛋白質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源之一。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民日常生活水平不斷提高，青、草、鰱、鳙等傳統(tǒng)的魚類品種以不能夠完全滿足人們的消費(fèi)需要，因此我國(guó)鮭科魚類等高品質(zhì)蛋白質(zhì)魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅速。由于市場(chǎng)的需求加大，國(guó)家也加大了對(duì)鮭科魚類的生理、生化和發(fā)育生物學(xué)等方面的研發(fā)力度。我國(guó)對(duì)于魚類卵子發(fā)育過程的觀測(cè)研究主要是從青、草、鰱、鳙等傳統(tǒng)溫水性魚類開始的，由于這些魚類卵子卵徑小和卵膜薄，因此普遍采用顯微鏡下直接觀測(cè)和手工繪圖的方法。隨著科技的進(jìn)步，高科技產(chǎn)品的開發(fā)，在隨后的研究中逐漸用數(shù)碼相機(jī)拍照替代了手工繪圖這樣就極大的提高了研究的直觀性和準(zhǔn)確性。但隨著我國(guó)虹鱒等鮭科魚類的不斷開發(fā)，也給魚類卵子發(fā)育的研究帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，由于鮭科魚類大部分都是冷水性魚類其產(chǎn)的卵子主要由蛋白構(gòu)成，具有卵徑大、卵膜厚、顯微鏡無(wú)法直接觀測(cè)特征。早期學(xué)者對(duì)鮭科魚類魚卵發(fā)育的研究主要有3種胰蛋白酶酶解透明處理方法、透明液處理方法和5%甲醛固定剝離卵膜顯微鏡下拍照的方法。以上3中方法雖然一定程度上實(shí)現(xiàn)了鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)，但也均存在各自的不足，主要如下胰蛋白酶必須處理活體卵子，處理后因卵膜較薄，雖然可以透過卵膜觀測(cè)到魚卵具體的發(fā)育分期，但成本較高，需立即處理，時(shí)間相對(duì)緊張(處理不及時(shí)蛋白變性將無(wú)法觀測(cè))，操作難度也較大，卵膜極易破碎，卵膜反光性強(qiáng)，顯微成像不清晰；透明液雖然可使卵膜變性且增加了透明度，但卵膜的厚度沒有改變，細(xì)胞分裂期細(xì)節(jié)很難觀測(cè)到，因此透明液只能作為大致確定發(fā)育時(shí)相的工具，但用于魚卵發(fā)育的深入研究缺少準(zhǔn)確性；5%甲醛固定剝離卵膜顯微鏡下拍照的方法，雖然具備了操作容易、固定后可隨時(shí)觀測(cè)的特性，但有甲醛固定魚卵的胚體和卵黃蛋白均為白色，無(wú)顏色反差，因此在觀測(cè)細(xì)胞分裂期時(shí)顯微拍照的清晰度不夠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法中存在細(xì)胞分裂期細(xì)節(jié)很難觀測(cè)以及顯微成像不清晰的問題而提出一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法。本發(fā)明中的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、前期準(zhǔn)備首先準(zhǔn)備觀測(cè)所需工具，包括撈魚網(wǎng)、規(guī)格為5ml的采樣管、小鑷子、解剖針、載玻片、帶有拍照功能的解剖鏡；然后配制魚卵固定液，稱取20g 50g的苦味酸放入盛有400ml 600ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)20mirT40min后，將燒杯口用封口膜封緊，放置于:TC飛。C的冰箱中，放置20tT28h后，用濾紙過濾并取上清液，量取350m廣450ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入80mf 120ml甲醛和16mf24ml冰醋酸，混合均勻后，裝入不透明且?guī)w的容器中，放置于3°C飛。C的冰箱中備用；二、樣品采集鮭科魚類受精卵孵化水溫為7V、°C，需要18cT22d才能孵化破膜，具體采樣間隔如下受精后0tT3h內(nèi)，每間隔15min采樣一次；受精后3tT8h內(nèi)，每30min采樣一次；受精后8h 33h內(nèi)，每間隔Ih米樣一次；受精后33h 81h內(nèi)，每間隔2h米樣一次；受精后81h 129h內(nèi)，每間隔6h米樣一次；受精后129h 215h每間隔12h米樣一次；受精后215h至破膜時(shí)，每間隔24h采樣一次；樣品采集過程首先在每個(gè)采樣管上注明不同的標(biāo)號(hào)和不同的發(fā)育期，然后向每個(gè)采樣管中注入2mf4ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵15個(gè) 20個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中，搖晃lmirT3min后，將采樣管放置于3°C飛。C的冰箱中，20tT28h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液，即完成鮭科魚類受精卵的樣品采集；三、發(fā)育觀測(cè)從固定液中取出魚卵放在載破片上，魚卵的胚體朝上，用鑷子夾住魚卵，用解剖針輕輕剝掉卵膜，放在解剖鏡下觀測(cè)，并拍照，根據(jù)每個(gè)采樣管上注明的不同標(biāo)號(hào)和不同發(fā)育期，全程記錄鮭科魚類由受精后Oh至破膜時(shí)的整個(gè)發(fā)育過程。本發(fā)明包括以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明方法采用新配方制成魚卵固定液，其有效期一般在I年左右，具備使用方便的特點(diǎn)；2、使用本發(fā)明方法中的魚卵固定液后，魚卵上的膜易于剝離，有利于進(jìn)行觀測(cè)；3、本發(fā)明方法采用了新配方制成的魚卵固定液，其具有將魚卵的胚體染成橙黃色的作用，極大的克服了采用甲醛方法的弊端，使觀測(cè)鮭科魚類受精卵的發(fā)育過程變得更便捷、更直觀和更準(zhǔn)確。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式中的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、前期準(zhǔn)備首先準(zhǔn)備觀測(cè)所需工具，包括撈魚網(wǎng)、規(guī)格為5ml的采樣管、小鑷子、解剖針、載玻片、帶有拍照功能的解剖鏡；然后配制魚卵固定液，稱取20g 50g的苦味酸放入盛有400ml 600ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)20mirT40min后，將燒杯口用封口膜封緊，放置于:TC飛。C的冰箱中，放置20tT28h后，用濾紙過濾并取上清液，量取350m廣450ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入80m廣120ml甲醛和16mf24ml冰醋酸，混合均勻后，裝入不透明且?guī)w的容器中，放置于3°C飛。C的冰箱中備用；二、樣品采集鮭科魚類受精卵孵化水溫為7V、°C，需要18cT22d才能孵化破膜，具體采樣間隔如下受精后0tT3h內(nèi)，每間隔15min采樣一次；受精后3tT8h內(nèi)，每30min采樣一次；受精后8h 33h內(nèi)，每間隔Ih米樣一次；受精后33h 81h內(nèi)，每間隔2h米樣一次；受精后81h 129h內(nèi)，每間隔6h米樣一次；受精后129h 215h每間隔12h米樣一次；受精后215h至破膜時(shí)，每間隔24h采樣一次；樣品采集過程首先在每個(gè)采樣管上注明不同的標(biāo)號(hào)和不同的發(fā)育期，然后向每個(gè)采樣管中注入2mf4ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵15個(gè) 20個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中，搖晃lmirT3min后，將采樣管放置于3°C飛。C的冰箱中，20tT28h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液，即完成鮭科魚類受精卵的樣品采集；三、發(fā)育觀測(cè):從固定液中取出魚卵放在載破片上，魚卵的胚體朝上，用鑷子夾住魚卵，用解剖針輕輕剝掉卵膜，放在解剖鏡下觀測(cè)，并拍照，根據(jù)每個(gè)采樣管上注明的不同標(biāo)號(hào)和不同發(fā)育期，全程記錄鮭科魚類由受精后Oh至破膜時(shí)的整個(gè)發(fā)育過程。本發(fā)明包括以下優(yōu)點(diǎn):1、本發(fā)明方法采用新配方制成魚卵固定液，其有效期一般在I年左右，具備使用方便的特點(diǎn)；2、使用本發(fā)明方法中的魚卵固定液后，魚卵上的卵膜易于剝離，有利于進(jìn)行觀測(cè)；3、本發(fā)明方法采用了新配方制·成的魚卵固定液，其具有將魚卵的胚體染成橙黃色的作用，極大的克服了采用甲醛方法的弊端，使觀測(cè)鮭科魚類受精卵的發(fā)育過程變得更便捷、更直觀和更準(zhǔn)確。
具體實(shí)施方式
二:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中稱取25g 45g的苦味酸放入盛有450ml 550ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)25mirT35min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中稱取35g的苦味酸放入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)30min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟一中將燒杯口用封口膜封緊，放置于4°C的冰箱中，放置24h。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟一中量取380ml 420ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入90m廣IlOml甲醛和18mf22ml冰醋酸，混合均勻。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟一中量取400ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入IOOml甲醛和20ml冰醋酸，混合均勻。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
七:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟二中向每個(gè)采樣管中注入2.5πιΓ3.5ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵16 18個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
八:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟二中向每個(gè)采樣管中注入3ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵17個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
九:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟二中將采樣管放置于3.5°C 4.5°C的冰箱中，22tT26h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟二中將采樣管放置于4°C的冰箱中，24h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。為了驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、前期準(zhǔn)備首先準(zhǔn)備觀測(cè)所需工具，包括撈魚網(wǎng)、規(guī)格為5ml的采樣管、小鑷子、解剖針、載玻片、帶有拍照功能的解剖鏡；然后配制魚卵固定液，稱取35g的苦味酸放入盛有500ml蒸懼水的燒杯中,用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)30min后,將燒杯口用封口膜封緊,放置于40C的冰箱中，放置24h后，用濾紙過濾并取上清液，量取400ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入IOOmf 120ml甲醛和20ml冰醋酸，混合均勻后，裝入不透明且?guī)w的容器中，放置于4°C的冰箱中備用；二、樣品采集本實(shí)驗(yàn)中鮭科魚類采用鮭魚，其受精卵孵化水溫為7V、°C，需要18cT22d才能孵化破膜，具體采樣間隔如下受精后Ohlh內(nèi)，每間隔15min采樣一次；受精后3tT8h內(nèi)，每30min采樣一次；受精后8tT33h內(nèi)，每間隔Ih采樣一次；受精后33tT81h內(nèi)，每間隔2h米樣一次；受精后81h 129h內(nèi)，每間隔6h米樣一次；受精后129h 215h每間隔12h采樣一次；受精后215h至破膜時(shí)，每間隔24h采樣一次；樣品采集過程首先在每個(gè)采樣管上注明不同的標(biāo)號(hào)和不同的發(fā)育期，然后向每個(gè)采樣管中注入3ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵17個(gè) 18個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中，搖晃2min后，將采樣管放置于4°C的冰箱中，24h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液，即完成鮭魚受精卵的樣品采集；三、發(fā)育觀測(cè)從固定液中取出魚卵放在載破片上，魚卵的胚體朝上，用鑷子夾住魚卵，用解剖針輕輕剝掉卵膜，放在解剖鏡下觀測(cè)，并拍照，根據(jù)每個(gè)采樣管上注明的不同標(biāo)號(hào)和不同發(fā)育期，全程記錄鮭魚由受精后Oh至破膜時(shí)的整個(gè)發(fā)育過程。本實(shí)驗(yàn)中采用了新配方制成的魚卵固定液，其具有將魚卵的胚體染成橙黃色的作用，極大的克服了采用甲醛方法的弊端，使觀測(cè)鮭魚受精卵的發(fā)育過程變得更便捷、更直觀和更準(zhǔn)確。
權(quán)利要求
1.一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于它是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的: 一、前期準(zhǔn)備:首先準(zhǔn)備觀測(cè)所需工具，包括:撈魚網(wǎng)、規(guī)格為5ml的采樣管、小鑷子、解剖針、載玻片、帶有拍照功能的解剖鏡；然后配制魚卵固定液，稱取20g 50g的苦味酸放入盛有400ml 600ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)20mirT40min后，將燒杯口用封口膜封緊，放置于:3℃~5℃的冰箱中，放置20tT28h后，用濾紙過濾并取上清液，量取350m廣450ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入80m廣120ml甲醛和16mf24ml冰醋酸，混合均勻后，裝入不透明且?guī)w的容器中，放置于3°C~5℃的冰箱中備用； 二、樣品采集:鮭科魚類受精卵孵化水溫為7℃~9℃，需要18cT22d才能孵化破膜，具體米樣間隔如下:受精后Oh 3h內(nèi)，每間隔15min米樣一次；受精后3h 8h內(nèi)，每30min米樣一次；受精后8tT33h內(nèi)，每間隔Ih采樣一次；受精后33tT81h內(nèi)，每間隔此采樣一次；受精后81h 129h內(nèi)，每間隔6h米樣一次；受精后129h 215h每間隔12h米樣一次；受精后215h至破膜時(shí)，每間隔24h采樣一次；樣品采集過程:首先在每個(gè)采樣管上注明不同的標(biāo)號(hào)和不同的發(fā)育期，然后向每個(gè)采樣管中注入2mf4ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵15個(gè) 20個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中，搖晃lmirT3min后，將采樣管放置于3℃~5℃的冰箱中，20tT28h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液，即完成鮭科魚類受精卵的樣品采集； 三、發(fā)育觀測(cè):從固定液中取出魚卵放在載破片上，魚卵的胚體朝上，用鑷子夾住魚卵，用解剖針輕輕剝掉卵膜，放在解剖鏡下觀測(cè)，并拍照，根據(jù)每個(gè)采樣管上注明的不同標(biāo)號(hào)和不同發(fā)育期，全程記錄鮭科魚類由受精后OtT破膜時(shí)的整個(gè)發(fā)育過程。
2.如權(quán)利要求1所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于步驟一中稱取25g 45g的苦味酸放入盛有450ml 550ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)25min 35min。
3.如權(quán)利要求1所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于步驟一中稱取35g的苦味酸放入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒反復(fù)攪動(dòng)30min。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于步驟一中將燒杯口用封口膜封緊，放置于4°C的冰箱中，放置24h。
5.如權(quán)利要求1所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于步驟一中量取380ml 420ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入90m廣IlOml甲醛和18mf 22ml冰醋酸，混合均勻。
6.如權(quán)利要求1所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于步驟一中量取400ml此上清液放入另一個(gè)燒杯中，并向此燒杯中加入IOOml甲醛和20ml冰醋酸，混合均勻。
7.如權(quán)利要求1、2、3、5和6中任一項(xiàng)所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于步驟二中向每個(gè)采樣管中注入2.5πιΓ3.5ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵16 18個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中。
8.如權(quán)利要求1、2、3、5和6中任一項(xiàng)所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，其特征在于步驟二中向每個(gè)采樣管中注入3ml步驟一中配制的魚卵固定液，每次采樣時(shí)取受精卵17個(gè)放入到裝有魚卵固定液的采樣管中。
9.如權(quán)利要求7所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，特征在于步驟二中將采樣管放置于3.5°C 4.5°C的冰箱中，22tT26h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液。
10.如權(quán)利要求7所述的一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，特征在于步驟二中將采樣管放置于4°C的冰 箱中，24h后將采集的受精卵更換一次等量的步驟一中配制的魚卵固定液。
全文摘要
一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，它涉及魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法，本發(fā)明要解決現(xiàn)有鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法中存在細(xì)胞分裂期細(xì)節(jié)很難觀測(cè)以及顯微成像不清晰的問題。本發(fā)明中一種鮭科魚卵發(fā)育過程的觀測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、前期準(zhǔn)備然后配制魚卵固定液并放置于冰箱中保存；二、樣品采集采集鮭科魚類受精卵放入到裝有魚卵固定液的采樣管中并放置于冰箱中保存；三、發(fā)育觀測(cè)從固定液中取出魚卵放在載破片上，用解剖針輕輕剝掉卵膜，放在解剖鏡下觀測(cè)，并拍照，根據(jù)每個(gè)采樣管上注明的不同標(biāo)號(hào)和不同發(fā)育期，全程記錄鮭科魚類由受精后0h至破膜時(shí)的整個(gè)發(fā)育過程。本發(fā)明適用于鮭科魚類受精卵發(fā)育過程的觀測(cè)和研究應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N21/00GK103076283SQ20131001752
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者張永泉, 尹家勝, 張玉勇 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所