專利名稱：桑腸桿菌及其生物轉化發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域及煙用香料技術領域，具體涉及一株從香莢蘭植株中篩選到的桑腸桿菌，用該桑腸桿菌進行生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法，以及該方法制得的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏在卷煙中的應用。
背景技術：
現(xiàn)有技術中，煙用香精香料是卷煙生產(chǎn)不可缺少的輔料，也是卷煙產(chǎn)品風格完善、低焦低害香味補償?shù)挠行侄?。目前，我國煙用香料主要是直接從煙草或其它植物中提取的天然香料或化學合成香料，天然香料受到植物資源有限性的限制，化工合成香料存在香氣單一，制備成本太高的缺陷，而且，有些香料尚不能用人工合成得到。麩皮為小麥最外層的表皮，是小麥加工面粉后得到的副產(chǎn)品，主要用作飼料，經(jīng)濟價值不高。小麥麩皮含有大量人體必需的營養(yǎng)成分，如相當豐富的維生素E和B族維生素，維生素E與動物的生殖功能有關，是防止不育癥和人體細胞衰老的營養(yǎng)素，還可以抗癌。維生系E有不溶于水、溶于脂肪和脂溶劑、耐熱、在無氧時加熱到200°C不受影響的特點；麩皮中含有15%左右的蛋白質的有機氮源；含有硫胺素、核黃素、尼克酸等微生物生長必需的生長素；富含纖維素和半纖維素；此外，還含有a-淀粉酶、β -淀粉酶、氧化酶、過氧化酶等，這些都是微生物所必需的。據(jù)現(xiàn)代科研測定，其對氨基苯甲酸含量是植物中最高的，對氨基苯甲酸是機體細胞生長和分裂所必需的物質葉酸的組成部分之一，并有回復皮毛顏色作用。實際上麩皮作為中藥的一味，具有潤肺、滋潤皮膚，防癌抗癌，健脾和胃，烏發(fā)固發(fā)，清理腸胃等作用。但直接從麩皮中提取制得浸膏無法用于卷煙加香，因其與煙氣不協(xié)調，雜氣重，刺激性大，對卷煙吸味有較大的負面影響。微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學作用及微生物體內復雜代謝的協(xié)同作用下，可使原料發(fā)生分解、降 解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉化等作用，形成復雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。但現(xiàn)有技術中用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)煙用香料的得率低且不容易控制?，F(xiàn)有技術未見用麩皮制得的煙用浸膏用于卷煙的報道。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術的上述不足，本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種桑腸桿菌及其生物轉化發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法和應用，從香莢蘭植株中篩選到的一株桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020，用其生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏并將制備的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏應用于卷煙中，具有與煙氣協(xié)調、增加醇厚甘甜香氣、使煙氣柔和、豐富香氣、刺激小、雜氣少、改善煙草吸味的優(yōu)點。本發(fā)明提供了一株桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3,于2012年2月16日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2012020，所述桑腸桿菌的菌株VL4-3的16SrRNA序列，其序列全長1414bp，與桑腸桿菌的相似度達到99.608%。如上所述的一株桑腸桿菌進行生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法依以下步驟進行:(I)回流提取:將干燥的麩皮和水按質量比1: 8 50混合，回流提取I 3小時后過濾，取麩皮濾液，在115°C下滅菌25分鐘；(2)斜面培養(yǎng):將桑腸桿菌CCTCC M2012020接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25 35°C、pH5 9條件下，靜置培養(yǎng)24 72小時后得到斜面培養(yǎng)物，置于4°C冰箱中；(3)制備種子培養(yǎng)液:用步驟(2)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 35°C，轉速100 150rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)12 36h，連續(xù)轉接I 4次后制得種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵:將步驟(3)中所得的種子培養(yǎng)液按體積比2 20%接種到上述步驟(I)中的麩皮濾液中形成發(fā)酵液，所述發(fā)酵液的裝罐量為罐體積的10 40%，在PH6 10，溫度25 35°C，轉速100 20 0rpm/min，不避光條件下發(fā)酵24 72小時；(5)制備浸膏:將步驟(4)中所得的發(fā)酵液和重量百分比為95%乙醇按體積比I: 3 4混合，沉淀過夜后抽濾，將抽濾液減壓濃縮除去溶劑，所得黃褐色浸膏即為發(fā)酵型煙用麩皮浸膏；所述發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的密度為1.2100 1.3500之間。所述的麩皮為小麥麩皮。所述的斜面培養(yǎng)基中:馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子液培養(yǎng)基中:麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。如上所述的一株桑腸桿菌進行生物轉化制備得到的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏在卷煙中的應用:在卷煙加香工序中，按煙絲總重0.05 % 0.1 %的比例加入發(fā)酵型煙用麩皮浸膏。本發(fā)明的優(yōu)點是:本發(fā)明采用桑腸桿菌CCTCC M2012020，所述桑腸桿菌以小麥麩皮為天然、唯一碳源、氮源、生物轉化底物，經(jīng)發(fā)酵能生產(chǎn)天然煙用的發(fā)酵型麩皮煙用浸膏，方法工藝過程簡單，環(huán)保無害，對環(huán)境無污染，原料成本極為低廉，產(chǎn)物天然，有工業(yè)化應用前景；所得發(fā)酵型麩皮煙用浸膏能直接用于卷煙的加香，具有與煙氣協(xié)調、增加醇厚甘甜香氣、使煙氣柔和、豐富香氣、刺激小、雜氣少、改善煙草吸味的優(yōu)點，能與其它煙用香精香料混合調配使用，克服了直接使用麩皮提取物浸膏與煙氣不協(xié)調，雜氣重，刺激性大，無法煙用的致命缺陷。生物材料保藏信息一株桑腸桿菌VL4-3 (Enterobacter mori)于2012年2月16日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2012020o
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式
及相關技術問題作進一步詳細的描述。本發(fā)明的桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020是從香莢蘭植株中篩選到，已于2012年2月16日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。其生物學特征是:菌株為直桿狀，為革蘭氏陰性菌，兼性好氧，具有ONPG β -半乳糖苷酶、LDC賴氨酸脫羧酶、ADH精氨酸雙水解酶、ODC鳥氨酸脫羧酶的酶活性；色氨酸脫氨酶、尿酶反應、H2S產(chǎn)生、明膠液化、吲哚產(chǎn)生呈陰性；能利用檸檬酸、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖，產(chǎn)酸和氣，生成酸甜香氣物質。能以多種氨基酸、大部分單糖、多糖、酯類和氨基酸為唯一碳源生長；在以環(huán)糊精、衣康酸、α -酮戊酸、奎尼酸、阿東糖醇、1-赤藻糖醇、L-墨角藻糖、琥珀酰胺酸、乳果糖、羥基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-焦谷氨酸、D，L-肉堿、Y -氨基丁酸、D-乳糖酸內酯、α-酮戊二酸、癸二酸、Y-羥基丁酸、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、2，3- 丁二醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上不能生長。本桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3的分子鑒定特征為:以待測菌株的染色體DNA為模板，通過合成引物進行。16S rRNA基因PCR擴增。上游引物:5，-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’ ；下游引物:5 ’ -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3 ’ (上海英駿生物公司提供)。經(jīng)回收測序、校正后得到菌株L4-3的16S rRNA序列，其序列全長1414bp。與桑腸桿菌(Enterobacter mori)的相似度達到99.608%。本發(fā)明的桑腸桿菌生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法中采用的桑腸桿菌CCTCC M2012020，沒有人采用過這一菌株進行發(fā)酵生產(chǎn)煙用香料，也沒有人采用麩皮作為天然、唯一的碳源、氮源、生物轉化底物來發(fā)酵，轉化生產(chǎn)發(fā)酵型煙用麩皮浸膏。本發(fā)明還將桑腸桿菌CCTCC M2012020進行生物轉化制備得到的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏在卷煙中應用，發(fā)酵型煙用麩皮浸膏在卷煙加香工序中，按煙絲總重0.05% 0.1%的比例加入。本申請人采用GC/MS對本發(fā)明“發(fā)酵型煙用麩皮浸膏”進行了揮發(fā)性致香成分的測定，并以(未利用桑腸桿菌CCTCC M2012020發(fā)酵的)普通“麩皮提取物浸膏”作為對比樣，進行同樣的測定和對比，簡述如下。(I)同時蒸餾萃取將本發(fā)明的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏和麩皮提取物浸膏各取5g分別裝入蒸餾萃取裝置的一個圓底燒瓶中，加入400mL水，用電熱套加熱至沸騰，在另一側的圓底燒瓶中加入200mL的二氯甲烷，60°C水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計時萃取2h。萃取結束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并濃縮至lmL，濃縮液用于進行GC/MS分析。(2)GC/MS 分析:HP_5MS (50mX0.25mmX0.25 μ m)毛細管柱；進樣溫度:250°C ;分流比 20:1 ;載氣:He, lmL/min ;升溫程序:從 50°C (Imin)以 5°C /min 升到 250°C (5min)；傳輸線溫度:250°C;離子源:EI源；電子能量:70eV ;掃描范圍:50 550amu ;使用WILEY和MINILAB譜庫進行檢索。(3)揮發(fā)性成分對比分析GC/MS對本發(fā)明的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏和麩皮提取物浸膏進行香氣成分分析的結果見表1，從表I中可以看出，本發(fā)明的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏一共鑒定出40種香氣成分，其中酮類5種，酸類6種，醇類5種，醛類3種，以及烷烴、烯類、酚類、酯類、吡喃、吡唆、吡唑、硫氰酸鹽、對乙烯基愈創(chuàng)木酚等21種香氣物質。對比麩皮提取物浸膏，本發(fā)明的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏發(fā)酵后新增加了 27種香氣物質，消失了 9種 煙氣的成分。增加的27種香氣物質中:丙酮醛具有刺激性辛辣氣味和焦糖樣甜味；2，3_ 丁二酮具有甜的、奶油、黃油香氣，在酒類、奶制品有天然存在；乙酸是重要的有機酸，呈刺激性特殊香氣；3_羥基-2丁酮，相對百分含量40.935%，為發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的重要香氣成分，大量稀釋后呈奶油香氣；1，1_2乙氧基乙烷，呈愉快的堅果和新鮮青水果香氣，天然品存在于米酒、威士忌、朗姆酒等中，或漿果、蔬菜和乳制品等中；異丁酸具有強烈的似哈敗奶油氣味和干酪味；丁酸具有呈強烈的奶油和干酪香氣及奶油脂肪酸敗氣味；2，3-丁二醇具有香氣微弱的水果香，天然存在于糖蜜發(fā)酵的產(chǎn)物中；糠醛具有焦香味；3-甲基-2- 丁烯，1%或更高濃度的乙醇溶液，具有漿果、紅莓、葡萄、覆盆子、歐黑莓和櫻桃樣果香香氣，有尖刺的酸氣，并帶有發(fā)酵蜜糖樣香調，存在于黑加侖、可可、堅果等中，屬于天然等同香料；對乙烯基愈創(chuàng)木酚呈強烈香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣，有炒花生氣息。相對百分含量有變化的香氣物質中:苯乙醇具有特殊玫瑰香氣，丁酸-2-甲基-2-苯乙酯具有青香、花香、甜的果香和蠟樣香氣。上述的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏所有這些香氣糅合在一起賦予煙氣協(xié)調、醇厚甘甜香氣、使煙氣柔和、豐富香氣、改善煙草吸味。本發(fā)明的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏能成功改善卷煙吸味，是由于微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學作用及微生物體內復雜代謝的協(xié)同作用下，以麩皮為原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉化等作用，形成復雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質很好地豐富和改善了卷煙的質量和吸昧品質。

表1、發(fā)酵型煙用麩皮浸膏與麩皮提取物浸膏揮發(fā)性香氣成分對比
權利要求
1.一株桑腸桿菌，其特征在于:桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3,于2012年2月16日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2012020，所述桑腸桿菌的菌株VL4-3的16SrRNA序列，其序列全長1414bp，與桑腸桿菌的相似度達到99.608%。
2.如權利要求1所述的一株桑腸桿菌生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法，其特征在于所述方法依以下步驟進行: (1)回流提取:將干燥的麩皮和水按質量比1: 8 50混合，回流提取I 3小時后過濾，取麩皮濾液，在115°C下滅菌25分鐘； (2)斜面培養(yǎng):將桑腸桿菌CCTCCM2012020接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25 35°C、pH5 9條件下，靜置培養(yǎng)24 72小時后得到斜面培養(yǎng)物，置于4°C冰箱中； (3)制備種子培養(yǎng)液:用步驟(2)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 35°C，轉速100 150rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)12 36h，連續(xù)轉接I 4次后制得種子培養(yǎng)液； (4)發(fā)酵:將步驟(3)中所得的種子培養(yǎng)液按體積比2 20%接種到步驟(I)中的麩皮濾液中形成發(fā)酵液，所述發(fā)酵液的裝罐量為罐體積的10 40%，在pH6 10，溫度25 35°C，轉速100 200rpm/min，不避光條件下發(fā)酵24 72小時； (5)制備浸膏:將步驟(4)中所得的發(fā)酵液和重量百分比為95%乙醇按體積比1: 3 4，沉淀過夜后抽濾，將抽濾液減壓濃縮除去溶劑，所得黃褐色浸膏即為發(fā)酵型煙用麩皮浸膏，所述發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的密度為1.2100 1.3500之間。
3.如權利要求2所述的一株桑腸桿菌生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法，其特征在于:所述的麩皮為小麥麩皮。
4.如權利要求2所 述的一株桑腸桿菌生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基中:馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。
5.如權利要求2所述的一株桑腸桿菌生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法，其特征在于所述的種子液培養(yǎng)基中:麥芽糖50g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L。
6.如權利要求2所述的一株桑腸桿菌生物轉化制備得到的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏在卷煙中的應用，其特征在于:在卷煙加香工序中，按煙絲總重0.05 % 0.1 %的比例加入發(fā)酵型煙用麩皮浸膏。
全文摘要
本發(fā)明公開了桑腸桿菌及其生物轉化發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法和應用，屬于生物技術領域及煙用香料技術領域。本發(fā)明提供了一株桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3CCTCC M2012020。所述的一株桑腸桿菌進行生物轉化制備發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法(1)回流提??；(2)斜面培養(yǎng)；(3)制備種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵；(5)制備浸膏。所述的一株桑腸桿菌進行生物轉化制備得到的發(fā)酵型煙用麩皮浸膏在卷煙中的應用。本方法工藝過程簡單，環(huán)保無害，無污染，原料成本低廉，產(chǎn)物天然，有工業(yè)化前景。所得發(fā)酵型麩皮煙用浸膏能直接用于卷煙加香，與煙氣協(xié)調、醇厚甘甜香氣、使煙氣柔和、豐富香氣、改善吸味。
文檔編號C12R1/01GK103224894SQ20121011740
公開日2013年7月31日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權日2012年4月19日
發(fā)明者羅誠浩, 魏敏, 陳義坤, 宋旭艷, 劉冰 申請人:湖北中煙工業(yè)有限責任公司