一種瘤胃綠色熒光蛋白gfp基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌，是含有原核表達(dá)載體pET15b-EGFP的瘤胃溶纖維丁酸弧菌；所述原核表達(dá)載體pET15b-EGFP是將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因亞克隆連接入原核表達(dá)載體pET15b的BamH1位點(diǎn)而得到。本發(fā)明的瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌可用于瘤胃微生態(tài)微循環(huán)消化代謝檢測。利用GFP基因進(jìn)行基因操作、標(biāo)記目標(biāo)蛋白，即可通過這種生物“攝像頭”實(shí)時監(jiān)控靶蛋白的時間、空間變化。
【專利說明】一種瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種反芻動物瘤胃微生態(tài)研究檢測用的瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，反芻動物的消化中重要的消化過程之一是瘤胃微生物的消化(朱偉云，2004)。但由于瘤胃微生態(tài)研究的難度較大，目前還都局限于營養(yǎng)素在瘤胃中的消化率、瘤胃優(yōu)勢菌群的培養(yǎng)，或用藥物控制瘤胃微生物等的研究(Koenig等，2000 ;韓春艷等，2002 ；Hristov等，2004)。對于瘤胃微生態(tài)中微生物之間的互作，如細(xì)菌與原蟲、真菌的共生；原蟲對細(xì)菌、真菌的吞噬等還都不得而知，其主要原因就是對于這一黑箱還沒有更好的研究方法。為此，同位素標(biāo)記方法也曾經(jīng)用于瘤胃細(xì)菌標(biāo)記(劉翔等，2010)，但此方法涉及特殊設(shè)備并存在一定的環(huán)境問題，而不適宜于一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)測定使用。我們實(shí)驗(yàn)室前期探索的熒光素(Fluorescein)染料標(biāo)記瘤胃細(xì)菌，但研究的也是染色后是靜態(tài)的死細(xì)菌(王夢芝等，2010)，沒有所標(biāo)記細(xì)菌的繁殖生長，不能夠完全反應(yīng)瘤胃真實(shí)的動態(tài)狀態(tài)。因此亟待解決的關(guān)鍵問題是瘤胃微生態(tài)亮化的研究方法。
[0003]在Aequorea victoria水母中發(fā)現(xiàn)的綠色突光蛋白GFP只需藍(lán)光激發(fā)就能發(fā)光。而且GFP其相容性強(qiáng)，沒有種屬、組織等特異性，通過基因重組水母外的生物也產(chǎn)生了 GFP，如:熒光的菌、鼠、兔、豬等相繼培育成功。由于GFP的特殊結(jié)構(gòu)與性能，利用其做生物標(biāo)記工具的研究逐漸增多(Cha lfie等，1994 ;黃倩和李川源，2001 ；Southward和Surette,2002 ；DeBlasio 等，2010)。
[0004]瘤胃細(xì)菌種類繁多,據(jù)研究表明有200余種,其中溶纖維丁酸弧菌(ButyrivibriofibrivoIen )具有較寬的底物代謝范圍,在瘤胃中廣泛存在,是理想的基因受體。目前已經(jīng)構(gòu)建成功木聚糖酶基因的溶纖維丁酸弧菌重組菌(Flint和Scott，2000)。若轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白基因，構(gòu)建綠色熒光蛋白基因工程溶纖丁弧菌，用之即可亮化瘤胃微生態(tài)環(huán)境，實(shí)時、客觀記錄瘤胃微生態(tài)微生物的動態(tài)觀察，研究瘤胃微生態(tài)消化代謝規(guī)律和機(jī)制。
[0005]本發(fā)明即是基于瘤胃細(xì)菌GFP工程菌的改造，提供一種能夠進(jìn)行瘤胃微循環(huán)檢測的瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白基因工程菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了突破目前不能真實(shí)模擬和反應(yīng)瘤胃微生態(tài)的狀態(tài)，而不能進(jìn)行客觀研究瘤胃微生態(tài)互作等的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種瘤胃微生態(tài)研究用的瘤胃溶纖丁酸弧菌綠色熒光蛋白基因工程菌(RGFPB)的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明所述的瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌，宿主菌為瘤胃溶纖維丁酸弧菌，宿主菌中含有原核表達(dá)載體pET15b-EGFP ;所述原核表達(dá)載體pET15b_EGFP是將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因亞克隆連接入原核表達(dá)載體pET15b的BamHl位點(diǎn)而得到。[0008]所述瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌通構(gòu)建方法是:采用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因，PCR擴(kuò)增其編碼序列；將所擴(kuò)增序列亞克隆連接入原核表達(dá)載體pET15b，構(gòu)建得到pET15b-EGFP ;氯化鈣法致敏瘤胃溶維纖酸丁弧菌，轉(zhuǎn)化入所構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET15b-EGFP ;轉(zhuǎn)化后平板上培養(yǎng)24~36h，熒光或紫外光下觀察，有綠色熒光的菌落則為陽性克隆。
[0009]本發(fā)明還公開了所述瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌在瘤胃微循環(huán)檢測中的檢測與應(yīng)用。
[0010]所述的檢測，例如瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌綠色熒光蛋白表達(dá)性能測試方法為:用液體和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)瘤胃GFP基因工程菌24~36h。用722型分光光度計(jì)測定(600nm檢測)并制作液體培養(yǎng)基中瘤胃GFP基因工程菌生長曲線、用SpectraMaxM5多功能讀板機(jī)測定液體培養(yǎng)基中工程菌熒光強(qiáng)度(510nm檢測)；用熒光顯微鏡檢測固體培養(yǎng)基工程菌RGFPB表達(dá)情況。
[0011]本發(fā)明的原理是:
[0012]熒光一般是由熒光素(Fluorescein)染料與相應(yīng)的熒光素酶(Luciferase)特異性合作而發(fā)光，同時產(chǎn)生具有毒性氧自由基而損害靶細(xì)胞，而具有一定的“光毒性”。GFP發(fā)光光毒性弱，適合于活細(xì)胞檢測，因此研究更接近實(shí)態(tài)、結(jié)果更客觀可靠。另外，熒光素染色所研究的細(xì)菌也是熒光標(biāo)記的靜態(tài)死細(xì)胞，沒有所標(biāo)記細(xì)菌的繁殖生長，不能夠完全反應(yīng)瘤胃微生態(tài)真實(shí)的動態(tài)狀態(tài)。而在Aequorea victoria水母中發(fā)現(xiàn)的具有Ser65-Tyr66-Gly67三肽環(huán)化結(jié)構(gòu)熒光團(tuán)(對羥基苯咪唑啉酮)的GFP，只需藍(lán)光激發(fā)就能發(fā)綠色熒光。目前，GFP基因突變優(yōu)化改造的研究和應(yīng)用也已取得較大的進(jìn)展。三肽中65位Ser被Thr替換后的改造型其熒光增強(qiáng)4倍以上，若利用GFP基因進(jìn)行基因操作、標(biāo)記目標(biāo)蛋白，即可通過這種生物“攝像頭”實(shí)時監(jiān)控靶蛋白的時間、空間變化。
[0013]基于以上原理，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，具有以下技術(shù)效果:
[0014]本瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌，能夠模擬瘤胃微生態(tài)的狀態(tài)，動態(tài)地研究瘤胃微生物間的互作。該工程菌的使用將亮化瘤胃微生態(tài)，打開瘤胃內(nèi)微生物蛋白循環(huán)的“黑箱”，促進(jìn)瘤胃微生態(tài)及宿主營養(yǎng)代謝的研究。這對于深入研究瘤胃內(nèi)微生態(tài)營養(yǎng)消化代謝機(jī)理，有效利用瘤胃微生態(tài)營養(yǎng)原理的調(diào)控瘤胃營養(yǎng)代謝，節(jié)約飼料資源和緩解排放對環(huán)境的影響都有一定的參考意義。
[0015]進(jìn)一步的，本發(fā)明和基于上述原理的先前實(shí)驗(yàn)室測定方法比較，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0016]1)熒光一般是由熒光素(Fluorescein)染料與相應(yīng)的熒光素酶(Luciferase)特異性合作而發(fā)光，同時產(chǎn)生具有毒性氧自由基而損害靶細(xì)胞，而具有一定的“光毒性”。而GFP發(fā)光光毒性弱，適合于活細(xì)胞檢測，因此研究更接近實(shí)態(tài)、結(jié)果更客觀可靠。
[0017]2)原來使用的熒光素5-DTAF5_ (4，6-二氯三嗪基)所研究的細(xì)菌也是熒光染色的靜態(tài)死細(xì)胞，沒有所標(biāo)記細(xì)菌的繁殖生長，不能夠完全反應(yīng)瘤胃真實(shí)的動態(tài)狀態(tài)。而GFP只需藍(lán)光激發(fā)就能發(fā)綠色熒光。利用GFP基因進(jìn)行基因操作、標(biāo)記目標(biāo)蛋白，即可通過這種生物“攝像頭”實(shí)時監(jiān)控靶蛋白的時間、空間變化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為感受態(tài)轉(zhuǎn)化菌落照片。[0019]圖2為紫外燈下液體培養(yǎng)基接種轉(zhuǎn)化細(xì)菌照片。
[0020]圖3轉(zhuǎn)化菌生長曲線(OD6cicinm)tj
[0021]圖4轉(zhuǎn)化菌熒光度隨生長變化曲線(OD51tlnm)15
[0022]圖5原蟲吞噬細(xì)菌量與時間的回歸分析(35min)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明包括有以下步驟:1)綠色熒光蛋白GFP基因原核表達(dá)載體pET15b構(gòu)建；2)瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌的構(gòu)建；3)瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌綠色熒光蛋白表達(dá)性能測試；4)置瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌于亨蓋特滾管固體培養(yǎng)基中4°C冰箱保存。
[0024]下面對各步驟進(jìn)行詳細(xì)闡述:
[0025]本發(fā)明的I)步驟中的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白GFP基因原核表達(dá)載體pET15b的構(gòu)建方法為:采用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因，PCR擴(kuò)增EGFP編碼序列。將所擴(kuò)增序列直接常規(guī)亞克隆連接入原核表達(dá)載體pET15b (購自Novagen公司)，以構(gòu)建能夠在細(xì)菌中表達(dá)的原核表達(dá)載體pET15b-EGFP。
[0026]本發(fā)明的2)步驟中的瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌的構(gòu)建方法為:氯化鈣法致敏溶纖維丁酸弧菌(OD6tltol為0.6時為宜)，溶纖維丁酸弧菌為本實(shí)驗(yàn)室從瘤胃中經(jīng)過亨蓋特滾管技術(shù)(Hungate，1950)厭氧培養(yǎng)、分離純化獲得并保存。轉(zhuǎn)化入所構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET15b-EGFP。轉(zhuǎn)化后平板上39°C厭氧培養(yǎng)24~36h，熒光或紫外光下觀察，有綠色熒光的菌落則為陽性克隆(圖1)。
[0027]本發(fā)明的3)步驟中的瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌綠色熒光蛋白表達(dá)性能測試方法為:用液體(人工唾液鹽+無細(xì)胞瘤胃液+葡萄糖2.0%+L-谷氨酰胺1.0%)過夜培養(yǎng)GFP基因工程菌24~36h (圖2)。用722型分光光度計(jì)測定(600nm檢測)并制作液體培養(yǎng)基中工程菌生長曲線(圖3)、用SpectraMax M5多功能讀板機(jī)測定液體培養(yǎng)基中工程菌熒光強(qiáng)度(510nm檢測)(圖4)。
[0028]本發(fā)明的4)步驟中的瘤胃溶纖丁弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌保存方法為:接種瘤胃溶纖丁弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌液于有培養(yǎng)基的亨蓋特滾管中，冰上滾管，39°C厭氧培養(yǎng)24~48h后保存于4°C冰箱中。
[0029]采用本發(fā)明的工程菌進(jìn)行多次原蟲吞噬試驗(yàn)，其中之一試驗(yàn)如下:
[0030]I)取3頭1.5周歲、體重(29.4±2.7)kg、裝有永久性瘤胃瘺管的山羊，單圈飼養(yǎng)，以玉米+豆柏+羊草為常規(guī)飼糧，每日按體重的2.5%干物質(zhì)量供料，07:00和19:00分2次等量飼喂，自由飲水。
[0031 ] 2)試驗(yàn)分為添加3%硬脂酸(A組)、油酸(B組)、亞油酸(C組)、α-亞麻油酸(D組)、花生四烯酸(Ε組)、二十碳五烯酸(F組)的試驗(yàn)組和添加3%棕櫚酸鈣的對照組，每組各設(shè)3個重復(fù)，另外設(shè)I個無底物的空白對照。培養(yǎng)底物組成見表1。
[0032]表1培養(yǎng)底物組成％
[0033][0034]
【權(quán)利要求】
1.一種瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌，其特征在于:宿主菌為瘤胃溶纖維丁酸弧菌，宿主菌中含有原核表達(dá)載體pET15b-EGFP ;所述原核表達(dá)載體pET15b_EGFP是將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因亞克隆連接入原核表達(dá)載體pET15b的BamHl位點(diǎn)而得到。
2.構(gòu)建如權(quán)利要求1所述瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌的方法，其特征在于，采用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因，PCR擴(kuò)增其編碼序列；將所擴(kuò)增序列亞克隆連接入原核表達(dá)載體pET15b，構(gòu)建得到pET15b-EGFP ;氯化鈣法致敏瘤胃溶纖丁弧菌，OD600nm為0.6時為宜，轉(zhuǎn)化入所構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET15b-EGFP ;轉(zhuǎn)化后平板上培養(yǎng)24~36h，熒光或紫外光下觀察，有綠色熒光的菌落則為陽性克隆。
3.權(quán)利要求1所述瘤胃綠 色熒光蛋白GFP基因工程菌在瘤胃微生態(tài)微循環(huán)消化代謝檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK103789249SQ201410054672
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】王夢芝, 經(jīng)語佳, 高健, 皮宇, 王洪榮, 喻禮懷 申請人:揚(yáng)州大學(xué)