稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種稻瘟病菌無毒基因的檢測(cè)方法。所述方法是用引物對(duì)SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2從稻瘟病菌總DNA中擴(kuò)增出一段核苷酸序列，再用NlaIII酶消化，獲取特定長(zhǎng)度的DNA片段，可以應(yīng)用于稻瘟病菌中是否存在無毒基因AVR-pik-B的檢測(cè)，以確定稻瘟病菌所攜帶的無毒基因類型，從而根據(jù)該結(jié)果進(jìn)行水稻品種布局及抗病品種選育。
【專利說明】稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用專用引物及相應(yīng)酶切方案檢測(cè)稻瘟病菌中的無毒基因。
【背景技術(shù)】
[0002]由真菌Magnaporthe oryzae引起的稻痕病,是世界水稻生產(chǎn)中的首要病害。稻痕病菌與水稻寄主之間的互作符合Flor的“基因?qū)驅(qū)W說”，即若稻瘟病菌具有無毒基因，而水稻品種攜帶相應(yīng)的抗病基因，水稻就會(huì)對(duì)稻瘟病菌產(chǎn)生抗性。無毒基因是寄主與病原物互作中能夠改變寄主細(xì)胞狀態(tài)的一類重要病原物基因激發(fā)子的重要成員。寄主植物中每一個(gè)顯性的抗性基因，在病原真菌中對(duì)應(yīng)存在一個(gè)顯性的無毒基因；寄主的抗病基因產(chǎn)物以直接或間接的方式對(duì)病原菌的無毒基因產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)該病原菌的抗性。只有寄主植物中存在相應(yīng)的抗病基因，而病菌中又存在相應(yīng)的無毒基因，植株才能表現(xiàn)出抗病性，繼而引發(fā)病原菌與寄主植物的非親和反應(yīng)，促使局部細(xì)胞發(fā)生過敏性細(xì)胞壞死，以阻止病原微生物在植株體內(nèi)的擴(kuò)展[Liu JL et al.，2010]。鑒定稻瘟病菌的無毒基因，有助于人們根據(jù)不同地區(qū)流行菌株的無毒基因型選擇具有相應(yīng)抗病基因的水稻品種進(jìn)行合理布局，同時(shí)育種家可根據(jù)田間主要流行菌株所攜帶的無毒基因利用分子標(biāo)記輔助手段選育具有相應(yīng)抗病基因的水稻品種進(jìn)行栽培和推廣，從而減少農(nóng)藥的使用和稻瘟病對(duì)水稻生產(chǎn)造成的威脅。
[0003]稻瘟病抗性基因Pik位于水稻11染色體長(zhǎng)臂，對(duì)許多中國(guó)稻瘟病小種有較強(qiáng)的、穩(wěn)定的抗性[Fjellstrom et al.,2004],該基因具有4個(gè)等位基因，分別為pik-p, pik-m,pik_s及pik_h。稻痕病菌無毒基因AVR-pik于2009年被克隆[Yoshida K et al.,2009]，目前已知 5 種等位基因類型，分別為 AVR-pik-A，AVR-pik-B，AVR-pik-C，AVR-pik-D，AVR-pik-E,其中AVR-pik-D為該基因進(jìn)化之初最先發(fā)現(xiàn)的類型,可為pik / pik-p / pik-m所識(shí)別，而其它幾種類型為該基因在與水稻品種抗病基因共同進(jìn)化中陸續(xù)出現(xiàn)的突變型[Hiroyuki Kanzaki et al., 2012]。這些無毒基因可為pik抗病等位基因識(shí)別的范圍相對(duì)于AVR-pik-D類型小一些,如AVR-pik-B僅可與抗病基因pikm和pikp間發(fā)生非親合反應(yīng)(不發(fā)病)，因此準(zhǔn)確鑒定這種類型的等位基因，用以檢測(cè)田間流行稻瘟病菌株的特異性，可有助于人們根據(jù)水稻品種所攜帶的抗病基因進(jìn)行合理布局，減輕稻瘟病的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為準(zhǔn)確鑒定稻瘟病菌所攜帶的無毒基因，進(jìn)而有針對(duì)性選育及推廣具有相應(yīng)抗稻瘟病基因的水稻品種，減輕稻瘟病的危害，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B的方法，可以用于稻瘟病菌所攜帶無毒基因的檢測(cè)，以為品種布局及抗病品種選育提供參考。
[0005]本發(fā)明提供如下解決方案:
[0006]一種用于檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B是否存在的引物對(duì)DNAdBSEQ IDNO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。
[0007]本發(fā)明進(jìn)一步提供SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物對(duì)在檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B上的用途。
[0008]一種檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B是否存在的方法，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測(cè)DNA，若擴(kuò)增出503bp大小的特異性片段且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3所示序列即為含有無毒基因AVR-pik-B。
[0009]一種區(qū)分稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B與其它等位基因的方法，以SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示序列為引物，PCR擴(kuò)增待檢測(cè)DNA，獲503bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步以NlaIII酶消化，若PCR產(chǎn)物不能為NlaIII酶消化，則待檢測(cè)DNA中存在無毒基因AVR-pik-B ;gPCR產(chǎn)物酶切后可獲367bp和136bp兩個(gè)DNA片段，則表明待檢測(cè)DNA中存在稻痕病菌無毒基因 AVR_pik_B 的等位基因 AVR_pik_A、AVR_pik_C、AVR_pik_D 或AVR_pik_E。
[0010]上述引物及酶切方法對(duì)優(yōu)選稻瘟病菌絲所提取的DNA進(jìn)行鑒定，檢測(cè)是否攜帶稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B，檢測(cè)方便，準(zhǔn)確率高，可為稻瘟病抗病育種及品種布局提供參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是以稻瘟病菌DNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NlaIII酶消化后的凝膠電泳圖；
[0012]其中，M:600bp分子量標(biāo)記(TIANGEN MD101)，200ng ;片段長(zhǎng)度分別為:100bp，200bp,300bp,400bp,500bp,600bpo
[0013]A:AVR-pik-A ；B:AVR-pik_C ；C:AVR-pik-D ；D:AVR-pik-B ；E: AVR-p ik-E
[0014]CK:為PCR產(chǎn)物酶切前的電泳條帶；EC:為PCR產(chǎn)物酶切后的電泳條帶。
[0015]其中AVR-pik-A、AVR-p ik-C, AVR-pik-D 和 AVR-pik-E 的擴(kuò)增產(chǎn)物 NlaIII 酶消化后獲得367bp和136bp兩個(gè)DNA片段，而AVR-pik-B的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NlaIII酶消化后為仍為503bp。
[0016]圖2是以田間分離的6株稻瘟病菌DNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NlaIII酶消化后的凝膠電泳圖；
[0017]其中，M:600bp分子量標(biāo)記(TIANGEN MD101)，200ng ;片段長(zhǎng)度分別為:100bp，200bp,300bp,400bp,500bp,600bpo
[0018]I，2，3，4，5，6分別為不同菌株擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NlaIII酶消化后的電泳結(jié)果，可見I，2，3，5號(hào)菌株P(guān)CR產(chǎn)物酶切后仍為I條長(zhǎng)約500bp的片段，而4號(hào)和6號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物酶切后獲兩條片段，序列長(zhǎng)度約為370bp及130bp。
[0019]圖3是經(jīng)鑒定具無毒基因AVRpik-B的稻瘟病菌在4個(gè)pik及其等位基因單基因系上的接種鑒定結(jié)果。
[0020]幾個(gè)品種對(duì)該菌株的抗性表現(xiàn)分別為:pikm和pikp表現(xiàn)高抗,piks表現(xiàn)中感,pik表現(xiàn)感病，麗江新團(tuán)黑谷表現(xiàn)高感。
圖4是以田間分離的6 株稻瘟病菌DNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 實(shí)施例1:DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析
[0022]一、稻瘟病菌絲體培養(yǎng)
[0023]挑取適量稻瘟病菌絲，接種于200ml液體培養(yǎng)基(每升液體培養(yǎng)基中含KH2PO40.5g、K2HP040.5g、MgS040.5g、CaCl20.lg、葡萄糖 20g 及酵母膏 5g)中，25°C及 120r /m震蕩培養(yǎng)6d，5000r / m離心10分鐘收集菌絲體，置于滅菌濾紙上在37°C烘箱中放置36h，烘干后保存于_20°C備用。
[0024]二、DNA 提取(CTAB 法):
[0025]稱取0.1g烘干菌絲體在液氮中研磨，待液氮蒸發(fā)完后(注意:勿使樣品融化)，迅速轉(zhuǎn)入含 65°C預(yù)熱過的提取液(1M Tris pH8.0, IOOmM ；5M NaCl, 1.0M ；0.5Μ EDTA, 20mM ；10% CTAB, 2.0% )400 μ L的離心管中。輕輕搖勻。
[0026]60~65°C水浴30~60分鐘，每10分鐘輕輕搖動(dòng)均勻。
[0027]加等體積的氯仿/異戊醇(24: I)，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。
[0028]室溫下(溫度不低于15°C ), 12000r / min離心5min,取上清液。
[0029]用大孔Tip頭小心抽取上清液200 μ L加入預(yù)冷的2倍體積的無水乙醇(或等體積的異戊醇)，-200C的條件下放置20分鐘以上，5000r / min離心5分鐘，收集沉淀。 [0030]70 %乙醇洗滌沉淀I~2次。
[0031]打開管蓋，放潔凈場(chǎng)所晾干，乳白色的DNA沉淀透明即可。
[0032]100 μ L TE (Tris-HclIOmM, ΡΗ8.0 ；EDTAlmM, ΡΗ8.0)溶解沉淀，并稀釋至 100 μ g /mL，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]三、PCR擴(kuò)增:
[0034]PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
[0035]1.反應(yīng)體系如下:
[0036]2 X Taq PCR Master Mix (艾德萊 PC0902) 10 μ L，10 μ M 的弓 I 物各 0.5 μ L，100 μ g / mL 的模板 DNAl μ L, ddH208 μ L。
[0037]2.PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
[0038]四、PCR產(chǎn)物檢測(cè)及純化
[0039]取4μ L PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)goldview染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果。
[0040]利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN M1419)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。
[0041]五、酶切試驗(yàn)
[0042]酶切反應(yīng)體系(20 μ L):10ΧΝΕΒ4緩沖液2 μ L，純化PCR產(chǎn)物≤I μ g,100XBSA0.2μ L,內(nèi)切酶 0.5 μ L，滅菌 ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L
[0043]酶切條件:37°C溫育3.5h。
[0044]六、酶切后的產(chǎn)物電泳檢測(cè)
[0045]取4 μ L酶切產(chǎn)物，在I %瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)goldview染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果。
[0046]實(shí)施例2:稻瘟病菌中無毒基因AVR-pik-B的檢測(cè)[0047]一、從田間采集的稻瘟病菌經(jīng)分離純化，按照實(shí)施例1中的方法培養(yǎng)稻瘟病菌并提取菌絲DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，I %瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，從圖2可見，以6株稻瘟病菌的DNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物擴(kuò)增均可獲得500bp左右的序列。
[0048]二、按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化及酶切，酶切產(chǎn)物取4 μ L，在I %瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)goldview染色,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果(圖3)。從圖3可見，1，2，3，5號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物酶切后仍為I條長(zhǎng)約500bp的片段，而4號(hào)和6號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物酶切后獲兩條片段，序列長(zhǎng)度約為370bp及130bp，表明I，2，3，5號(hào)菌株攜帶無毒基因AVR-pik-B。
[0049]三、第一步獲取的6個(gè)稻瘟病菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京中美泰和公司測(cè)序，結(jié)果表明1，2，3，5號(hào)菌株P(guān)CR產(chǎn)物序列與SEQ ID NO:3所示序列一致，進(jìn)一步證明其攜帶的確為無毒基因AVR-pik-B。
[0050]實(shí)施例3:攜帶無毒基因AVR-pik-B的稻瘟病菌株與不同水稻單基因系間的互作
[0051]將攜帶無毒基因AVR-pik-B的稻瘟病菌移植于燕麥片番茄汁瓊脂培養(yǎng)基上，25~27°C條件下培養(yǎng)5~7d，待菌絲長(zhǎng)滿，用滅菌的棉簽擦掉氣生菌絲后保濕培養(yǎng)，稻瘟病菌會(huì)大量產(chǎn)孢。待4個(gè)抗稻痕病水稻單基因系(pik、pikp、pikm、piks)和麗江新團(tuán)黑谷(無抗病基因?qū)φ?的稻苗長(zhǎng)至5葉I心時(shí)，將上述擴(kuò)繁培養(yǎng)的各菌株分生孢子分別用120ml無菌水清洗，用雙層紗布過濾裝入三角瓶中，配制孢子懸液(濃度為120倍顯微鏡視野下有20個(gè)左右孢子)，分別隔離噴霧接種。接種后24h，用塑料膜覆于塑料盤上方的鐵架上保濕，在塑料膜上覆蓋遮陽網(wǎng)防止陽光直射。于接種后7-10d調(diào)查，致病反應(yīng)型和小種確定按全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組(1980)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。
[0052]調(diào)查記載標(biāo)準(zhǔn):
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B是否存在的引物對(duì)DNA，如SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。
2.權(quán)利要求1所述引物對(duì)在檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B上的用途。
3.一種檢測(cè)稻瘟病菌無 毒基因AVR-pik-B是否存在的方法，以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測(cè)DNA，若擴(kuò)增出503bp大小的特異性片段且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3所示序列，即為待檢測(cè)DNA含有無毒基因AVR-pik-B。
4.一種區(qū)分稻瘟病菌無毒基因AVR-pik-B與其它等位基因的方法，以SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物，PCR擴(kuò)增待檢測(cè)DNA，獲503bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步以NlaIII酶消化，若PCR產(chǎn)物不能為NlaIII酶消化，則待檢測(cè)DNA中存在無毒基因AVR-pik-B ;gPCR產(chǎn)物酶切后可獲367bp和136bp兩個(gè)DNA片段，則表明待檢測(cè)DNA中存在稻瘟病菌無毒基因 AVR-pik-B 的等位基因 AVR-pik-A、AVR-pik-C、AVR-pik-D 或 AVR-pik-E。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103898209SQ201410030434
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】鄭文靜, 王世維, 陸曉春, 趙家銘, 叢玲, 白春明, 王春語, 張麗霞, 朱振興, 李丹, 王平, 于惠琳 申請(qǐng)人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 鄭文靜, 陸曉春