一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝的制作方法
【專利摘要】一種應(yīng)用于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】中的重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，所述制備工藝包括如下步驟，以人工合成的人尿激酶原全基因序列為模板，通過PCR獲取人尿激酶原的目的基因片段，構(gòu)建含人尿激酶原的原核表達載體，將此表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選并挑取陽性克隆株，即為人尿激酶原的基因工程菌株；將人尿激酶原的工程菌株接種到固體LB培養(yǎng)基中，挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)過夜，然后按比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)過夜，再按比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，升溫至42℃誘導培養(yǎng)4小時，離心收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集沉淀，即為人尿激酶原的包涵體。該發(fā)明不受自然資源的限制，具有投入少，產(chǎn)出高，利潤空間大，溶栓作用機理獨特，效果明顯，無或低毒副作用。
【專利說明】一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】中的一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，特別是用于治療血栓的重組人尿激酶原的制備工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]血栓性疾病已成為危害人類健康的主要疾病之一，隨著我國步入老齡化社會，每年新增心腦血管病例逾千萬,用于血栓治療的藥費高達上百億元。血栓性疾病不僅發(fā)病率高，而且死亡率與致殘率高。近20年來，盡管血栓性疾病的治療有了顯著的進展，但其死亡率仍高居各病之首，全國每年約1000萬人發(fā)病，每年死于血栓性疾病的病人達100萬以上。目前世界溶栓藥物市場的銷售額已達到1000多億美元，占世界藥品銷售總額的10.0%左右。現(xiàn)在市場上廣泛應(yīng)用的尿激酶是從新鮮人尿液中提取的，不僅來源有限，嚴重抑制產(chǎn)能；而且按照FDA要求，組織器官來源的藥品必須嚴格檢查傳染性疾病的病原(HBV，HIV等)，并有逐步取消生產(chǎn)的可能。如此可見，加快研制新型的溶栓制劑，不僅具有社會效益，而且將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。
[0003]目前國內(nèi)外已上市的用于血栓治療的藥物主要有尿激酶、鏈激酶和蛇毒幾種，不僅可供臨床選擇的品種較少，而且均是資源限制性藥物，產(chǎn)量和資源有限。所以研制開發(fā)基因工程類新品種具有廣闊前景和市場。
[0004]尿激酶原(pro-urokinase, pro-UK)是一種特異性溶栓藥物,為雙鏈尿激酶(UK)的前體，是由411個氨基酸組成的單鏈分子，分子量為54kD的糖蛋白，在纖溶酶(plasmin)的作用下，Lys158Ile159間的肽鍵斷裂后被激活為雙鏈形式UK。它主要激活纖維蛋白表面的纖溶酶原，所以具有選擇性溶栓作用，與其他溶栓藥物相比，人尿激酶原具有療效顯著，不良反應(yīng)小等優(yōu)點。尿激酶原(pro-UK)在溶栓治療中具有與纖維蛋白親和力高而與纖維蛋白原親和力低的特點，用做溶栓藥物具有出血少、重新栓塞率低的優(yōu)點，倍受人們的重視。但天然pro-UK含量稀少，純化困難，所以難以形成規(guī)模化生產(chǎn)。采用基因工程技術(shù)，制備重組pro-UK是解決pro-UK規(guī)?；a(chǎn)的必經(jīng)之路，不僅具有巨大的經(jīng)濟效益,而且具有重要的社會意義。
[0005]自1985年Holmes等人成功地克隆了人pro-UK的cDNA之后，人pro-UK已在酵母，哺乳動物細胞和大腸桿菌等表達體系中獲得表達。但是在各種表達系統(tǒng)中用基因重組技術(shù)制備pro-UK具有不同程度的困難，主要表現(xiàn)為:選用哺乳動物細胞為表達系統(tǒng)時，生產(chǎn)成本高，且表達產(chǎn)物易轉(zhuǎn)化為雙鏈形式，分離困難，盡管如此，我國cFDA批準了上海天士力利用人CHO細胞生產(chǎn)重組人尿激酶原，2011-04-02獲得批文；以酵母為表達體系時，其產(chǎn)量低，且表達產(chǎn)物活性明顯低于天然pro-UK ;以大腸桿菌作為表達體系時，由于pro-UK含有12對二硫鍵，表達產(chǎn)物以無活性的包涵體形式存在，體外復性困難，難以放大生產(chǎn)，因此，嚴重影響了 pro-UK的臨床應(yīng)用。盡管如此，由于大腸桿菌表達體系具有成本低，表達水平高，易于純化等特點，且非糖基化的尿激酶原具有更高的纖溶活性和體外穩(wěn)定性，因此，人pro-UK在大腸桿菌中的高效表達對重組人尿激酶原的產(chǎn)業(yè)化具有重要實際意義。1991年 Gaetano ORSINI 等[Eur.J.Biochem.195，691-697 (1991)]報道了用重組大腸桿菌表達純化人尿激酶原的方法，他們先后用Sepharose_S、hydroxyapatite和Sephacryl S-200層析柱純化人重組尿激酶原，該方法盡管能夠獲得具有活性的人重組尿激酶原，但蛋白回收效率和純度均較低。因此，研究開發(fā)一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝是目前亟待解決的新課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，該方法不受自然資源的限制，可根據(jù)市場需求不限量的生產(chǎn)，具有投入少，產(chǎn)出高，利潤空間大，溶栓作用機理獨特，效果明顯，無或低毒副作用。
[0007]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，所述制備工藝包括如下步驟，
(1)以人工合成的人尿激酶原全基因序列為模板，設(shè)計上游引物為:5‘-CGGTCGAC AGCAAT GAA CTT CAT CAA GTT-3’，含有 S?a I 酶切位點，下游引物為:5‘_CG TCTAGA TCA GAGGGC CAG GCC ATT CTC TTC-3’，含有Sal I酶切位點，通過PCR獲取人尿激酶原的目的基因片段，以PBV220為質(zhì)粒載體，構(gòu)建含人尿激酶原的原核表達載體pBV220-pix)UK，將此表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選并挑取陽性克隆株，即為人尿激酶原的基因工程菌株；
(2)將人尿激酶原的工程菌株接種到固體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)14-16小時，挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中，32 °C搖床培養(yǎng)過夜，然后按比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 °C搖床培養(yǎng)過夜，再按比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，32°C培養(yǎng)，待菌液濃度達到0D_約為2.0后，升溫至42°C誘導培養(yǎng)4小時，同時小量持續(xù)補加填料液，氨水自動調(diào)節(jié)pH7.0,離心收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集沉淀，即為人尿激酶原的包涵體；
(3)將上述包涵體加入包涵體溶解液磁力攪拌溶解12小時以上，離心收集上清液，按比例緩慢加入復性液進行稀釋復性，超濾濃縮，將上述濃縮的復性液通過用平衡液平衡的層析柱，收集目的蛋白峰，即為純化的重組人尿激酶原；
所述制備工藝步驟(3 )重組人尿激酶原的溶解、復性是稱取適量包涵體，加入包涵體洗滌液洗滌2次后，按照2%的比例加入包涵體溶解液，4°C條件下，磁力攪拌溶解12-16小時，4°C，9000rpm，離心lOmin，收集上清液，按照1:20的比例緩慢加入復性液，室溫磁力攪拌溶解4h，15°C搖床振蕩復性16-24小時；所述制備工藝步驟(3)重組人尿激酶原的純化是，將上述復性溶液超濾濃縮20-30倍以上，再用10倍體積稀釋液稀釋，然后先后采用用平衡液平衡好的陽離子層析柱、陰離子層析柱和凝膠層析柱進行純化，純度在97-100% ;采用紫外分光光度計測定蛋白含量，約為0.5mg/ml ;所述的陽離子層析柱是，SP-Sepharose FF層析柱，流速為10ml/min，先后用含0.1、0.2、0.5和LOMNaCl的平衡液洗脫，目的蛋白存在于0.2MNaCl洗脫峰中；所述的陰離子層析柱是Q Sepharose FF層析柱，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0MNaCl的平衡液洗脫；所述的凝膠層析柱是將0.2MNaCl洗脫峰樣品濃縮后按床體積的3%比例再上用平衡液平衡好的Superose 12層析柱,流速為2ml/min ;分步收集第二個峰；所述的制備工藝中用到的各液體的制備方法為，
(O發(fā)酵培養(yǎng)基:以1000ml為單位按下列比例配制，溶解后高壓滅菌；胰蛋白胨 IOg,酵母提取物 5 g, NaCllg, CaCl2 0.lg, NH4Cll.5g,葡萄糖 5g, 115 V,單獨高壓，NaH2PO4.2H201.5g, Na2HPO4.12H206g ；
(2)lmol/LIPTG:過濾除菌，_20°C保存；IPTG0.48g，水 20ml ；
(3)包涵體洗漆液:以1000ml為單位按下列比例配制；Tris1.21g, TritonX-100 lml,調(diào)ρΗ8.0并補水至1000ml ；
(4)包涵體溶解液:以100ml為單位按下列比例配制；Tris121mg,鹽酸胍57.3g, 二巰基乙醇354 μ 1，調(diào)ρΗ8.5并補水至100ml ；
(5)復性液:以1000ml為單位按下列比例配制；Tris1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA10ml，調(diào) ρΗ8.5 并補水至 100ml ；
(6)稀釋液:以1000ml為單位按下列比例配制；Tris1.21g，尿素150.2g，0.5Μ EDTA10ml，調(diào) ρΗ7.6 并補水至 100ml。
[0008]本發(fā)明的要點在于一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝。其原理是，(I)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，非糖基化的尿激酶原具有更高的纖溶活性和體外穩(wěn)定性，采用PBV220質(zhì)粒為載體，溫控誘導表達尿激酶原，可增加蛋白表達量，簡化操作，降低成本，便于大量生產(chǎn)。(2)先后采用陽離子、陰離子、凝膠過濾等層析柱進行純化，純化過程較簡單，易于控制，蛋白純度、回收率及活性都較高。
[0009]一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有不受自然資源的限制，可根據(jù)市場需求不限量的生產(chǎn)，具有投入少，產(chǎn)出高，利潤空間大，溶栓作用機理獨特，效果明顯，無或低毒副作用等優(yōu)點，將廣泛的應(yīng)用于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0011]圖1是pBV220-proUK原核表達載體構(gòu)建方案圖。
[0012]圖2是表達載體的酶切圖譜。
[0013]圖3是發(fā)酵菌體表達的重組人尿激酶原圖。
[0014]圖4是SP-Sepharose FF層析柱純化后結(jié)果圖。
[0015]圖5是Q Sepharose FF層析柱純化后結(jié)果圖。
[0016]圖6是Superose 12層析柱純化結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例將有助于對本發(fā)明的了解，但這些實施例僅為了對本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。
[0018]實施例一
1.構(gòu)建人尿激酶原的原核表達載體pBV220-proUK。
[0019]通過PCR獲得的含proUK的基因用Saa I ,Sal I雙酶切，然后與用Saa I ,Sal I雙酶切的載體PBV220連接；構(gòu)建工程菌株DH5 a -pBV220-proUK ;構(gòu)建含人尿激酶原的原核表達載體pBV220-proUK (如圖1、圖2所示)。
[0020]2.重組人尿激酶原的發(fā)酵及高效表達，具體是:工程菌的活化、發(fā)酵、誘導及包涵體的回收:取_70°C保存的工程菌株接種到含Amp的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14-16h ;挑取單個菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，32°C搖床培養(yǎng)12h以上；將菌液按1:100比例接種到含Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，32°C搖床培養(yǎng)12h以上；將菌液按1:10比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，32°C條件下培養(yǎng)；待菌液濃度達到OD_約為2.0后，升溫到42°C誘導培養(yǎng)4h，同時小量持續(xù)補加填料液，氨水自動調(diào)節(jié)pH7.0。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，菌體用TE緩沖液懸浮，冰浴條件下，超聲破碎菌體，反復4次。離心破碎后的菌體，收集沉淀，即為包涵體(如圖3所示)。
[0021]3.重組人尿激酶原的復性及純化，具體是:
3.1包涵體的洗滌、溶解和復性:稱取適量包涵體，加入包涵體洗滌液洗滌2次后，按照2%的比例加入包涵體溶解液，4°C條件下，磁力攪拌溶解12h以上；4°C，9000rpm，離心lOmin，收集上清液；按照1:20的比例緩慢加入復性液，使蛋白濃度降到0.2%，室溫磁力攪拌溶解4h ;15°C搖床振蕩復性20h以上；超濾濃縮20倍以上，再用10倍體積稀釋液稀釋，立即純化。
[0022]3.2重組人尿激酶原的純化:用平衡液平衡SP-S^harose FF層析柱，將上述稀釋后的復性液全部上樣，流速為10ml/min ;用平衡液充分流洗雜蛋白到基線后，先后用含
0.1、0.2、0.5和1.011 NaCl的平衡液洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS蛋白電泳鑒定，目的蛋白存在于0.2M NaCl洗脫峰中(如圖4所示)；將上述0.2M NaCl洗脫峰樣品再上用平衡液平衡好的Q Sepharose FF層析柱或_20°C保存?zhèn)溆胘^SDS蛋白電泳鑒定后，目的蛋白存在于0.2MNaCl洗脫峰中(如圖5所示)；將上述0.2M NaCl洗脫峰樣品超濾濃縮后按床體積的3%比例再上用平衡液平衡好的Superose 12層析柱,流速為2ml/min ;分步收集第二個峰，-20°C保存待鑒定(如圖6所ττΟ。
[0023]3.3純化的尿激酶原鑒定采用SDS蛋白電泳法，純度在97%以上(如圖6所示);采用紫外分光光度計測定蛋白含量，約為0.5mg/ml。
[0024]4.所述各液體配方范圍及準備如下，
(O發(fā)酵培養(yǎng)基:以1000ml為單位按下列比例配制，溶解后高壓滅菌；胰蛋白胨10g，酵母提取物 5 g, NaCl I g, CaCl2 0.1 g, NH4Cl 1.5 g,葡萄糖 5g (115°C,單獨高壓)，NaH2PO4.2H20 1.5g, Na2HPO4.12H20 6g ；
(2)lmol/L IPTG:過濾除菌，_20°C保存；IPTG 0.48g，水 20ml ；
(3)包涵體洗滌液:以1000ml為單位按下列比例配制；Tris1.21g，TritonX-100 Iml，調(diào)ρΗ8.0并補水至1000ml ；
(4)包涵體溶解液:以100ml為單位按下列比例配制；Tris 121 mg,鹽酸胍57.3g,二巰基乙醇354 μ 1，調(diào)ρΗ8.5并補水至100ml ；
(5)復性液:以1000rnl為單位按下列比例配制；Tris1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA10ml，調(diào) ρΗ8.5 并補水至 100ml ；
(6)稀釋液:以1000rnl為單位按下列比例配制；Tris1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA10ml，調(diào) ρΗ7.6 并補水至 100ml。
[0025]在圖2中M:分子量標準，從大到小依次為10000、7000、4000、2000、1000、500、250bp ;1、g、d:表達載體。在圖3中，M:分子量標準，從大到小依次為97.2,66.7,44.3、29.8kD ；1:菌體上清；2、3:菌體沉淀；4:未誘導菌體對照。在圖4中，M:分子量標準，從大到小依次為 97.2,66.7,44.3,29.8kD ；1:0.1M NaCl 洗脫峰；2:0.2M NaCl 洗脫峰；3:0.5MNaCl洗脫峰。在圖5 中，M:分子量標準，從大到小依次為97.2,66.7,44.3,29.8kD ；1:0.1MNaCl洗脫峰；2:0.2M NaCl洗脫峰；3:0.5M NaCl洗脫峰。在圖6中，M:分子量標準，從大到小依次為97.2,66.7,44.3,29.8kD ；1:純化前樣品；2:純化后樣品。
【權(quán)利要求】
1.一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，其特征在于:所述制備工藝包括如下步驟， (1)以人工合成的人尿激酶原全基因序列為模板，設(shè)計上游引物為:5‘-CGGTCGAC AGCAAT GAA CTT CAT CAA GTT-3’，含有 Saa I 酶切位點，下游引物為:5‘_CG TCTAGA TCA GAGGGC CAG GCC ATT CTC TTC-3’，含有Sal I酶切位點，通過PCR獲取人尿激酶原的目的基因片段，以PBV220為質(zhì)粒載體，構(gòu)建含人尿激酶原的原核表達載體pBV220-pix)UK，將此表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選并挑取陽性克隆株，即為人尿激酶原的基因工程菌株； (2)將人尿激酶原的工程菌株接種到固體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)14-16小時，挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中，32 °C搖床培養(yǎng)過夜，然后按比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 °C搖床培養(yǎng)過夜，再按比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，32°C培養(yǎng)，待菌液濃度達到0D_約為2.0后，升溫至42°C誘導培養(yǎng)4小時，同時小量持續(xù)補加填料液，氨水自動調(diào)節(jié)pH7.0,離心收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集沉淀，即為人尿激酶原的包涵體； (3)將上述包涵體加入包涵體溶解液磁力攪拌溶解12小時以上，離心收集上清液，按比例緩慢加入復性液進行稀釋復性，超濾濃縮，將上述濃縮的復性液通過用平衡液平衡的層析柱，收集目的蛋白峰，即為純化的重組人尿激酶原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，其特征在于:所述制備工藝步驟(3)重組人尿激酶原的溶解、復性是稱取適量包涵體,加入包涵體洗滌液洗滌2次后，按照2%的比例加入包涵體溶解液，4°C條件下，磁力攪拌溶解12-16小時，4°C，9000rpm,離心lOmin，收集上清液，按照1: 20的比例緩慢加入復性液，室溫磁力攪拌溶解4h，15°C搖床振蕩復性16-24小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，其特征在于:所述制備工藝步驟(3)重組人尿激酶原的純化是，將上述復性溶液超濾濃縮20-30倍以上，再用10倍體積稀釋液稀釋，然后先后采用用平衡液平衡好的陽離子層析柱、陰離子層析柱和凝膠層析柱進行純化，純度在97-100% ;采用紫外分光光度計測定蛋白含量，約為0.5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，其特征在于:所述的陽離子層析柱是，SP-Sepharose FF層析柱,流速為IOml/min，先后用含0.1,0.2,0.5和1.0MNaCl的平衡液洗脫，目的蛋白存在于0.2MNaCl洗脫峰中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，其特征在于:所述的陰離子層析柱是Q Sepharose FF層析柱，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0MNaCl的平衡液洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3或5所述的一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，其特征在于:所述的凝膠層析柱是將0.2MNaCl洗脫峰樣品濃縮后按床體積的3%比例再上用平衡液平衡好的Superose 12層析柱,流速為2ml/min ;分步收集第二個峰。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化重組人尿激酶原的制備工藝，其特 征在于:所述的制備工藝中用到的各液體的制備方法為， (O發(fā)酵培養(yǎng)基:以1000ml為單位按下列比例配制，溶解后高壓滅菌；胰蛋白胨 1Og,酵母提取物 5 g, NaCllg, CaCl2 0.lg, NH4Cll.5g,葡萄糖 5g, 115 V,單獨高壓，NaH2PO4.2H201.5g, Na2HPO4.12H206g ； (2)lmol/LIPTG:過濾除菌，_20°C保存；IPTG0.48g，水 20ml ； (3)包涵體洗漆液:以1000ml為單位按下列比例配制；Tris1.21g, TritonX-100 lml,調(diào)ρΗ8.0并補水至1000ml ； (4)包涵體溶解液:以100ml為單位按下列比例配制；Tris121mg,鹽酸胍57.3g, 二巰基乙醇354 μ 1，調(diào)ρΗ8.5并補水至100ml ； (5)復性液:以1000ml為單位按下列比例配制；Tris1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA10ml，調(diào) ρΗ8.5 并補水至 100ml ；
(6)稀釋液:以1000ml為單位按下列比例配制；Tris1.21g，尿素150.2g，0.5Μ EDTA10ml，調(diào) ρΗ7.6 并補水至 100ml。
【文檔編號】C12N15/58GK103789291SQ201410060713
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】蘇顯英, 趙洪禮, 王艷, 林海, 陳錚 申請人:東北制藥集團股份有限公司