一種重組人胸腺肽α1的制備方法
【專利摘要】一種應(yīng)用于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】中的重組人胸腺肽α1的制備方法，所述方法包括步驟，人工合成胸腺肽α1四串體的全基因序列，具體設(shè)計(jì)為：在天然胸腺肽α1序列前面加上核酸限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、羥胺切割位點(diǎn)天冬酰胺-甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在每兩個天然胸腺肽α1序列之間加上甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在天然胸腺肽α1序列后面加上終止密碼子、核酸限制性內(nèi)切酶XhoⅠ對應(yīng)的核苷酸；采用雙酶切方法將胸腺肽α1四串體基因克隆至pGEX-4T-2質(zhì)粒相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-4T-2-4Tα1，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到基因工程菌，在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)。該發(fā)明采用基因工程技術(shù)制備重組胸腺肽α1，以克服化學(xué)合成成本高且污染環(huán)境，解決串聯(lián)Tα1下游裂解濃度低的問題，投入少，產(chǎn)出高，利潤空間大，作用機(jī)理獨(dú)特，效果明顯。
【專利說明】一種重組人胸腺肽Ct 1的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】中的一種重組人胸腺肽α I的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺肽α I (Thymosina I,Ta I )，2010年進(jìn)入中國藥典后改名為胸腺法新。Ta I是一種酸性多肽，含有28個氨基酸，pi為4.2，相對分子量為3066kD (N端乙?；臑?108kD),不含甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸，無二硫鍵及糖基化，唯一的修飾是N端乙?；?，氨基酸序列如下:
N—Ser—Asp—Ala—Ala—Val—Asp—Thr—Ser—Ser—Glu—Ile—Thr—Thr—Lys—Asp—Leu—Lys—Glu— Lys—Lys ~Glu—Val—Val—Glu—Glu—Ala—Glu—Asn—C。在Ta I的一級結(jié)構(gòu)中存在丙一丙、絲一絲、蘇一蘇、賴一賴、纟顏一纟顏、谷一谷等6處氨基酸重復(fù)序列，約占總量的一半，這在其他活性多肽中未曾見過。在水中Ta I無特殊的構(gòu)型；在雙十四烷基磷脂酰膽堿與二羥甲基丙酸(10:1)的單層囊泡、十二烷基硫酸鈉溶液內(nèi)或鋅離子出現(xiàn)時，Tal呈現(xiàn)部分空間構(gòu)型；在疏水性較強(qiáng)的三氟乙醇中Ta I出現(xiàn)2個區(qū)域特征，即β轉(zhuǎn)角和α螺旋，轉(zhuǎn)角位于第5和8個殘基之間，a螺旋構(gòu)型位于第17和24殘基之間。隨環(huán)境而發(fā)生的構(gòu)型變化是胸腺肽a I與淋巴細(xì)胞相互作用所必需的，與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及淋巴細(xì)胞激活機(jī)制有關(guān)。
[0003]Ta I是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，主要是T淋巴系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)劑。Ta I可以恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的功能并促進(jìn)成熟T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)淋巴細(xì)胞在病原組織周圍的聚集，促進(jìn)淋巴因子及淋巴因子受體的產(chǎn)生。在臨床上經(jīng)常將Ta I作為免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑用于各種免疫缺陷病和免疫受抑制疾病的治療，已應(yīng)用于治療乙肝、丙肝、癌癥等疾病。
[0004]天然的Tal其N端被乙?；?。有文獻(xiàn)報(bào)道，去乙?；腡 a I同樣具有生物學(xué)活性。Ta I最早是Goldstin等從牛胸腺組織提取的胸腺素組份5 (TF5)中分離出來的，現(xiàn)已用固相多肽合成技術(shù)成功合成，目前臨床所用的Ta I制劑為化學(xué)合成制劑，而使用化學(xué)合成方法生產(chǎn)的N端乙?；腡 a 1，不僅成本高，價(jià)格昂貴，且制備要求條件高，污染環(huán)境等。
[0005]利用基因工程技術(shù)制備重組T a I是解決上述問題的最佳途徑。但是由于T a I分子量較小，給制備重組Ta I帶來一定的技術(shù)困難。如表達(dá)單體Ta I時，由于其分子量只有3.0kD，使其在下游的分離純化過程中難度很大；亦有報(bào)道將Ta In (η為2_8)基因串聯(lián)起來，表達(dá)η個串聯(lián)的T a 1，后續(xù)采用裂解技術(shù)將其分為單體T a 1，如羥胺裂解、胰蛋白酶降解方法。由于胰蛋白酶降解方法不但成本高，而且特異性低，所以不適合工業(yè)化生產(chǎn)；羥胺裂解法由于條件劇烈，鹽濃度要求高，導(dǎo)致蛋白溶解量很低，僅為0.02mg/ml，為后續(xù)的規(guī)模化生產(chǎn)帶來困難。本發(fā)明提供的羥胺蛋白裂解方法可將蛋白溶解濃度提高到10mg/ml，大大提高了裂解效率和重組Ta I單體的產(chǎn)量。因此，研究開發(fā)一種重組人胸腺肽a I的制備方法是目前亟待解決的新課題。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種重組人胸腺肽α I的制備方法，該方法采用基因工程技術(shù)制備重組胸腺肽α 1，以克服化學(xué)合成成本高且污染環(huán)境等缺點(diǎn)，解決了串聯(lián)Ta I下游裂解濃度低的問題，不受自然資源的限制，可根據(jù)市場需求不限量的生產(chǎn)，具有投入少，產(chǎn)出高，利潤空間大，作用機(jī)理獨(dú)特，效果明顯，無或低毒副作用。
[0007]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種重組人胸腺肽a I的制備方法，所述方法包括步驟如下，
(1)人工合成胸腺肽a1四串體的全基因序列，具體設(shè)計(jì)為:在天然胸腺肽a I序列前面加上核酸限制性內(nèi)切酶EcoR I、羥胺切割位點(diǎn)天冬酰胺-甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在每兩個天然胸腺肽a I序列之間加上甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在天然胸腺肽a I序列后面加上終止密碼子、核酸限制性內(nèi)切酶Xho I對應(yīng)的核苷酸；
(2)采用雙酶切方法將胸腺肽aI四串體基因克隆至pGEX-4T-2質(zhì)粒相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-4T-2_4Ta 1，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到基因工程菌，在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)；
(3)重組胸腺肽aI的制備與純化，具體方法是:重組胸腺肽a I四串體包涵體的溶解；重組胸腺肽a I四串體的純化；重組胸腺肽a I四串體的裂解；重組胸腺肽a I單體的純化；
所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I四串體包涵體的溶解是將包涵體按2%的比例溶解于3%的SDS溶液中，40°C，磁力攪拌溶解12-15小時；所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I四串體的純化是將包涵體溶液直接經(jīng)過Suppose 12層析柱，收集重組胸腺肽a I四串體存在于洗脫主峰；所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I四串體的裂解是將重組胸腺肽a I四串體的洗脫峰溶液對20mM Tris, pH9.0的緩沖液透析，然后于45°C、pH9.0條件下，經(jīng)終濃度為2.0M的羥胺裂解4h，即得單體胸腺肽a I ;所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I單體的純化是將裂解后的含單體胸腺肽a I的溶液直接經(jīng)過Sephadex G_25層析柱去鹽，然后經(jīng)HPLC制備液相精細(xì)純化。
[0008]本發(fā)明的要點(diǎn)在于重組人胸腺肽α I的制備方法。其制備工藝基本原理是:(1)單體胸腺肽α?分子量較小，不利于下游的分離純化，將其四個串聯(lián)起來可以很好的進(jìn)行后續(xù)純化工藝。(2)建立羥胺裂解條件，不但提高了蛋白裂解濃度，也大大提升了裂解效率和單體胸腺肽α I的產(chǎn)量。(3)利用反相高效液相色譜法進(jìn)行純化可以很好地提高蛋白純度。
[0009]一種重組人胸腺肽α I的制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有該方法采用基因工程技術(shù)制備重組胸腺肽α 1，以克服化學(xué)合成成本高且污染環(huán)境等缺點(diǎn)，解決了串聯(lián)Ta I下游裂解濃度低的問題，不受自然資源的限制，可根據(jù)市場需求不限量的生產(chǎn)，具有投入少，產(chǎn)出高，利潤空間大，作用機(jī)理獨(dú)特，效果明顯，無或低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，將廣泛的應(yīng)用于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0011]圖1是PGEX-4T-2-4T a I原核表達(dá)載體構(gòu)建方案圖。
[0012]圖2是表達(dá)載體的酶切圖譜。[0013]圖3是發(fā)酵菌體表達(dá)的重組胸腺肽α I四串體圖。
[0014]圖4是HPLC液相分離純化結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下實(shí)施例將有助于對本發(fā)明的了解，但這些實(shí)施例僅為了對本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。
[0016]實(shí)施例一
1.構(gòu)建胸腺肽α I四串體融合表達(dá)載體pGEX-4T-2-4Ta I。
[0017]將含胸腺肽a I四串體的質(zhì)粒與pGEX-4T-2質(zhì)粒分別用EcoT? I，Xho I雙酶切，然后連接，構(gòu)建胸腺肽a I四串體融合表達(dá)載體pGEX-4T-2_4Ta I (如圖1、圖2所示)。
[0018]2.重組胸腺肽a I四串體的發(fā)酵及高效表達(dá)，具體是:工程菌的活化、發(fā)酵、誘導(dǎo)及包涵體的回收:取_70°C保存的工程菌株接種到含Amp的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12-15小時；挑取單個菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)12-15小時；將菌液按1:100比例接種到含Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，37°C搖床培養(yǎng)12-15小時；將菌液按1:10比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，37°C條件下培養(yǎng)；待菌液濃度達(dá)到0D_約為2.0后，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時，同時小量持續(xù)補(bǔ)加填料液，氨水自動調(diào)節(jié)pH7.0。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，菌體用TE緩沖液懸浮，冰浴條件下，超聲破碎菌體，反復(fù)4次。離心破碎后的菌體，收集沉淀，即為包涵體(如圖3所示)。
[0019]3.重組胸腺肽a I四串體的溶解及純化，具體是:
3.1包涵體的洗滌和溶解:稱取適量包涵體,加入包涵體洗滌液洗滌2次后，按照2%的比例加入包涵體溶解液，室溫下，磁力攪拌溶解12-15小時；4°C，9000rpm,離心lOmin，收集上清液，立即純化。
[0020]3.2重組胸腺肽a I四串體的純化:用平衡液平衡Superose-12層析柱，將上述溶解液濃縮后上樣，流速為2.5ml/min ;用平衡液洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS蛋白電泳鑒定，目的蛋白存在于I號洗脫峰中。
[0021]3.3重組胸腺肽a I四串體的裂解:將上述I號洗脫峰樣品對20mM Tris，pH9.0的緩沖液透析過夜，每4小時換液一次，然后于45°C、pH9.0條件下，經(jīng)終濃度為0.1M的Tris，
2.0M的鹽酸羥胺裂解4h，用無水甲酸調(diào)pH4.0左右終止裂解反應(yīng)，即得單體胸腺肽a I。
[0022]3.4重組胸腺肽a I單體的純化:用平衡液平衡S^hadex G_25層析柱，將上述裂解后的樣品上樣去鹽，流速為5ml/min，用平衡液洗脫，收集洗脫峰，采用尿素電泳鑒定。然后采用色譜系統(tǒng)為流動相A:0.1%TFA ;流動相B:90%乙腈/水(含0.1%TFA)； 10%-50%B線性梯度洗脫，流速2ml/min, 50min內(nèi)，得到純度大于95%的胸腺肽α I單體(如圖4所示)。
[0023]4.上述各液體配方范圍及準(zhǔn)備如下:
(I)LB液體培養(yǎng)基:以1000ml為單位按下列比例配制，溶解后高壓滅菌。胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl IOgo
[0024](2)發(fā)酵培養(yǎng)基:以1000ml為單位按下列比例配制，溶解后高壓滅菌。胰蛋白胨 IOg,酵母提取物 5g, NaCl lg, CaCl2 0.lg, NH4Cl 1.5g,葡萄糖 5g (115°C,單獨(dú)高壓)，NaH2PO4.2H20 1.5g, Na2HPO4.12H20 6g。
[0025](3) lmol/L IPTG:過濾除菌，_20°C保存。IPTG 0.48g，水 20ml。[0026](4)氨節(jié)青霉素(Amp):應(yīng)用濃度為 100 μ g/ml。Amp 0.5g,水 5ml。
[0027](5)包涵體洗滌液:以1000ml為單位按下列比例配制。Tris 1.21g，TritonX-1OOI ml，調(diào) ρΗ8.0 并補(bǔ)水至 1000ml0
[0028](6)包涵體溶解液:以100 ml為單位按下列比例配制。SDS 3g，補(bǔ)水至100ml。
[0029](7)Superose 12層析柱平衡液:以1000ml為單位按下列比例配制。Tris 1.21g,SDS 1.0g，調(diào) ρΗ8.5 并補(bǔ)水至 100ml0
[0030](8) Sephadex G-25平衡液:以1000ml為單位按下列比例配制。IM Tris 50ml,NaCl 5.85g，0.5M EDTA 2ml，調(diào) ρΗ8.0 并補(bǔ)水至 100ml。
[0031]在圖2中M:分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為2000、1000、750、500、250、100bp ;1_10:
表達(dá)載體PGEX-4T-2-4T α I的酶切圖譜。在圖3中M:分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為97.2、66.7,44.3,29.8kD ;1、2:誘導(dǎo)表達(dá)菌體沉淀；3:未誘導(dǎo)菌體沉淀。
【權(quán)利要求】
1.一種重組人胸腺肽α I的制備方法，其特征在于:所述方法包括步驟如下， (1)人工合成胸腺肽αI四串體的全基因序列，具體設(shè)計(jì)為:在天然胸腺肽α I序列前面加上核酸限制性內(nèi)切酶EcoR 1、羥胺切割位點(diǎn)天冬酰胺-甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在每兩個天然胸腺肽αI序列之間加上甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在天然胸腺肽αI序列后面加上終止密碼子、核酸限制性內(nèi)切酶Xho I對應(yīng)的核苷酸； (2)采用雙酶切方法將胸腺肽αI四串體基因克隆至pGEX-4T-2質(zhì)粒相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-4T-2_4Ta 1，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到基因工程菌，在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)； (3)重組胸腺肽aI的制備與純化，具體方法是:重組胸腺肽a I四串體包涵體的溶解；重組胸腺肽a I四串體的純化；重組胸腺肽a I四串體的裂解；重組胸腺肽a I單體的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人胸腺肽aI的制備方法，其特征在于:所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I四串體包涵體的溶解是將包涵體按2%的比例溶解于3%的SDS溶液中，40°C，磁力攪拌溶解12-15小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人胸腺肽aI的制備方法，其特征在于:所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I四串體的純化是將包涵體溶液直接經(jīng)過Suppose 12層析柱，收集重組胸腺肽a I四串體存在于洗脫主峰。
4.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的一種重組人胸腺肽aI的制備方法，其特征在于:所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I四串體的裂解是將重組胸腺肽a I四串體的洗脫峰溶液對20mMTris, pH9.0的緩沖液透析，然后于45°C、pH9.0條件下，經(jīng)終濃度為2.0M的羥胺裂解4h，即得單體胸腺肽a I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人胸腺肽aI的制備方法，其特征在于:所述方法的步驟(3)重組胸腺肽a I單體的純化是將裂解后的含單體胸腺肽a I的溶液直接經(jīng)過Sephadex G_25層析柱去鹽，然后經(jīng)HPLC制備液相精細(xì)純化。
【文檔編號】C12N15/16GK103789321SQ201410060711
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】蘇顯英, 趙洪禮, 王艷, 林海, 梁志敏, 陳錚 申請人:東北制藥集團(tuán)股份有限公司