一種短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，該包括：活化菌種，發(fā)酵培養(yǎng)，獲得含延胡索酸還原酶的混合液，構(gòu)建電化學(xué)催化體系，通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)和高效液相色譜?質(zhì)譜分析電化學(xué)驅(qū)動(dòng)延胡索酸代謝生成琥珀酸的效率。本方法工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，操作簡(jiǎn)便，與傳統(tǒng)催化途徑相比，催化效率明顯提高。CGMCC No.252020080526
【專利說(shuō)明】
-種短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)虎巧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及酶工程領(lǐng)域，主要設(shè)及一種短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)班巧酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 班巧酸，C邊6化，可產(chǎn)生酸味、呈味，可用于豆醬、醬油、日本酒、調(diào)味料等，在食品工 業(yè)中用做調(diào)味劑、酸味劑、緩沖劑，用于火腿、香腸、水產(chǎn)品、調(diào)味液等;班巧酸可W用做防腐 劑，pH值調(diào)節(jié)劑，助溶劑;還可W用來(lái)合成解毒劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、止血藥、合成抗生素 W及 維生素 A、維生素 B等;作為離子馨合劑，班巧酸用于在電鍛行業(yè)防止金屬的溶蝕和點(diǎn)蝕;班 巧酸是一種良好的表面活性劑，是去垢劑、肥皂和破乳劑的組分;班巧酸可生產(chǎn)脫毛劑、牙 膏、清洗劑、高效去皺美容醋;還用于潤(rùn)滑劑、添加劑、彈性體中；紡織品加工中可上漿防收 縮，改進(jìn)染色性，改進(jìn)己內(nèi)酷胺黏度與防火性等。
[0003] 班巧酸存在四種主要的市場(chǎng):最大的市場(chǎng)是作為表面活性劑、清潔劑添加劑和起 泡劑;第二個(gè)市場(chǎng)是作為離子藝合劑，用于在電鍛行業(yè)防止金屬的溶蝕和點(diǎn)蝕;第Ξ個(gè)市場(chǎng) 是在食品行業(yè)中作為酸化劑、K1改良劑、風(fēng)味物質(zhì)和抗菌劑;第四個(gè)市場(chǎng)是和健康有關(guān)的產(chǎn) 品，包括醫(yī)藥、抗生素、氨基酸和維生素的生產(chǎn)。班巧酸能抑制被動(dòng)及主動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)，并 能減少動(dòng)物血清I巧抗體形成;班巧酸對(duì)中眼鏡蛇毒的小鼠有明顯的保護(hù)作用。
[0004] 工業(yè)制法較多，主要有W下幾種:氧化法、加氨法、丙締酸幾基合成法、電解氧化 法、乙烘法、新興的發(fā)酵法。與傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)班巧酸具有諸多優(yōu)點(diǎn)： 生產(chǎn)成本具有競(jìng)爭(zhēng)力；利用可再生的農(nóng)業(yè)資源包括二氧化碳作為原料，避免了對(duì)石化原料 的依賴;減少了化學(xué)合成工藝對(duì)環(huán)境的污染。現(xiàn)有的短桿菌發(fā)酵產(chǎn)班巧酸法建立在傳統(tǒng)的 酶催化體系上，需要輔酶參與W及ATP提供能量，催化效率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)短桿菌催化延胡索酸生成班巧酸過(guò)程中反應(yīng)要求高，需提供輔酶、電 子和小分子物質(zhì)等問(wèn)題，提出一種短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)班巧酸的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)班巧酸的方法，其具體步驟為：
[0007] (1)活化培養(yǎng):將短桿菌NJWGY2133單菌落接入活化培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)液體積裝 液量為15~25%，在轉(zhuǎn)速為160~20化/min,活化培養(yǎng)溫度為30~34°C下活化培養(yǎng)2~3天 后，獲得種子液；
[000引（2)發(fā)酵培養(yǎng)：W2~10%的體積接種量將步驟（1)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 轉(zhuǎn)速為160~2(K)r/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30~34°C下發(fā)酵培養(yǎng)2~3天后，離屯、獲菌絲體，超 聲破碎，冷凍離屯、，獲得含有延胡索酸還原酶的混合液；
[0009] (3)構(gòu)建電化學(xué)催化體系:將步驟(2)獲得的混合液固定在玻碳電極表面后的玻碳 電極作為工作電極，銷絲電極作為對(duì)電極，飽和甘隸電極作為參比電極，電極池液是憐酸鹽 緩沖液，構(gòu)建催化體系;連接電化學(xué)工作站，設(shè)置參數(shù)為:初始電位為-0.2~-IV，高電位為 0.8~IV，低電位為-0.2~-IV，起始掃描極性posi tive，掃描速度為0.1~0.2V/S，掃描段數(shù) 為2~3W，采樣間隔為0.001~0.002￥，靜置時(shí)間為2~33，靈敏度為1心^4~1心〇〇64/乂;在電 極池液中加入體積量為電極池液的10~20 %的延胡索酸液，點(diǎn)擊開(kāi)始采樣，待采樣結(jié)束即 酶反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，得到含班巧酸的電極池液;其中延胡索酸液的濃度為1~2mol/L; [0010] (4)回收:將步驟(3)得到的含班巧酸的電解池液濃縮、萃取、結(jié)晶，即得至峨巧酸。
[OOW 優(yōu)選步驟(1)中活化培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~2.0、酵母 膏0.5~2.0、船(：10.1~0.3、]\%504*7出00.1~0.3;口出％6.5~7.0。
[001^ 優(yōu)選步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/U:葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~1.5、酵母 膏0.5~1.5、船(：10.10~0.50、]\%504*7出00.1~0.4;口出％6.5~7.0。
[0013] 優(yōu)選步驟（2)中離屯、獲菌絲體的離屯、轉(zhuǎn)速為6000~8000r/min，離屯、時(shí)間為15~ 20min;超聲破碎的超聲功率為150~200W，破碎時(shí)間為25~30s，間歇時(shí)間為10~15s;冷凍 離屯、的離屯、轉(zhuǎn)速為8000~12000r/min，離屯、時(shí)間為25~30min。
[0014] 優(yōu)選步驟(3)所述的工作電極由W下方法制備得到，其具體步驟為:玻碳電極表面 鋪滿一層厚度為2~3mm的石墨締聚乙締亞胺混合液，4~5°C驚干后，取步驟(2)獲得的發(fā)酵 混合液，從玻碳電極表面中屯、點(diǎn)開(kāi)始，滴加發(fā)酵混合液，直到鋪滿玻碳電極表面積的50~ 60%，控制發(fā)酵混合液厚度為2~3mm，4~5°C干燥至表面無(wú)液體，制得工作電極。
[0015] 優(yōu)選上述石墨締聚乙締亞胺混合液的濃度為2~3mg/ml;石墨締和聚乙締亞胺體 積比為為5~6:1。
[0016] 優(yōu)選電極池液是濃度為0.1~0.2mmol/L且抑為7.2~7.4的憐酸鹽緩沖液。
[0017] 本發(fā)明所述的一種短桿菌，菌種的拉下學(xué)名化evibacterium sp.。菌種保藏在中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏中屯、登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCC No . 2520，參據(jù)的微生物株NJWGY2133，保藏日期是2008.05.26，保藏地址是:北京市朝陽(yáng)區(qū) 大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0018] 短桿菌具有下述性質(zhì)：
[0019] 1、形態(tài)與培養(yǎng)特征：
[0020] 細(xì)胞形狀:桿狀，端圓，（1.4 X 1.7)μπι X 0.祉m，單個(gè)排列，無(wú)芙膜，不運(yùn)動(dòng)，革蘭氏 陽(yáng)性。在平板培養(yǎng)基上菌落呈圓形，平坦光滑，全緣，灰色，偶爾產(chǎn)生微黃色素。
[0021] 2、生理生化特性：
[0022] 短桿菌的主要生理生化特征見(jiàn)表1:
[0023] 表1菌株的生理生化特征
[0024：
[0025：
[0026] 注:+ :陽(yáng)性或生長(zhǎng)；一:陰性或不生長(zhǎng)
[0027] 有益效果：
[0028] 本發(fā)明公開(kāi)了一種短桿菌及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)班巧酸的工藝方法，具有W下優(yōu) 占 . y ?、、·
[0029] (1)我們篩選到一株短桿菌，能催化延胡索酸生成產(chǎn)班巧酸。
[0030] (2)本發(fā)明使用的短桿菌能產(chǎn)生高酶活的延胡索酸還原酶，該酶可將延胡索酸還 原成班巧酸，班巧酸回收率在70~85%。傳統(tǒng)的催化過(guò)程需要輔酶提供電子，本發(fā)明利用短 桿菌發(fā)酵液和電極構(gòu)建電化學(xué)催化體系，用電極代替輔酶給發(fā)酵液中延胡索酸還原酶將延 胡索酸還原生成班巧酸，得到循環(huán)伏安圖，通過(guò)譜圖可W得到短桿菌發(fā)酵液中延胡索酸還 原酶催化延胡索酸生成班巧酸的能力；用高效液相色譜-質(zhì)譜連用檢測(cè)班巧酸含量。與傳統(tǒng) 方法相比，其他條件相同且適宜，發(fā)現(xiàn)在相同底物量和催化生成等量產(chǎn)物條件下，本發(fā)明催 化效率提高5倍W上。
【具體實(shí)施方式】
[0031] W下結(jié)合實(shí)例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施案例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限 定。
[0032] W下例子中設(shè)及到的傳統(tǒng)催化途徑一般為：
[0033] a、活化培養(yǎng):將短桿菌NJWGY2133單菌落接入活化培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)基裝液量為 15~25%，活化培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~2.0、酵母膏0.5~2.0、 胞(：10.1~0.3、]\%504?7出0 0.1~0.3;控制活化培養(yǎng)溫度為30~34°(：，口出％6.5~7.0，轉(zhuǎn) 速為160~20化/min;活化培養(yǎng)2~3天后，獲得種子液；
[0034] b、發(fā)酵培養(yǎng)：W2~10%的體積接種量將步驟(a)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā) 酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~1.5、酵母膏0.5~1.5、化C1 0.10~ 0.50、MgS〇4 · 7此0 0.1~0.4;控制發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30~34°C，pH為6.5~7.0，轉(zhuǎn)速為160~ 20化/min;發(fā)酵培養(yǎng)2~3天后，6000~8000r/min離屯、獲菌絲體，超聲(功率150~200W，破碎 25~30s，間歇10~15s)破碎，8000~12000r/min冷凍離屯、25~30min，獲得含有延胡索酸還 原酶的混合液。
[0035] C、催化體系：步驟(b)混合液中加入1~2mol/L的延胡索酸溶液，體積量為混合液 的10~15 %，混合均勻，控制反應(yīng)溫度為30~34°C，pH為6.5~7.0，反應(yīng)30~40min后，取混 合液ImL，稀釋50倍，用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)班巧酸含量：采用C18柱，流動(dòng)相為0.1~ 0.2mol/L的拉冊(cè)〇4和5~6 %的甲醇，流速為0.5~0.8mL/min，柱溫為26~28°C，波長(zhǎng)為210~ 220nm，得到色譜圖，得到班巧酸的色譜峰及對(duì)應(yīng)的峰面積值為20~44mA腫S。
[0036] 實(shí)施例1:
[0037] (1)活化培養(yǎng):將短桿菌NJWGY2133單菌落接入活化培養(yǎng)基中，控制裝液量15%，活 化培養(yǎng)溫度為34 °C，抑為7.0，轉(zhuǎn)速為18化/min，培養(yǎng)2天，獲得種子液;其中活化培養(yǎng)基成分 為(邑/1):葡萄糖1.0、蛋白腺2.0、酵母膏2.0、船(：10.3、]\%504*7出0 0.3。
[0038] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：W5%的體積接種量將步驟（1)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培 養(yǎng)溫度為34°C，pH為7.0，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)2天，8000r/min離屯、20min獲菌絲體，用KQ- 1001型超聲機(jī)(功率200W，破碎30s，間歇10S-15S)超聲破碎，12000r/min冷凍離屯、30min，獲 得含有延胡索酸還原酶的混合液;其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為（g/L):葡萄糖1.0、蛋白腺1.5、 酵母膏 1.5、NaCl 0.50、]\%5〇4*7出00.4。
[0039] (3)構(gòu)建電化學(xué)催化體系：取玻碳電極，表面鋪滿一層石墨締聚乙締亞胺混合液， 該混合液濃度為2mg/ml，體積比為石墨締：聚乙締亞胺=6:1，厚度為2mm，4°C驚干之后；取 步驟(2)獲得的發(fā)酵混合液，從玻碳電極表面中屯、點(diǎn)開(kāi)始，滴加發(fā)酵混合液，直到鋪滿玻碳 電極表面積的50%，發(fā)酵混合液厚度為2mm，4°C干燥至表面無(wú)液體之后，該玻碳電極作為工 作電極，銷絲電極作為對(duì)電極，飽和甘隸電極作為參比電極，電極池液是濃度為為O.lmmol/ L、pH = 7.2的憐酸鹽緩沖液，構(gòu)建催化體系；連接電化學(xué)工作站，選擇循環(huán)伏安法，設(shè)置參 數(shù):初始電位為-0.2V，高電位為0.8V，低電位為-0.2V，起始掃描極性positive，掃描速度為 0.1 V/s，掃描段數(shù)為2W，采樣間隔為0.001V，靜置時(shí)間為2s，靈敏度為1. e^^A/v。電極池液 加入體積量15 %、濃度為1.5mo 1 /L的延胡索酸液，點(diǎn)擊開(kāi)始采樣，2min后，采樣結(jié)束即酶反 應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，得到的電極池液含班巧酸;得到的循環(huán)伏安圖即為循環(huán)伏安法對(duì)催化體 系催化延胡索酸產(chǎn)班巧酸電化學(xué)行為的檢測(cè)，通過(guò)譜圖可w得到短桿菌發(fā)酵液中延胡索酸 還原酶催化延胡索酸生成班巧酸的能力大大提高。
[0040] (4)產(chǎn)量檢測(cè):取步驟(3)的電極池液ImL，稀釋50倍，用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)班 巧酸含量;采用C18柱，流動(dòng)相為0.1mol/L的K2HP化和5%的甲醇，流速為0.5mL/min，柱溫為 26°C，波長(zhǎng)為210nm，得到色譜圖，得到班巧酸的色譜峰及對(duì)應(yīng)的峰面積值為202.4mAU*S，是 傳統(tǒng)催化途徑得到的最大值的4.6倍。
[0041] (5)班巧酸回收:將上述含班巧酸的電解池液濃縮、萃取、結(jié)晶，即可得到班巧酸， 回收率為85 %。
[0042] 實(shí)施例2:
[0043] (1)活化培養(yǎng):將短桿菌NJWGY2133單菌落接入活化培養(yǎng)基中，控制裝液量20%，活 化培養(yǎng)溫度為30°C，抑為6.5，轉(zhuǎn)速為16化/min，培養(yǎng)2天，獲得種子液;其中活化培養(yǎng)基成分 為(邑/1):葡萄糖2.0、蛋白腺1.0、酵母膏1.0、船(：10.2、1邑504.7出0 0.2。
[0044] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：W2%的體積接種量將步驟（1)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培 養(yǎng)溫度為30°C，pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160r/min，培養(yǎng)2天，7000r/min離屯、15min獲菌絲體，用KQ- 1001型超聲機(jī)(功率180W，破碎28s，間歇12s)超聲破碎，lOOOOr/min冷凍離屯、28min，獲得含 有延胡索酸還原酶的混合液;其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖2.0、蛋白腺1.0、酵母膏 1.0、船(：10.25、]\%5〇4*7出0 0.2。
[0045] (3)構(gòu)建電化學(xué)催化體系：取玻碳電極，表面鋪滿一層石墨締聚乙締亞胺混合液， 該混合液濃度為2.5mg/ml，體積比為石墨締：聚乙締亞胺= 5:1，厚度為2.5mm，5°C驚干之 后;取步驟(2)獲得的發(fā)酵混合液，從玻碳電極表面中屯、點(diǎn)開(kāi)始，滴加發(fā)酵混合液，直到鋪滿 玻碳電極表面積的55%，發(fā)酵混合液厚度為2.5mm，5°C干燥至表面無(wú)液體之后，該玻碳電極 作為工作電極，銷絲電極作為對(duì)電極，飽和甘隸電極作為參比電極，電極池液為〇.15mmol/ L、pH = 7.3的憐酸鹽緩沖液，構(gòu)建催化體系；連接電化學(xué)工作站，選擇循環(huán)伏安法，設(shè)置參 數(shù):初始電位為-1.0V，高電位為1.0V，低電位為-1.0V，起始掃描極性positive，掃描速度為 0.1 V/s，掃描段數(shù)為2W，采樣間隔為0.00IV，靜置時(shí)為3s，靈敏度為1. e^^A/v;電極池液加 入體積量10%、濃度為Imol/L的延胡索酸液，點(diǎn)擊開(kāi)始采樣，3min后，采樣結(jié)束即酶反應(yīng)達(dá) 到飽和狀態(tài)，得到的電極池液含班巧酸;得到循環(huán)伏安圖即為循環(huán)伏安法對(duì)催化體系催化 延胡索酸產(chǎn)班巧酸電化學(xué)行為的檢測(cè)，通過(guò)譜圖可W得到短桿菌發(fā)酵液中延胡索酸還原酶 催化延胡索酸生成班巧酸的能力提高了。
[0046] (4)產(chǎn)量檢測(cè):取步驟(3)的電極池液ImL，稀釋50倍，用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)班 巧酸含量;采用C18柱，流動(dòng)相為0.1mol/L的K2HP化和6%的甲醇，流速為0.6mL/min，柱溫為 27°C，波長(zhǎng)為21化m，得到色譜圖，得到班巧酸的色譜峰及對(duì)應(yīng)的峰面積值為171.6mAU*S， 是傳統(tǒng)催化途徑得到的最大值的3.9倍。
[0047] (5)回收:將上述含班巧酸的電解池液濃縮、萃取、結(jié)晶，即可得到班巧酸，回收率 為 82%。
[004引實(shí)施例3:
[0049] (1)活化培養(yǎng):將短桿菌NJWGY2133單菌落接入活化培養(yǎng)基中，控制裝液量25%，活 化培養(yǎng)溫度為32°C，抑為6.8，轉(zhuǎn)速為20化/min，培養(yǎng)3天，獲得種子液;其中活化培養(yǎng)基成分 為(邑/1):葡萄糖3.0、蛋白腺0.5、酵母膏0.5、船(：10.1、]\%504*7出0 0.1。
[0050] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：W2.5%的接種量將步驟(1)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng) 溫度為32°C，pH為6.8，轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)3天，6000r/min離屯、20min獲上菌絲體，用KQ- 1001型超聲機(jī)(功率150W，破碎25s，間歇10s)超聲破碎，80(K)r/min冷凍離屯、25min，獲得混 合液；其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為（g/L):葡萄糖1.0、蛋白腺0.5、酵母膏0.5、化C1 0.10、 MgS〇4· 7出0 0.1。
[0051] (3)構(gòu)建電化學(xué)催化體系：取玻碳電極，表面鋪滿一層石墨締聚乙締亞胺混合液， 該混合液濃度為3mg/ml，體積比為石墨締：聚乙締亞胺=6:1，厚度為3mm，4°C驚干之后；取 步驟(2)獲得的發(fā)酵混合液，從玻碳電極表面中屯、點(diǎn)開(kāi)始，滴加發(fā)酵混合液，直到鋪滿玻碳 電極表面積的60%，發(fā)酵混合液厚度為3mm，4°C干燥至表面無(wú)液體之后，該玻碳電極作為工 作電極，銷絲電極作為對(duì)電極，飽和甘隸電極作為參比電極，電極池液為〇.2mmol/L、pH = 7.4的憐酸鹽緩沖液，構(gòu)建催化體系;連接電化學(xué)工作站，選擇循環(huán)伏安法，設(shè)置參數(shù):初始 電位為-1.0V，高電位為1.0V，低電位為-1.0V，起始掃描極性positive,掃描速度為O.lV/s， 掃描段數(shù)為2W，采樣間隔為0.001V，靜置時(shí)為2s，靈敏度為l.e^?6A/V;電極池液加入體積量 20%、濃度為2mol/L的延胡索酸液，點(diǎn)擊開(kāi)始采樣，2min后，采樣結(jié)束即酶反應(yīng)達(dá)到飽和狀 態(tài)，得到的電極池液含班巧酸;得到循環(huán)伏安圖即為循環(huán)伏安法對(duì)催化體系催化延胡索酸 產(chǎn)班巧酸電化學(xué)行為的檢測(cè)，通過(guò)譜圖可W得到短桿菌發(fā)酵液中延胡索酸還原酶催化延胡 索酸生成班巧酸的能力稍有提高。
[0052] (4)產(chǎn)量檢測(cè)：取步驟(3)的電極池液ImL，稀釋50倍，用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)班 巧酸含量。采用C18柱，流動(dòng)相為0.2mol/L的K2HP化和5 %的甲醇，流速為0.8mL/min，柱溫28 °C，波長(zhǎng)為220nm，得到色譜圖，得到班巧酸的色譜峰及對(duì)應(yīng)的峰面積值為158.4mAU*S，是傳 統(tǒng)催化途徑得到的最大值的3.6倍。
[0053] (5)班巧酸回收:將上述含班巧酸的電解池液濃縮、萃取、結(jié)晶，即可得到班巧酸， 回收率為88 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，其具體步驟為： (1) 活化培養(yǎng):將短桿菌NJWGY2133單菌落接入活化培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)液體積裝液量 為15~25%，在轉(zhuǎn)速為160~200r/min，活化培養(yǎng)溫度為30~34°C下活化培養(yǎng)2~3天后，獲 得種子液； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：以2~10%的體積接種量將步驟(1)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速 為160~200r/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30~34 °C下發(fā)酵培養(yǎng)2~3天后，離心獲菌絲體，超聲破 碎，冷凍離心，獲得含有延胡索酸還原酶的混合液； (3) 構(gòu)建電化學(xué)催化體系:將步驟(2)獲得的混合液固定在玻碳電極表面后的玻碳電極 作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，飽和甘汞電極作為參比電極，電極池液是磷酸鹽緩沖 液，構(gòu)建催化體系;連接電化學(xué)工作站，設(shè)置參數(shù)為:初始電位為-〇. 2~-IV，高電位為0.8~ IV，低電位為-0.2~-IV，起始掃描極性posi tive，掃描速度為0.1~0.2V/s，掃描段數(shù)為2~ 3W，采樣間隔為0.001~0.002V，靜置時(shí)間為2~3s，靈敏度為l.e__~l.e+^A/V;在電極池 液中加入體積量為電極池液的10~20%的延胡索酸液，點(diǎn)擊開(kāi)始采樣，待采樣結(jié)束即酶反 應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，得到含琥珀酸的電極池液;其中延胡索酸液的濃度為1~2mol/L; (4) 回收:將步驟(3)得到的含琥珀酸的電解池液濃縮、萃取、結(jié)晶，即得到琥珀酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中活化培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄 糖1.0~3.0、蛋白胨0.5~2.0、酵母膏0.5~2.0、NaC10.1~0.3、MgS〇4 · 7H20 0.1~0·3;ρΗ 為6.5~7.0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄 糖 1.0~3.0、蛋白胨0.5~1.5、酵母膏0.5~1.5、NaCl 0.10~0.50、MgS〇4 · 7H20 0.1 ~0.4; pH為6.5~7.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中離心獲菌絲體的離心轉(zhuǎn)速為 6000~8000r/min，離心時(shí)間為15~20min;超聲破碎的超聲功率為150~200W，破碎時(shí)間為 25~30s，間歇時(shí)間為10~15s;冷凍離心的離心轉(zhuǎn)速為8000~12000r/min，離心時(shí)間為25~ 30min〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)所述的工作電極由以下方法制備 得到，其具體步驟為:玻碳電極表面鋪滿一層厚度為2~3mm的石墨烯聚乙烯亞胺混合液，4 ~5°C晾干后，取步驟(2)獲得的發(fā)酵混合液，從玻碳電極表面中心點(diǎn)開(kāi)始，滴加發(fā)酵混合 液，直到鋪滿玻碳電極表面積的50~60%，控制發(fā)酵混合液厚度為2~3_，4~5°C干燥至表 面無(wú)液體，制得工作電極。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于石墨烯聚乙烯亞胺混合液的濃度為2~3mg/ ml;石墨烯和聚乙烯亞胺體積比為為5~6:1。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于電極池液是濃度為0.1~0.2mmol/L且pH為 7.2~7.4的磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號(hào)】C12R1/13GK106011186SQ201610596670
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月25日
【發(fā)明人】胡永紅, 于燁敏, 楊文革, 周俊, 曹洋, 馬小平
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)