增強(qiáng)對(duì)稻瘟病菌的抗性的基因以及該基因的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：增強(qiáng)對(duì)稻瘟病菌的抗性的基因以及該基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)對(duì)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的基因以及該基因的 應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及能夠增強(qiáng)對(duì)稻瘟病菌的抗性的Pi5-1蛋白和Pi52蛋白、編 碼這些蛋白的基因、包括些基因的重組體載體、用該重組體載體轉(zhuǎn)化的植物、植物的種子、 通過在植物中表達(dá)所述基因以增強(qiáng)對(duì)植物病原菌的抗性的方法、抗所述蛋白的抗體、以及 包括能夠增強(qiáng)對(duì)植物病原菌的抗性的基因的組合物。
背景技術(shù)：
天然免疫應(yīng)答是植物和動(dòng)物存活的關(guān)鍵。該應(yīng)答由用病原體識(shí)別受體(PRRs ；也 叫模式識(shí)別受體或抗病性蛋白)對(duì)與病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)(也指微生物相關(guān)分子 模式)或無毒力蛋白(Avr)的檢測所介導(dǎo)。在動(dòng)物體中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PRRs家族介導(dǎo)凋亡 和防護(hù)病原體入侵關(guān)鍵的炎癥反應(yīng)，所述細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PRRs家族包括結(jié)合核苷酸的寡聚結(jié) 構(gòu)域(NOD)。植物體也含有一系列的細(xì)胞內(nèi)PRR蛋白，稱為NB-LRR(結(jié)合核苷酸的-富含 亮氨酸的重復(fù)單位)R蛋白，它們與動(dòng)物的NOD蛋白結(jié)構(gòu)相似。這些植物NB-LRR蛋白的特 征是由N-端卷曲螺旋(CC)或Toll/白介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域、中心NB結(jié)構(gòu)域以及 C-端 LRR 結(jié)構(gòu)域(Hammond-Kosack 禾口 Jones (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48 575-607)組成的三結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，以及典型的識(shí)別病原體來源的Avr蛋白(也叫效 應(yīng)器)(Van der Biezen 和 Jones (1998) Trends Biochem. Sci. 23 :454_456)。稻瘟病是水稻最具破壞性的疾病之一，在種植水稻的世界各地均有發(fā)生。到目 前為止已鑒定了超過70個(gè)的對(duì)不同地理位置的稻瘟病病原體的稻瘟病菌(rice blast pathogen Magnaporthe oryzae)的分離株具有抗性的稻瘟病抗性基因(Ballini等(2008) Mol. Plant Microbe Interact. 21 :859_868)。例如，Pib對(duì)大部分的稻瘟病菌的日本分離 株具有很強(qiáng)的抗性(Wang等(1999)PlantJ. 19 :55_64)。相反，Pi37對(duì)稻瘟病菌的日本分離 株僅具有部分抗性，但對(duì)稻瘟病菌的中國分離株具有完全的抗性。因此，需要分離多個(gè)抗性 基因，以充分認(rèn)識(shí)抗稻瘟病的分子基礎(chǔ)。通過標(biāo)記輔助的育種或通過轉(zhuǎn)基因方法，這些基因 的特性將促進(jìn)農(nóng)業(yè)上的有用的水稻品種的發(fā)展。迄今為止，共9個(gè)稻瘟病抗性基因已被克隆和表征Pib、Pita、Pi9、Pi2和Piz_t、 Pi-d2、Pi36、Pi37、以及Pikm。除了 Pi_d2 (非-RD受體樣激酶)之外，這些基因都編碼 NB-LRR型蛋白。這些克隆的稻瘟病抗性基因的不同的特征已經(jīng)被觀察到。Pib蛋白包括重 復(fù)的NB區(qū)域。Pita缺乏典型的LRR，但包括由不同長度的不完全重復(fù)所組成的富亮氨酸 結(jié)構(gòu)域(LRD)。在Pita的LRD發(fā)現(xiàn)單個(gè)的氨酸差異，以區(qū)分易感等位基因(susceptible alleles)的抗性。等位基因Pi2和Piz_t在三個(gè)連續(xù)的LRRs內(nèi)顯示8個(gè)氨基酸差異，這 些殘基決定了抗性的特異性。Pi9基因與Pi2和Piz-t基因高度相似，位于染色體6上的 相同區(qū)域。Pikm-介導(dǎo)的抗性需要兩個(gè)相鄰NB-LRR基因Pikml-TS和Pikm2-TS。在這些克 隆的R基因中，只有Pita被發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的稻瘟病曲霉菌無毒力蛋白AvrPita相互作用。因 而，由NB-LRR型蛋白介導(dǎo)的防御信號(hào)在水稻中的表征較弱。
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據(jù)報(bào)道，Pi5對(duì)從韓國和菲律賓收集的許多稻瘟病曲霉菌的分離株具有抗性 (Wang等(1994) Genetics 136:1421-1434)。為了獲得對(duì)Pi5_介導(dǎo)的稻瘟病抗性的分子 基礎(chǔ)進(jìn)一步理解，我們使用了基于圖譜的方法來分離Pi5基因組區(qū)域。我們先前在RIL260 水稻品種中把Pi5插入到染色體9短臂的170-kb的區(qū)間內(nèi)(Jeon等(2003) Molecular Genetics and Genomics 269 :280_289)。根據(jù)韓國專利申請(qǐng)No. 10-0764563，描述了用于誘導(dǎo)植物疾病抗性的基因、包括該 基因的載體和由該載體獲得的轉(zhuǎn)化株。此外，根據(jù)韓國專利申請(qǐng)No. 10-0701302，描述了分 離自野生水稻的植物疾病抗性ogpr 1基因、該基因的氨基酸序列和使用該基因得到的轉(zhuǎn) 化株。然而，上述的基因與本發(fā)明的基因是不同的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是考慮到上述需求而進(jìn)行的。具體來說，為了進(jìn)一步縮小新的圖譜種群 (mapping polulation)中的Pi5抗性基因座，通過對(duì)有抗性的基因組區(qū)域的序列的分析， 確定了兩種類型的CC-NB-LRR基因，作為Pi5的候選基因。此外，生產(chǎn)了表達(dá)一個(gè)或兩個(gè)上 述候選基因的轉(zhuǎn)基因水稻株，并表征了它們抗稻瘟病曲霉菌的表型。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了對(duì)稻瘟病曲霉菌具有增強(qiáng)抗性的Pi5_l和 Ρ 5-2蛋白。此外，本發(fā)明還提供了編碼所述蛋白的基因。此外，本發(fā)明還提供了包括所述基因的重組體載體。此外，本發(fā)明還提供了用所述重組體載體轉(zhuǎn)化的植物和該植物的種子。此外，本發(fā)明還提供了通過在植物中表達(dá)所述基因以增強(qiáng)對(duì)植物病原體抗性的方法。此外，本發(fā)明還提供抗所述蛋白的抗體。此外，本發(fā)明還提供了一種組合物，該組合物含有用于增強(qiáng)對(duì)植物病原體的抗性 的基因。根據(jù)本發(fā)明，基于Pi5_l基因和Pi5_2基因間的協(xié)同作用，增強(qiáng)了對(duì)植物病原體 (特別是稻瘟病曲霉菌)的抗性。


圖1顯示了 RIL260/IR50種群的Pi5基因座的染色體定位。(上)在RIL260/C039 和RIL260/M202的標(biāo)記C1454和S04G03間，顯示出170-kb的Ρ 5抗性基因組區(qū)域。(下) 在RIL260/IR50種群中確定的Pi5區(qū)域中8個(gè)罕見的重組體的示意圖。相關(guān)的分子標(biāo)記 間顯示斷裂點(diǎn)。空白條表示假定的RIL260基因組，黑條表示IR50基因組，陰影條表示在 兩個(gè)基因組間的區(qū)域是雜合的。粗箭頭表示通過圖譜種群分析定界的攜帶有Pi5基因座的 130-kb的最小區(qū)間。確定了每個(gè)系F3子代對(duì)稻瘟病曲霉菌P06-6的抗性，R，抗性；S，易感 性；R/S，分離系(segregating line)。圖2顯示了 RIL260和Nipponbare品種中Pi5基因座的基因組序列比較。顯示了 兩個(gè)基因組的由RiceGAAS確定的預(yù)測的ORFs。NB-LRR基因，Ρ 5-1等位基因，以及Pi5_2 和Pi5-3基因用黑色箭頭表示。在RIL260中缺失的Pi5-lNipponbare等位基因的N-端區(qū)域用綠色顯示。推測的轉(zhuǎn)座子(putative transposons)和假定的基因(hypothetical genes)分別用藍(lán)箭頭和灰箭頭表示。有數(shù)字的空白箭頭預(yù)測編碼下列蛋白1、推測的真 核的翻譯起始因子；2、推測的GTP-結(jié)合蛋白；3、推測的四氫葉酸酯合成酶；4、推測的醛糖 1-表異構(gòu)酶；5、推測的組蛋白H5 ；6、推測的冷休克-DEAD-盒蛋白A ;7和10、錨蛋白樣蛋 白；8和9、含重復(fù)HGffP的蛋白。紅虛線表示RIL260和Nipponbare ORFs的高相似度(> 90%)。細(xì)線表示很少或沒有同源性的染色體區(qū)域。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。RIL260DNA序 列的間隙(gap)用虛線框表示。圖3顯示了對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻株的分析。(A)與稻瘟病曲霉菌P06-6接種后2天， Ρ 5-1, Ρ 5-2和PiS-l/PiSjF:轉(zhuǎn)基因水稻株的PT-PCR分析。水稻Actinl基因被用于作 為這些反應(yīng)的內(nèi)部對(duì)照。(B)與稻瘟病曲霉菌P06-6接種后7天，Pi5-l，Pi5-2，和Pi5-1/ 卩士5-2&轉(zhuǎn)基因株的疾病癥狀。(C)來源于對(duì)稻瘟病曲霉菌P06-6感染有反應(yīng)的Pi5-l-63/ Ρ 5-2-74 F1子代的轉(zhuǎn)基因株的F2子代的基因組DNA PCR分析和疾病反應(yīng)。抗性品種(攜 帶Pi5的RIL260)和易感品種(缺失Pi5基因的Dongjin(DJ))用作對(duì)照。圖4顯示了 Pi5_l和Pi5_2的基因組結(jié)構(gòu)，以及他們的基因產(chǎn)物。外顯子以淺灰 色框表示，內(nèi)含子以粗線表示。5'-及3'-非翻譯區(qū)(UTR)以深黑框表示。ATG和TGA 分別表示翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子，數(shù)字顯示氨基酸位置。圖5和6分別顯示了 Pi5_l蛋白和Pi5_2蛋白的氨基酸序列。這兩種蛋白都含有 卷曲螺旋(CC)、核苷酸結(jié)合部位(NB)、富含亮氨酸的重復(fù)單位(LRR)、以及C-端區(qū)域(CT)。 用加下劃線的斜體字表示的Pi5_l的31-67位氨基酸和Pi5-2的26-87位氨基酸包括CC基 序。以NB蛋白為特征的保守的內(nèi)部基序(即P-環(huán)、激酶-2、RNBS-B、GLPL、RNBS-D和MHDV 結(jié)構(gòu)域)用下劃線和粗體表示。在許多NB-LRR蛋白的LRR中發(fā)現(xiàn)的保守的xLDL基序也是 加下劃線的。圖7顯示了對(duì)用稻瘟病曲霉菌P06-6接種的RIL260品種的Pi5基因和PBZl基因 的RT-PCR分析。在病原體接種后0、4、12、24、48和72小時(shí)，從RIL260葉組織制備的cDNAs 用于試驗(yàn)。水稻Actinl基因被用作內(nèi)部對(duì)照。
具體實(shí)施例方式為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了能增強(qiáng)對(duì)稻瘟病曲霉菌抗性的Pi5_l和 Ρ 5-2蛋白。在這方面，每種Pi5-1和Pi5-2蛋白不能獨(dú)立地增強(qiáng)對(duì)稻瘟病曲霉菌的抗性。 相反，對(duì)稻瘟病曲霉菌抗性的增強(qiáng)只有通過Pi5-1和Pi5-2蛋白間的協(xié)同作用而獲得。本發(fā)明的Pi5_l和Pi5_2蛋白的范圍包括具有從水稻分離的SEQ IDNO :1或SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的蛋白和上述蛋白的功能等價(jià)物。術(shù)語“功能等價(jià)物”是指氨 基酸殘基的替換或缺失的結(jié)果，所述功能等價(jià)物與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2代表的氨 基酸序列具有至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、仍然更優(yōu)選95%的同源性，因 此，所述功能等價(jià)物表示與由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2表達(dá)的蛋白具有基本上相同的 生物學(xué)活性的蛋白。術(shù)語“基本上相同的生物學(xué)活性”是指植物對(duì)稻瘟病曲霉菌增強(qiáng)的抗 性。本發(fā)明還提供了編碼上述Pi5_l和Pi5_2蛋白的基因。本發(fā)明中，Pi5_l和Pi5_2 基因中的每一種均可以包括蜷曲螺旋(CC)、核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NB)和富亮氨酸的重復(fù)單位(LRR)結(jié)構(gòu)域(見圖5和圖6)。本發(fā)明的基因包括基因組DNA和編碼Pi5-1和Pi5-2蛋 白的cDNA。更具體地說，Pi5-1的cDNA序列包括5 ‘和3 ‘非翻譯區(qū)域(分別包括70bp和 220bp)，并且Pi5-1的cDNA序列編碼1，025個(gè)氨基酸。Pi5_2的cDNA序列包括5'和3' 非翻譯區(qū)域(分別包括73bp和164bp)，并且Pi5-2的cDNA序列編碼1，063個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的Pi5_l和Pi5_2中的每一種的基因組DNAs均可以能包括如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。此外，本發(fā)明的Pi5_l和Pi5_2中的每一種 的cDNAs均可以包括如SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :6所示的核苷酸序列。上述核苷酸序列 的變體也在本發(fā)明范圍內(nèi)。具體地說，所述基因可以包括與如SEQ ID NO :3至SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列具有至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，仍然更優(yōu)選95 %的同 源的核苷酸序列。對(duì)于某一多核苷酸，術(shù)語“序列同源性”由對(duì)最佳排列的具有待比對(duì)區(qū)域 的兩個(gè)核苷酸序列的比對(duì)來確定的。在這方面，待比對(duì)的區(qū)域中的部分核苷酸序列可以包 括相對(duì)于與最佳排列的兩個(gè)序列有關(guān)的參比序列(無任何插入或缺失)而言的插入或缺失 (即，間隙)。此外，本發(fā)明提供了一個(gè)重組體載體，其中，該重組體載體包括本發(fā)明的Pi5_l和 Pi5-2。術(shù)語“重組體”是指能夠復(fù)制異源核苷酸或表達(dá)該異源核苷酸的細(xì)胞、肽、異源肽 或由所述異源核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。重組體細(xì)胞能夠表達(dá)自然狀態(tài)下的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的正 義或反義形式的基因或基因片段。此外，當(dāng)通過人工方法將所述基因修飾并再次引入到所 述細(xì)胞中時(shí)，所述重組體細(xì)胞能夠表達(dá)在自然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的基因。此處所用術(shù)語“載體”是指被遞送至細(xì)胞的DNA片段和核苷酸分子。載體能復(fù)制 DNA，并在宿主細(xì)胞中獨(dú)立地復(fù)制。術(shù)語“遞送系統(tǒng)”和“載體”通常可以互換地使用。術(shù)語 “表達(dá)載體”是指包括期望的編碼序列和對(duì)于在特定的宿主有機(jī)體中表達(dá)可操作連接的編 碼序列所必需的其他適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄械闹亟M體DNA分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組體載體是一個(gè)重組的植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體的優(yōu)選例子是Ti-質(zhì)粒載體，當(dāng)所述載體位于合適的宿主(諸 如根癌土壤桿菌)中時(shí)，所述Ti-質(zhì)粒載體能轉(zhuǎn)移它本身的一部分(即所謂的T區(qū)域)到 植物細(xì)胞中。目前，其他類型的Ti-質(zhì)粒載體(見EPO 116 718 Bi)用于將雜和基因轉(zhuǎn)移 到原生質(zhì)體中，該原生質(zhì)體通過將所述雜合DNA適當(dāng)?shù)夭迦氲街参锘蚪M中而產(chǎn)生新的植 物。特別地，Ti質(zhì)粒載體的優(yōu)選形式是在EP 0 120 516 Bl和USP No. 4，940，838中描述 的所謂二元載體。其他可以用于將本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移到植物宿主中的載體，可以選自雙鏈 植物病毒(如，CaMV)、單鏈植物病毒、以及來源于復(fù)染色體病毒等的病毒載體(例如，不完 整的植物病毒載體)。所述載體的使用是有益的，特別是當(dāng)植物宿主不適宜被轉(zhuǎn)化的時(shí)候。
所述表達(dá)載體可以包括至少一個(gè)選擇性標(biāo)記。所述選擇性標(biāo)記是具有允許基于通 常的化學(xué)方法進(jìn)行選擇的特性的核苷酸序列。能被用來從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中區(qū)分出轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 的任何種類基因均可以作為選擇性標(biāo)記。例子包括對(duì)除草劑(如草甘膦和磷酸麥黃酮) 有抗性的基因；以及對(duì)抗生素(如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素和氯霉素)有抗性的基 因，但不局限于此。 對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
的所述植物表達(dá)載體，啟動(dòng)子可以是CaMV 35S、肌動(dòng)蛋白、泛素、pEMU、MAS或組蛋白啟動(dòng)子中的任意一種，但不局限于此。術(shù)語“啟動(dòng)子”是指為了起始DNA的轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶所結(jié)合的DNA分子，并且啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)基因 的上游DNA區(qū)域。術(shù)語“植物啟動(dòng)子”表示能在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。術(shù)語“結(jié)構(gòu) 啟動(dòng)子”表示在大多數(shù)環(huán)境情況和發(fā)育狀態(tài)或細(xì)胞分化狀態(tài)下有活性的啟動(dòng)子。由于轉(zhuǎn)化 株可以在不同階段通過不同的機(jī)制篩選出，因此，結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子對(duì)本發(fā)明就是優(yōu)選的。因而， 本發(fā)明中并不限制篩選結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子的可能性。對(duì)于所述終止子，任何常規(guī)的終止子均可用于本發(fā)明。所述終止子的例子包括 胭脂堿合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmylA終止子、菜豆堿終止子和用于根癌土壤桿菌的 optopine基因的終止子等，但是不局限此。關(guān)于終止子的必要性，已知該區(qū)域能增加植物細(xì) 胞轉(zhuǎn)錄的可靠性和有效性。因而，由本發(fā)明的上下文看來，優(yōu)選使用終止子。此外，本發(fā)明提供了一種植物，其中，該植物由根據(jù)本發(fā)明的重組體載體轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明，所述植物是單子葉植物，包括水稻、大麥、玉蜀黍、小麥、黑麥、燕麥、 草坪草(turfgrass)、干草、粟、甘蔗、黑麥草、果樹草(turfgrass)等等。最優(yōu)選的是水稻。此外，本發(fā)明提供了所述植物的種子。優(yōu)選地，所述種子是水稻種子。此外，本發(fā)明提供了增強(qiáng)對(duì)植物病原體的抗性的方法，其中，該方法包括用包括 Pi5-1和Pi5-2基因的本發(fā)明的重組體載體轉(zhuǎn)化植物，并在該植物中表達(dá)Pi5-1和Pi5-2基 因的步驟。優(yōu)選地，該病原體為稻瘟病曲霉菌。更優(yōu)選地，所述植物是單子葉植物，包括水稻、 大麥、玉蜀黍、小麥、黑麥、燕麥、草坪草、干草、粟、甘蔗、黑麥草、果樹草等等。最優(yōu)選水稻。植物轉(zhuǎn)化是指能夠?qū)NA轉(zhuǎn)入到植物的任何方法。這樣的轉(zhuǎn)化方法不必須具有再 生和/或組織培養(yǎng)的時(shí)期。目前植物物種的轉(zhuǎn)化不只對(duì)于雙子葉植物，對(duì)單子葉植物也非 常普遍。原則上，任何轉(zhuǎn)化辦法均可以用于將本發(fā)明的雜合DNA引入到適當(dāng)?shù)淖婕?xì)胞。所 述轉(zhuǎn)化方法可以選自以下方法用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙烯甘醇方法(Krens，F(xiàn). Α.等人， 1982, Nature 296,72-74 ；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol. Biol. 8,363-373)；用 于原生質(zhì)體的電穿孔方法(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol. 3，1099-1102)；用于 植物成分的纖維注射方法(Crossway A.等人，1986，Mol. Gen. Genet. 202，179-185)；用于 多種植物成分的粒子轟擊方法(DNA或RNA包被的)(Klein Τ. Μ.等人，1987，Nature 327， 70)；或通過植物入侵或完整成熟花粉或小孢子轉(zhuǎn)化(EP 0 301 316)而由根癌土壤桿菌介 導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中的(非完整)病毒感染方法。本發(fā)明中優(yōu)選的方法包括土壤桿菌屬介導(dǎo)的 DNA轉(zhuǎn)移。尤其，在EP A 120 516和USP No. 4，940，838中描述的雙載體技術(shù)優(yōu)選用于本發(fā) 明。用于根據(jù)本發(fā)明的植物轉(zhuǎn)化的術(shù)語“植物細(xì)胞”可以是任何植物細(xì)胞。植物細(xì)胞可 以是培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)組織、培養(yǎng)器官或整體植物；優(yōu)選地是培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)組織或培養(yǎng)器官； 更優(yōu)選的是培養(yǎng)細(xì)胞的任何形式。優(yōu)選地，該植物是水稻。術(shù)語“植物組織”包括具有用于培養(yǎng)的各種形態(tài)的分化或未分化的植物組織(包 括根、莖、葉、花粉、種子)，例如單細(xì)胞、原生質(zhì)體、蓓蕾和愈合組織，但不局限于此。植物組 織可以是整株的，或?yàn)槠鞴倥囵B(yǎng)、組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)。此外，本發(fā)明還提供了抗本發(fā)明的Pi5_l和Pi5_2蛋白的抗體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù) 語“抗體”包括單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝源抗體(camelised antibody)、嵌合體抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab)片段、
7結(jié)合有二硫化物的Fvs (SdFv)、抗個(gè)體遺傳型(抗-Id)抗體或能夠結(jié)合上述任何表位的片 段。尤其是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段(例如包括抗原結(jié)合區(qū)域的 分子)，也包括在本發(fā)明的抗體內(nèi)。免疫球蛋白分子可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY 中的任意一類，或IgGp IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA2或它們的亞類中的任何一類。本發(fā)明的抗體可以根據(jù)常規(guī)的方法制備，該方法包括通過下述典型的操作將本 發(fā)明的基因克隆在表達(dá)型載體中，以獲得蛋白并從這種蛋白中制備抗體。因此，也包括能夠 從所述蛋白中生成的部分肽。關(guān)于本發(fā)明的部分肽，它含有至少7個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少9個(gè) 氨基酸，更優(yōu)選至少12個(gè)氨基酸。本發(fā)明的抗體的類型是沒有明確的限制的。單克隆抗體、 多克隆抗體和具有抗原結(jié)合特性的部分抗體都包括在本發(fā)明的抗體中。各種免疫球蛋白抗 體也包括在內(nèi)。而且，如人源化抗體的特殊抗體等也包括在本發(fā)明的抗體內(nèi)。此外，本發(fā)明還提供了含有能夠增強(qiáng)對(duì)植物病原體抗性的Pi5_l和Pi5_2基因的 組合物。由于本發(fā)明的Pi5_l和Pi5-2蛋白基于它們之間的協(xié)同作用能夠增強(qiáng)對(duì)植物病原 體的抗性，因此，含有Pi5-1和Pi5-2基因的組合物可以被用來增強(qiáng)對(duì)植物病原體的抗性。 優(yōu)選地，該植物病原體是稻瘟病曲霉菌。參照下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。然而，這只是具體地舉例說明本發(fā) 明，本發(fā)明絕不局限于這些例子。實(shí)施例植物材料攜帶Pi5等位基因的RIL260水稻品種和稻瘟病易感品種(IR50)被用作本研究中 的親本品系。RIL260和IR50品種雜交生成用于基因連鎖分析的圖譜種群。RII^eO/IRSOFi 個(gè)體的自花授粉種子(F2)被收集，以獲得足夠大的圖譜種群。一種山茶水稻品種(Dongjin) 被用作稻瘟病曲霉菌接種和水稻轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的易感對(duì)照。RIL260和攜帶Pi5的單基因水稻品 系IRBL5-M被用來作為在稻瘟病曲霉菌實(shí)驗(yàn)有抗性的對(duì)照品種。另外的8個(gè)單基因水稻品 系，IRBLi-F5、IRBL9-W、IRBLb-B、IRBLta-Kl、IRBLz-Fu、IRBLks-F5、IRBLkm-Ts 和 IRBLsh-S 以及這些單基因品系易感背景品種Lijiangxintuanheigu(LTH)也被用于確定稻瘟病曲霉 菌分離株的毒力模式的接種實(shí)驗(yàn)。水稻幼苗生在白天室溫30°C和夜里20°C的14/10小時(shí) 周期的光/暗循環(huán)的溫室。病原體接種和疾病評(píng)估與Pi5抗性基因座不相容的一種菲律賓分離株稻瘟病曲霉菌P06-6已被通常地用 于檢測這個(gè)基因座。為了在Pi5轉(zhuǎn)基因水稻株中分析稻瘟病的抗性，使用了另外5個(gè)不同 的韓國稻瘟病曲霉菌分離株KJ105a、KJ107、KJ401、KI215和R01-1。所有接種和疾病評(píng)估 在 Kyung Hee 大學(xué)溫室設(shè)施內(nèi)，使用從 Liu 等(2002，Mol. Genet. Genomics 267:472-480) 輕微改良的方法進(jìn)行。每種確定的重組體品系和轉(zhuǎn)基因植物的F3子代的3周齡植物被用 于接種實(shí)驗(yàn)。稻瘟病曲霉菌在燕麥片瓊脂培養(yǎng)基上于24°C黑暗中生長2周。分生孢子在收 集前4天通過用消毒的環(huán)刮盤表面而被誘導(dǎo)。接種的植物被放置于密封的容器內(nèi)在黑暗中 24°C保持濕度24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)到在14/10小時(shí)(光/暗)光周期下24°C和80%濕度的生 長室。接種后7天，完成疾病評(píng)估。來自RIL260/IR50圖譜種群子代的基因型分析C1454和JJ817的酶切擴(kuò)增多態(tài)序列(CAPS)標(biāo)記和一個(gè)序列特征擴(kuò)增區(qū)域
8(SCAR)標(biāo)記JJ803(符合先前報(bào)道的占主導(dǎo)地位的標(biāo)記JJ803)被用于RIL260/IR50分離子 代的分析(表1)。按需使用占主導(dǎo)地位的標(biāo)記JJ113-T3和S04G03。表1.本研究中使用的PCR引物 通過簡單的小量方法從水稻株幼葉中分離基因組DNA (Chen和Ronal d (1999) Plant Mol. Biol. Rep. 17 :53_57)。用50ng基因組DNA做為模板，在最終的30 μ 1體系 (每種引物 ΙΟΟρΜ、每種 dNTP 200 μ MUOmM ρΗ 9. O 的 Tris-鹽酸、2mM MgCl2、50mM KCl, 0. 聚乙二醇辛基苯基醚X-IOO和0. 5UTaq聚合酶)進(jìn)行PCR分析。針對(duì)CAPS標(biāo) 記，C1454和JJ817PCR產(chǎn)物隨后分別被MluI和AseI消化，然后在瓊脂糖凝膠上分級(jí) (size-fractionated)。DNA測序和基因預(yù)測跨越Pi5基因座的RIL260雙BAC(BIBAC)克隆被選作DNA序列分析。由小量制 備純化的質(zhì)粒被Sau3AI部分消化，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離。用商業(yè)試劑盒(凝膠提 取試劑盒，Qiagen)分離該0. 5-3. Okb的基因組DNA片段，亞克隆到pBluescriptll SK(-) (Clontech)的BamHI部位，然后用電穿孔轉(zhuǎn)化到Ε. coli DH10B。為了對(duì)每種帶有25_kb平 均大小的插入的BIBAC克隆進(jìn)行DNA測序，篩選約60個(gè)克隆并用T3和T7引物在一個(gè)或兩 個(gè)方向上進(jìn)行測序。用BLAST(基本的局部對(duì)比檢索工具)執(zhí)行對(duì)NCBI資料庫(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)的相似性檢索。為了預(yù)測蛋白質(zhì)編碼基因區(qū)域，使用水稻基因組自動(dòng)注釋系 統(tǒng)(水稻 GAAS) (http://RiceGAAS. dna. affrc. go. jp/)。用于遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的載體構(gòu)建通過來自于BIBAC克隆的亞克隆重建Pi5_l和Pi5_2的基因組DNA區(qū)域(Jeon 等人.(2003)Mol. Genet. Genomics 269:280-289)。為了 構(gòu)建攜帶整個(gè) Pi5_l 編碼區(qū)的
c1454
JJ8I7
jj803
PiS-/
Ρ 5-2
Actinl
PB7J
gtattacctgaaatcctagtggtg (seq id no: 7)
gatatggttgaaaagctaatctca (seq id no: 9)
aa<3tgagcatcx:agtgcctaatga
(seq id no: u)
tacaagttggcagctttatctgag (shq id no: 13}
agtgaactccaaacatgtgaacac (seq id no; 15) ggaactggataggtcaaggc (seq id no: 17)
accatctacaccatgaagcttaac (seq id no: 19)
9克隆，將包括0. 5-kb預(yù)測啟動(dòng)子的JJ80載體的6. 6-kbBamHI-SacI片段亞克隆到雙載體 pC1300intC(基因庫登記號(hào)· AF294978)中。合成的質(zhì)粒JJ104用BamHI和BstEII進(jìn)行消 化，并融合到JJ106的7. 3-kbHindIII-BstEII插入片段，構(gòu)建具有5. 2_kb啟動(dòng)子區(qū)域的 JJ105。0. 5-kbSacI-XhoI 片段用引物5' -GTCCAAAGAGAAATGCGACAACAC-3‘ (SEQ IDNO 21) 和 5' -CGCTCGAGGTGGCATTTCATCCAATAGGCAAC-3' (SEQ IDNO 22)通過 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。將 合成的產(chǎn)物插入到JJ105延伸終止子區(qū)域，產(chǎn)生攜帶11，516-bp Ρ 5-1基因組區(qū)域的JJ204 構(gòu)建體。Pi5-2基因由以下4個(gè)片段的多重配位構(gòu)建4. 2-kbJJ113的EcoRI-BglIIDNA片 段；用引物 5' -GGATGATGTGATCTGCAGAGAAAC-3 ‘ (SEQ ID NO: 23)和 5' -CAGCCTCACTGA AATTGCGAAGCA-3‘ (SEQ ID NO :24)擴(kuò)增的 200-bp BglII-ClaI PCR 產(chǎn)物；4. 2_kb JJ120 的ClaI-XbaI DNA片段；以及EcoRI-XbaI消化的pC1300intC載體片段。在合成的構(gòu)建體 11117中，通過克隆11120的3.7-吐NsiI-Ec0RI片段，啟動(dòng)子區(qū)域被延伸。最后，通過插入 0. 9kb-延伸的終止序列到JJ142質(zhì)粒的Eco065I部位，構(gòu)成JJ212中Ρ 5-2的13，250-bp 的整個(gè)基因組序列。在JJ204和JJ212的克隆的基因組序列通過DNA測序被確定。轉(zhuǎn)基因水稻株的產(chǎn)生通過電穿孔將Pi5_l和Pi5_2的基因組克隆轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌EHA105或 LBA4404，并根據(jù)已經(jīng)確定的程序由土壤桿菌屬轉(zhuǎn)入到易感的水稻品種(Jeon等人.(2000) Plant J. 22 :561-570)。轉(zhuǎn)基因植物(Ttl)是自花授粉的，T1種子被收集。因基于轉(zhuǎn)基 因的分離模式的1\品系的自花授粉，繼而從T2子代中選取純合子Pi5-l(Pi5-l-63)和 Ρ 5-2 (Ρ 5-2-74)轉(zhuǎn)基因品系。攜帶 Pi5_l 和 Pi5_2 的 F1 株從 Pi5_l_63 和 Pi5_2_74 品系 間的交叉產(chǎn)生，并自花授粉產(chǎn)生F2株。Ρ 5-1 和 Pi5_2cDNAs 的分離從與稻瘟病曲霉菌P06-6接種后24和48小時(shí)收集的水稻葉，并用Trizol試劑制 備兩種總RNA制品。用PolyATtract mRNA隔離系統(tǒng)(Promega)從每批總RNA中獲得純化 的mRNA，并以1 1比例混合以合成cDNA。經(jīng)由凝膠過濾按大小進(jìn)行分級(jí)分離，以篩選超 過0. 5kb的cDNA，用單ZAP XR載體構(gòu)建(Stratagene) cDNA文庫。然后，經(jīng)由集落印記雜 交(colony blothydridization)分別用Pi5_l和Pi5_2編碼區(qū)域的相應(yīng)的探針(570-bp JJ204的HindIII-KpnI片段和589-bp JJ212的EcoRV-SpeI片段部分)，篩選文庫。通過 DNA測序分析對(duì)分離出的cDNA克隆進(jìn)行分析。RT-PCR 分析為了檢測響應(yīng)病原體治療在轉(zhuǎn)錄本積累上的變化，收集不同時(shí)期的來自于 10RIL260、IRBL5-M和與稻瘟病曲霉菌P06-6接種的轉(zhuǎn)基因水稻株中的每一種的葉子，以進(jìn) 行RT-PCR分析?？俁NA用Trizol試劑和一種寡_dT的逆轉(zhuǎn)錄引物以及第一鏈cDNA合成 試劑盒(Roche)制備。在PCR反應(yīng)中使用第一鏈cDNA和基因特異性引物。水稻Actinl基 因和發(fā)病機(jī)制相關(guān)的可誘導(dǎo)的烯丙苯噻唑(PBZl)基因的引物用于內(nèi)部對(duì)照(表1)。PCR 條件如下94°C 5min，隨后 28-35 個(gè)以下循環(huán)94°C，lmin ；56°C, Imin ；72°C,lmin,以及最 后在72°C 5min的延伸。對(duì)每個(gè)引物設(shè)定三個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增。實(shí)施例1 攜帶Pi5的130-kb的染色體區(qū)域的基因特征先前，Pi5抗病基因被劃分到在水稻染色體9的兩個(gè)側(cè)翼標(biāo)記S04G03和C1454之間的170-kb的區(qū)間。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是我們先前分析產(chǎn)生于攜帶Pi5的RIL260和易感品種C039 之間的雜交，以及RIL260和另一個(gè)易感品種M202之間的雜交的兩個(gè)種群的結(jié)果(Jeon等 人· (2003)Mol. Genet. Genomics269 :280-289)。為 了進(jìn)一步描繪 Pi5 基因，在本研究中，我 們產(chǎn)生了來源于RIL260和另一個(gè)易感品種IR50之間雜交的第三個(gè)圖譜種群。通過PCR篩 選，我們發(fā)現(xiàn)在檢測過的易感品種中，只有IR50包括占主導(dǎo)地位的標(biāo)記JJ817，這也在抗性 品種RIL260被發(fā)現(xiàn)(未顯示數(shù)據(jù))。相反，我們不能在包括C039和M202的其他易感品種 中擴(kuò)增JJ817的PCR產(chǎn)物。我們選定IR50作為基于RIL260和IR50基因組區(qū)域之間的相 似性的一個(gè)標(biāo)測親本，我們推測其能促進(jìn)在這個(gè)區(qū)間的重組。 為了確定在170-kbPi5基因座內(nèi)的罕見重組，運(yùn)用CAPS標(biāo)記JJ817和C1454以及 SCAR標(biāo)記JJ803的預(yù)先篩選策略，在我們目前的RIL260/IR50F2種群分析中使用。在被分 析的2，014個(gè)F2個(gè)體中，我們確定了 JJ817和JJ803之間的8個(gè)重組體，但沒有位于JJ803 和C1454之間的重組體(圖1)。用占主導(dǎo)地位的標(biāo)記JJ113-T3和S04G03,我們隨后確定 了我們在它們的子代(F3)株分離的這8個(gè)重組體的斷裂點(diǎn)，這使我們能從雜合子基因型區(qū) 分出純合子。總的來說，發(fā)現(xiàn)所有8個(gè)品系中含有JJ113-T3和JJ817之間的重組體。
在每例的F3子代中確定了源自這8個(gè)確定品系的稻瘟病曲霉菌P06-6感染的疾病 表型。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將Pi5基因定位在標(biāo)記JJ817和C1454間一個(gè)130_kb的區(qū)間(圖 1)。我們先前的和目前的結(jié)果顯示標(biāo)記JJ803和JJ113-T3都與Pi5介導(dǎo)的抗性共分離(圖 1)。我們不能進(jìn)一步在Pi5基因座上細(xì)致標(biāo)測R基因。實(shí)施例2 包括Pi5基因座的130-kb染色體區(qū)域的基因序列分析為了確定候選在Pi5基因座的R基因，涵蓋130_kbPi5區(qū)域的7個(gè)BIBAC克隆—— JJ80、JJ98、JJ106、JJ110、JJ113、JJ120和JJ123被篩選和測序。用這些序列對(duì)照公共數(shù)據(jù) 庫的BLAST搜索和并且用水稻GAAS程序基因注釋分析在RIL260品種的Pi5基因座預(yù)測整 體18個(gè)可讀框(ORFs) :7個(gè)假定軛蛋白、2個(gè)NB-LRR蛋白、2個(gè)推測的轉(zhuǎn)座子蛋白、1個(gè)推 測的真核生物的翻譯起始因子、1個(gè)推測的GTP-結(jié)合蛋白、1個(gè)推測的四氫葉酸酯合成酶、1 個(gè)推測的醛糖1-表異構(gòu)酶、1個(gè)推測的組蛋白H5、l個(gè)推測的冷休克-DEAD-盒-蛋白A和 1個(gè)錨定蛋白(圖2)。從這基因組序列分析，2個(gè)顯示與NB-LRR抗病基因同源性的Pi5候 選基因在RIL260和指定的Pi5-1和Pi5_2被確定。130-kb RIL260 Ρ 5區(qū)間的從JJ803到JJ817的接近90kb的區(qū)域，與由已測 序的品系Nipponbare表示的山茶基因組的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行比較(國際水稻基因組測序計(jì) 劃2005;圖2)。作為結(jié)果的序列分析顯示，Nipponbare Pi5區(qū)間包括2個(gè)NB-LRR基因、 0s09gl5840(—個(gè)Pi5-1等位基因)和在RIL260、0s09gl5850、被指示的Pi5_3中沒有確 定的基因。相反，Nipponbare缺乏相應(yīng)的Pi5-2。值得注意的是，RIL260和Nipponbare的 Ρ 5-1等位基因的5個(gè)上游序列非常不同，顯示在這些等位基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)的極端序列趨 勢。另外，我們沒有在RIL260和Nipponbare的90_kbPi5區(qū)間的任何其他部分發(fā)現(xiàn)顯著的 序列相似性(圖2)。這些結(jié)果提示Pi5抗病基因座在這些抗病和易感水稻品種有顯著的差
已 升。由于該基因座的大間隙，我們沒有比較Pi5抗病基因座與公開序列的秈稻品種 93-11的基因座。在一個(gè)接種實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Nipponbare和93-11都對(duì)稻瘟病曲霉菌P06-6 易感(未顯示數(shù)據(jù))，說明它們都沒有攜帶Pi5抗病基因。
實(shí)施例3 表達(dá)Pi5候選基因的轉(zhuǎn)基因水稻株的特征要確定Pi5_l和Pi5_2兩個(gè)候選基因哪個(gè)為Pi5對(duì)M.曲霉菌介導(dǎo)的抗病性負(fù)責(zé)， 我們分別用攜帶Pi5_l和Pi5-2的基因組克隆JJ204和JJ212，在天然啟動(dòng)子的對(duì)照下，轉(zhuǎn) 化用土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的易感粳稻品種Dongjin。生成的轉(zhuǎn)基因品系的RT-PCR分析顯示 獨(dú)立轉(zhuǎn)化的品系的15個(gè)Pi5-1中的13個(gè)以及13個(gè)Pi5-2中的12個(gè)，表達(dá)它們的在稻瘟 病曲霉菌P06-6接種的轉(zhuǎn)基因(圖3A)。主要的攜帶Pi5-1或Pi5-2的轉(zhuǎn)基因品系(Ttl)被 與稻瘟病曲霉菌P06-6接種。令人驚訝的是，無論如何，13個(gè)Pi5-1或12個(gè)Pi5-2轉(zhuǎn)基因 株中沒有顯示對(duì)稻瘟病曲霉菌分離株P(guān)06-6顯示出抗性(圖3B)。為了確定這些結(jié)果，我們 接種來自于這些Ttl品系的T1子代，并發(fā)現(xiàn)所有子代對(duì)對(duì)稻瘟病曲霉菌分離株的易感性與野 生型對(duì)照Dongjin品系相同。這顯示無論P(yáng)i5-1或Pi5-2都不能單獨(dú)賦予對(duì)稻瘟病曲霉菌 P06-6的抗性。實(shí)施例4 表達(dá)Pi5_l和Pi5_2的轉(zhuǎn)基因水稻株的特征因?yàn)樽罱膱?bào)道(Sinapidou等人.(2004) Plant J. 38 :898_909)已經(jīng)證實(shí)對(duì)于病 原體感染的抗性2個(gè)R基因是必需的，我們決定檢測表達(dá)抗稻瘟病的2個(gè)候選基因株。我 們因而通過一個(gè)高度易感純合子Pi5-1品系#63(Pi5-l-63)與高度易感純合子Pi5_2品系 #74(Pi5-2-74)雜交生成攜帶Pi5-1和Pi5-2的轉(zhuǎn)基因株?；虮磉_(dá)分析顯示來源于在稻 瘟病曲霉菌P06-6接種上Pi5-1和Pi5-2基因均表達(dá)的雜交的F1株。引人注目的是，23個(gè) PiS-l-eS/PiSHAF:株檢測均顯示完全抗稻瘟病曲霉菌P06-6。攜帶Pi5_l或Pi5_2轉(zhuǎn) 基因品系像先前確定的那樣易感(圖3B)。為了確定這個(gè)發(fā)現(xiàn)，我們把來自于Pi5-l-63/Pi5-2_74 F1品系的F2子代株與瘟病 曲霉菌分離株P(guān)06-6接種。72個(gè)被檢測的F2子代中37個(gè)攜帶2個(gè)轉(zhuǎn)基因，并賦予抗稻瘟 病曲霉菌P06-6。相反，缺乏Pi5-1和Pi5-2的F2子代是易感的(圖3C)。RT-PCR分析證 實(shí)Pi5-l-63/Pi5-2-74品系在稻瘟病曲霉菌P06-6接種之前和之后在相似于RIL260的水 平表達(dá)它們的轉(zhuǎn)基因。為了檢測如果Pi5_l和Pi5-2對(duì)抗其他稻瘟病曲霉菌分離株是必需 的，我們接種與Pi5不相容的帶有4個(gè)另外的分離株的轉(zhuǎn)基因株。這些分離株顯示在攜帶不 同單R基因水稻品系的不同的毒力模式，確認(rèn)這些是真正不同的稻瘟病分離株。我們發(fā)現(xiàn) 共表達(dá)Pi5-1和Pi5-2的轉(zhuǎn)基因株抗所有被檢測的稻瘟病曲霉菌分離株。抗病供者RIL260 和攜帶Pi5的單基因品系IRBL5-M也抗這4個(gè)分離株。相反，Dongjin和只攜帶Pi5_l或 Pi5-2的植株對(duì)檢測的稻瘟病曲霉菌分離株易感(表2)。這些結(jié)果證實(shí)2個(gè)NB-LRR基因 Ρ 5-1和Pi5-2對(duì)Pi5-介導(dǎo)的抗稻瘟病曲霉菌分離株是必需的。表2.轉(zhuǎn)基因株對(duì)稻瘟病曲霉菌分離株的疾病反應(yīng)
a轉(zhuǎn)基因植株bR，抗性；S，易感性。Ρ 5單基因品系IRBL5-M對(duì)稻瘟病曲霉菌KI215易感。基因組序列分析顯示攜帶 Ρ 5的IRBL5-M基因組區(qū)域與RIL260的相同(未顯示數(shù)據(jù))。另外，RT-PCR分析進(jìn)一步證 實(shí)IRBL5-M在稻瘟病曲霉菌P06-6接種之前和之后，表達(dá)Pi5_l和Pi5_2的水平與RIL260 相似。基于這些結(jié)果，我們假定Pi5-1和Pi5-2均表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株將也對(duì)稻瘟病曲霉菌 KI215易感。實(shí)際上，我們的接種結(jié)果顯示Pi5-1和Pi5-2均表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株對(duì)稻瘟病曲霉 菌KI215易感。相反，RIL260被發(fā)現(xiàn)抗稻瘟病曲霉菌KI215，這顯示可能包含另一個(gè)對(duì)這個(gè) 分離株賦予抗性的R基因(表2)。實(shí)施例5 由Pi5_l和Pi5_2編碼的蛋白的特性和系統(tǒng)進(jìn)化分析為了分離研究中相對(duì)于2個(gè)Pi5基因的cDNA克隆，用從稻瘟病曲霉菌P06-6接 種24和48小時(shí)后收集的水稻葉分離的mRNA的Uni-ZAP XR載體，建立RIL260的cDNA文 庫。該文庫用集落雜交法篩選，用Pi5_l和Pi5-2的基因特異區(qū)域作為探針。我們分別確定 Ρ 5-1和Pi5-2的7個(gè)和5個(gè)cDNA克隆。序列分析進(jìn)一步顯示包含整個(gè)開放閱讀框(ORF) 的Pi5-1 cDNA的3個(gè)克隆，而其他缺失包繞ATG翻譯起始密碼子的N-末端。在全部ORF 克隆中，最長的克隆(#1-7)被全部測序。這些實(shí)驗(yàn)顯示T Pi5-1編碼1，025個(gè)氨基酸的蛋 白，ORF分別側(cè)臨70bp和220bp的5'-和3'-非翻譯區(qū)(基因庫登記號(hào)· EU869185 ；圖 4和5)?？寺〉男蛄蟹治鲲@示了包括整個(gè)ORF的5個(gè)克隆中的3個(gè)。在它們中間，最長的 克隆(#2-4)被進(jìn)一步通過測序特征化。該分析顯示Pi5-2編碼1，063個(gè)氨基酸的ORF，并 且這個(gè)ORF分別側(cè)臨73bp和164bp的5'-和3'-非翻譯區(qū)(基因庫登記號(hào).EU869186 ； 圖4和6)。其推導(dǎo)的氨基酸序列比較顯示，Pi5_l和Pi5_2編碼N-末端CC，中心定位的NB和 LRR,并且也編碼C-末端區(qū)域(圖5和6)。用Pfam和SMART數(shù)據(jù)庫的保守的區(qū)域掃描預(yù)測 Ρ 5-1的109-576位和Pi5_2的109-567位殘基包括NB區(qū)域，這是被植物R基因產(chǎn)物共享 的信號(hào)基序。以NB-包含R基因產(chǎn)物為特征的保守的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域也在Pi5-1和Pi5-2中確 定，包括P-環(huán)、激酶_2、RNBS-B、GLPL、RNBS-D和MHDV結(jié)構(gòu)域。另外用Paircoil2程序分析 (http://groups, csail.mit. edu/cb/paircoil2/)用閾值 0· 1 預(yù)測一個(gè)在 Pi5_l 的 31-67 位和Pi5-2的26-87位氨基酸之間潛在的CC結(jié)構(gòu)域，顯示這些蛋白屬于NB-LRR抗蛋白CC亞群。Ρ 5-1和Pi5_2的LRR區(qū)域分別由24. 3%和22. 6%的亮氨酸殘基組成，并包含一 系列不同長度的不完整的重復(fù)單位(10-12)(圖5和6)。值得注意的是，Ρ 5-1和Pi5-2 蛋白的一些重復(fù)單位與在其他細(xì)胞漿R蛋白發(fā)現(xiàn)的共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/SxOO LxxLPxx匹配。Pi5_l的第一和第三個(gè)重復(fù)區(qū)域以及Pi5_2的第三和第六個(gè)重復(fù)區(qū)域包括 xLDL基序，該基序在許多NB-LRR蛋白的第三個(gè)LRR是保守的(圖5和6)。仍然值得注意 的是，Ρ 5-1和Pi5-2蛋白包含一個(gè)與其他NB-LRR蛋白不同的獨(dú)特的C末端，不與任何已 知蛋白基序匹配。cDNA和這些R基因的基因組序列之間的序列比較顯示，Pi5_l和Pi5_2分別攜帶 5個(gè)和6個(gè)外顯子(圖4)。Pi5基因比較其他對(duì)M.曲霉菌賦予抗性的克隆的水稻R基因， 在它們的編碼區(qū)域內(nèi)有更大數(shù)量的內(nèi)含子。而且，Pi5-1和Pi5-2基因在它們的RNBS-D和 MHDV結(jié)構(gòu)域均包含內(nèi)含子。實(shí)施例6 :Pi5-l和Pi5_2基因的表達(dá)分析為了檢測是否這兩個(gè)確定的R基因的表達(dá)在病原體治療時(shí)有變化，我們在稻瘟病 曲霉菌P06-6感染的RIL260、IRBL5-M和Pi5_l-63/Pi5-2_74轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行這兩個(gè)基因 的RT-PCR分析(圖7)。為了這個(gè)目的，使用從在稻瘟病曲霉菌P06-6接種后不同時(shí)間點(diǎn) 收集的3周齡植株的葉子分離總RNA。該結(jié)果顯示Pi5-1在病原體攻擊12小時(shí)后表達(dá)增 加，而Pi5-2基因在感染前后的RIL260均持續(xù)低水平表達(dá)(圖7)。IRBL5-M和Pi5_l_63/ Ρ 5-2-74品系也展示與Pi5基因相似的表達(dá)模式。這些發(fā)現(xiàn)顯示Pi5-1和Pi5_2均在病 原體感染期間表達(dá)，提示被編碼的蛋白也共表達(dá)。PBZl轉(zhuǎn)錄本——病原體誘導(dǎo)基因——在 M.曲霉菌處理的葉子累積到高水平(圖7)。
1權(quán)利要求
增強(qiáng)對(duì)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的Pi5 1蛋白和Pi5 2蛋白，其中，該P(yáng)i5 1蛋白和Pi5 2蛋白分別由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2組成。
2.編碼權(quán)利要求1所述的Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因組 DNA分別由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的核苷酸序列組成，并且所述Pi5_l蛋白和Pi5_2 的cDNA分別由SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的核苷酸序列組成。
4.一種重組體載體，其中，該重組體載體包括權(quán)利要求2所述的基因。
5.一種植物，其中，該植物由權(quán)利要求4所述的重組體載體轉(zhuǎn)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物，其特征在于，該植物為單子葉植物。
7.權(quán)利要求5所述的植物的種子。
8.一種增加對(duì)植物病原體的抗性的方法，其中，該方法包括如下步驟用權(quán)利要求4所 述的重組體載體轉(zhuǎn)化植物，并繼而在該植物中使Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物病原體為稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)0
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物為單子葉植物。
11.權(quán)利要求1所述的Pi5_l蛋白和Pi5-2蛋白的抗體。
12.一種用于增強(qiáng)對(duì)植物病原體的抗性的組合物，其中，該組合物含有權(quán)利要求2所述 的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠增強(qiáng)對(duì)稻溫病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白、編碼這些蛋白的基因、包括這些基因的重組體載體、用重組體載體轉(zhuǎn)化的植物、植物的種子、通過在植物中表達(dá)所述基因以增強(qiáng)對(duì)植物病原菌的抗性的方法、抗所述蛋白的抗體、以及包括能夠增強(qiáng)對(duì)植物病原菌的抗性的基因的組合物。
文檔編號(hào)C12N1/11GK101932710SQ200980100692
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者P·羅納德, 盧在煥, 安鎮(zhèn)興, 宋玟英, 徐廷弼, 徐榮秀, 曹培健, 李祥圭, 李起煥, 田鐘聲, 金惠景, 韓胎龍, 高世虎 申請(qǐng)人:慶熙大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán);加州大學(xué)校務(wù)委員會(huì)