一種海帶磷酸甘露糖異構(gòu)和gdp-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種海帶磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因，該基因核苷酸序列及編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。本發(fā)明通過(guò)基因克隆技術(shù)克隆出基因序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過(guò)對(duì)重組蛋白進(jìn)行酶活性檢測(cè)，證實(shí)了其具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸變構(gòu)的功能，卻具有顯著的GDP-甘露糖焦磷酸化酶的活性，屬于褐藻膠生物合成途徑的關(guān)鍵酶編碼基因。該基因?qū)τ谔岣吆У仍孱惡衷迥z和巖藻多糖含量具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種海帶磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種海帶磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶的編碼酶基因。特別涉及一種海帶(Saccharina japonica)磷酸甘露糖異構(gòu)和⑶P-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因的核苷酸序列，及其編碼蛋白以及在合成褐藻膠和巖藻多糖的能力和在改良重要經(jīng)濟(jì)成分性狀中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海帶是全世界主要栽培的海洋植物(藻類)種類。作為一種海洋蔬菜，海帶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)，褐藻膠、巖藻多糖(褐藻糖膠)等主要經(jīng)濟(jì)成分，可以作為原材料廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)。褐藻膠的用途廣泛，主要應(yīng)用在食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、紡織工業(yè)、科學(xué)研究等方面。巖藻多糖不僅可以作為金屬離子的結(jié)合劑和阻吸劑，同時(shí)還具有如抗HIV病毒、抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等生理功能和功效，是一種重要的藥用物質(zhì)。
[0003]克隆產(chǎn)物合成相關(guān)基因并驗(yàn)證其功能，揭示基因與產(chǎn)物之間的關(guān)系，輔助開(kāi)展品種改良已成為國(guó)際農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域提高經(jīng)濟(jì)成分含量的有效途徑之一；同時(shí)，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)活性物質(zhì)與經(jīng)濟(jì)產(chǎn)物已成為現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心內(nèi)容。
[0004]褐藻膠(Algin)是水溶性的褐藻酸鈉、鉀等堿金屬鹽類和水不溶性的褐藻酸(Alginic acid)及其與二價(jià)以上金屬離子結(jié)合的褐藻酸鹽類；其基本結(jié)構(gòu)是由α -1, 4-L-古洛糖醒酸嵌段(a -L-guluronicacid, G)和β -1, 4_D_甘露糖醒酸嵌段(β -D-mannuronic, Μ)通過(guò)β -1-4糖苷鍵不規(guī)則的連接而成的多糖。
[0005]巖藻多糖(巖藻多糖硫酸酯，fucoidan或fucan sulfate, FS)是一種主要存在于褐藻細(xì)胞壁和一些海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中的多糖，由L-巖藻糖和硫酸基團(tuán)組成，此外還有D-木糖、D-半乳糖或者糖醛酸。
[0006]褐藻膠和巖藻多糖的生物來(lái)源僅為褐藻綱藻類、海洋無(wú)脊椎動(dòng)物及微生物，如真海帶(Saccharina japonica)、馬尾藻屬(Sargassum)、掠色固氮菌(Azotobactervinelandii)、海洋假單胞細(xì)菌(Pseudomonas sp.)、銅綠假單胞細(xì)菌(Pseudomonasaeruginosa)、Halomonas marina 等。
[0007]不同生物來(lái)源的褐藻膠和巖藻多糖結(jié)構(gòu)上有所不同，但是其合成過(guò)程基本是一致的。微生物褐藻膠和巖藻多糖的生物合成途徑研究的較為詳細(xì)，如假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、固氮菌(Azotobacter vinelandii)和 Y -變形菌(Gammaproteo bacteria)。假單胞菌中，合成通路 由多步反應(yīng)構(gòu)成，磷酸甘露糖異構(gòu)酶(AlgA)、磷酸甘露糖變位酶(AlgC)和GDP-甘露糖脫氫酶(AlgD)負(fù)責(zé)合成褐藻膠和巖藻多糖的前體物質(zhì)GDP-甘露糖醒酸(Guanosine diphosphate mannuronic acid, GDP-ManA)。而該合成通路在褐藻中仍然是不明確的。Michel等學(xué)者對(duì)長(zhǎng)囊水云(Ectocarpus siliculosus)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，重組了長(zhǎng)囊水云的褐藻膠和巖藻多糖合成通路。在其基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到了與AlgA、AlgC、AlgD和AlgG同源的基因PMI (磷酸甘露糖異構(gòu)酶,Mannose-6-phosphateisomerase)、PMM (Phosphomannomutase)、GMD (GDP-D-mannose dehydratase) 和 MC5E(Mannuronan C-5-epimerase)。在細(xì)菌等微生物中AlgA是一種雙功能酶基因，即PMI的Type2類型，能催化合成反應(yīng)的第一步和第三步反應(yīng)，但是學(xué)者在長(zhǎng)囊水云中只搜索到了單功能酶基因PMI，并沒(méi)有找到催化第三步反應(yīng)的酶基因GMP (GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-mannose pyrophosphorylase, MPG),見(jiàn)圖 2。
[0008]海帶等褐藻是褐藻膠和巖藻多糖天然來(lái)源，其大生物量和高含量的特點(diǎn)使其一直以來(lái)就是褐藻膠和巖藻多糖提取的主要原料。但對(duì)于其合成褐藻膠和巖藻多糖的基因通路研究十分薄弱，對(duì)于其關(guān)鍵的催化甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖反應(yīng)的編碼酶基因仍屬于未知，從而使海帶等褐藻植物基于基因克隆的品種改良無(wú)法實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對(duì)目前現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因，其可編碼一種磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶蛋白，所述蛋白僅具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸變構(gòu)酶(PMI)活性，但具有顯著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化的酶(MPG)活性，所述基因及其編碼蛋白可用于提高褐藻膠和巖藻多糖合成含量。
[0010]本發(fā)明的目的之一在于提供一種磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因，所述基因是從海帶(Saccharina japonica)中分離出來(lái)的磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因，命名為SjPMI4 ;所述基因的核苷酸序列是如SEQ IDNO:1所示。
[0011]本發(fā)明的目的之二在于提供一種所述基因編碼的蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其僅具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸變構(gòu)活性，但具有顯著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化的活性。
`[0012]本發(fā)明目的之三是所述基因及其編碼蛋白在合成褐藻膠和巖藻多糖中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明目的之四是所述基因及其編碼蛋白在改良經(jīng)濟(jì)成分性狀中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明通過(guò)基因克隆的方法，從海帶中克隆到了一個(gè)磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了其編碼的蛋白僅具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸變構(gòu)活性，但具有顯著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化的活性，是合成褐藻膠和巖藻多糖的關(guān)鍵基因。克隆和分析海帶磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因有助于深入理解海帶等褐藻褐藻膠和巖藻多糖合成機(jī)制，同時(shí)也會(huì)為褐藻膠和巖藻多糖基因工程和分子育種提供了基因資源。本發(fā)明首次從海帶(Saccharina japonica)中分離到磷酸甘露糖異構(gòu)和⑶P-甘露糖焦磷酸化雙功能酶基因，并通過(guò)真核表達(dá)載體對(duì)重組蛋白進(jìn)行酶活性檢測(cè)，證實(shí)了其具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸變構(gòu)活性功能，但同時(shí)具有顯著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化的活性功能，具有褐藻膠和巖藻多糖基因工程和分子育種的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為以GDP-甘露糖作為前體的褐藻膠和巖藻多糖合成通路示意圖。[0016]圖2為磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)的生物學(xué)功能。
[0017]圖3為本發(fā)明的SjPMI4基因cDNA全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增圖。
[0018]圖4為本發(fā)明的SjPMI4基因及其編碼氨基酸序列(方框中分別為起始密碼子和終止密碼子)。
[0019]圖5為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母后PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增圖。 [0020]圖6為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物純化后SDS-PAGE檢測(cè)圖。
[0021]圖7為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物的Western-Blot檢測(cè)圖。
[0022]圖8為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物的不同溫度對(duì)酶活性的檢測(cè)圖。
[0023]圖9為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物的pH對(duì)酶活性的檢測(cè)圖。
[0024]圖10為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物的不同金屬離子對(duì)酶活性的檢測(cè)圖。
[0025]圖11為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物的不同底物濃度酶活性變化圖
[0026]圖12為本發(fā)明的SjPMI4基因轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)產(chǎn)物的不同底物濃度雙倒數(shù)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(Sambrook J, et al.2008.Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 3rd Ed.)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0028]實(shí)施例1:基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的克隆與分析
[0029]海帶采集自山東省榮成市，采集時(shí)間為2011年7月。采用Trizol法提取海帶雌配子體總 RNA,使用 TAKARA 公司 PrimeScript IIlst Strand cDNA Synthesis 試劑盒以海帶配子體總RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，使用 BDSMART? RACE cDNA Ampl ification Kit 進(jìn)行 RACE-PCR 擴(kuò)增，引物分別為 5 '-AGGGCTACGAGCACAAGGAAAAGGGGG-3 '和 5 , -GAC CTCTACAAGGATGACAACCACAAGC-3 '，RACE-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 30sec，72°C 3min，5 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 70 °C 30s, 72 °C 3min，5個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 3min，20 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 根據(jù) RACE 測(cè)序結(jié)果采用TouchdownPCR技術(shù)和普通PCR技術(shù)進(jìn)行海帶PMI基因的⑶S全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增引物包括 3 組(5' -CGACCCGACCTCTACAAGGATGACAACC-3'和 5' -TCATTGGCAGCCATGAAGAACGACTCTC-3/ ；5/ -CGAGACCGAGGAGGGCAAGATGTAC-3'和 5' -CTCATTGGCAGC CATGAAGAACGAC-3'；5' -GCCCTTCGTCACACACACGAC-3'和 5' -CGGTGCAGGTTGAACACAATCT-3' XPCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在紫外燈下切割含有目的條帶的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，于_20°C保存。回收的目的片段，于16°C金屬浴過(guò)夜連接至克隆載體PMD19-T，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli ToplO中，涂布于含有100mg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)IPTG/X-gal藍(lán)白斑篩選后，挑取4_10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)序列比對(duì)，分離到了一個(gè)海帶PMI基因，命名為SjPMI4。SjPMI4⑶S序列全長(zhǎng)為1020bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼339個(gè)氨基酸，以ATG為起始密碼子，T AA為終止密碼子，之后為588bp的3’ UTR序列。
[0030]實(shí)施例2:SjPMI4編碼蛋白的制備及分析[0031]海帶SjPMI4PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在紫外燈下切下目的條帶，瓊脂糖凝膠回收，回收產(chǎn)物SjPMI4和pPICZ a A質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切，在37°C金屬浴3-4h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將目的片段SJPMI4和質(zhì)粒pPICZ a A進(jìn)行連接，16°C過(guò)夜，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為pPICZ α Α-ΡΜΙ4。
[0032]將重組質(zhì)粒pPICZ α A-PMI4使用內(nèi)切酶DraI進(jìn)行線性化處理，純化后用滅菌的雙蒸水溶解，用電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母Χ-33感受態(tài)細(xì)胞中。將孵化好的細(xì)胞培養(yǎng)物涂布于含有不同濃度Zeocin?的YPD平板上，每50-200 μ L涂布一塊平板；將平板置于28°C的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-4天，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。
[0033]用煮凍煮的方法制備巴斯德畢赤酵母PCR模板，利用引物(根據(jù)已經(jīng)獲得的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的正反向引物，含EcoRI酶切位點(diǎn)的正向引物5' -CAGCGAATTCATGAGACGCCTGAATTGC-3'和含 NotI 酶切位點(diǎn)的反向引物 5' -TATGCGGCCGCTATCAAACTCCAAATCC-3')進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選，PCR檢測(cè)重組子。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，自動(dòng)凝膠圖像分析儀成像，使用上述引物擴(kuò)增PMI4⑶S全長(zhǎng)序列，得到長(zhǎng)度約為1000bp的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致。挑取電泳檢測(cè)插入條帶正確的克隆測(cè)序，檢測(cè)有無(wú)突變，移碼框是否改變。取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆保存的菌液接種到50mL BMGY培養(yǎng)基中，28°C，250rpm/min培養(yǎng)，24h向發(fā)酵液中添加甲醇至終濃度為0.5%。超聲法破碎菌液，收集破碎后的上清液，用
0.45 μ m的濾膜過(guò)濾，Ni柱純化后，收集的蛋白樣品放入透析袋中透析，以除去不需要的離子，獲得重組PMI4蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，采用SDS-PAGE、Western_Blot檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。
[0034]實(shí)施例3:SjPMI4編碼蛋白的功能驗(yàn)證
[0035]PMI酶活測(cè)定:參照MarutaT等(2008)的兩步偶聯(lián)法，并稍作改造。反應(yīng)體系如下:50mM pH7.5 的 Tris-HCl 的緩沖液中含有 0.5mM 的 NADP+，5mM MgCl2, IU/mL PGI (Glucose-6-phosphate isomerase),lU/mL G6PDH (Glucose-6-phosphatedehydrogenase), ImM 的 M-6-P (Mannose-6-phosphate)和適量實(shí)施例 3 制備的重組 PMI4蛋白，總的反應(yīng)體系為30(^1^，加入底物16-?起始反應(yīng)。將上述除去底物的體系混合后在相應(yīng)溫度條件下孵育2min后起始反應(yīng)，以相應(yīng)的緩沖液為空白對(duì)照，在340nm處分別測(cè)定反應(yīng)0min、6min和12min吸光值的變化，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置4個(gè)平行樣。經(jīng)檢測(cè)，PMI4蛋白PMI酶活性較低，酶活為0.81U/mg,最適反應(yīng)溫度為15°C，最適pH為8.5，該酶為低溫酶，堿性蛋白。Zn2+、Cu2+和Mn2+對(duì)酶活性有抑制作用；而Ca2+和Mg2+對(duì)酶活基本無(wú)影響；Co2+有促進(jìn)酶活的作用。
[0036]MPG 酶活性測(cè)定:lml50mM ρΗ7.6Tris_HCl 的緩沖液，4mM 葡萄糖，ImM ADP，ImMNADP, IOmM MnCl2, IU 己糖激酶，IU nucleoside-50-diphospho-kinase, IU 葡萄糖-6-憐酸脫氫酶和濃度范圍為0.05到5mM的⑶P-甘露糖。反應(yīng)由加入實(shí)施例3制備的重組PMI4蛋白以及終濃度為2mM的焦磷酸鈉起始。將上述體系混合后在相應(yīng)溫度條件下孵育起始反應(yīng)，以相應(yīng)的緩沖液為空白對(duì)照，在340nm處分別測(cè)定反應(yīng)0min、3min和6min吸光值的變化，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置4個(gè)平行樣。酶活為3.28U/mg, Km值為32.44mM，最適反應(yīng)溫度為40°C，最適pH為7.0。該酶為高溫酶，中性蛋白；Mn2+、Ca2+、Cu2+和Mg2+可以促進(jìn)酶活，Zn2+抑制其活性。
[0037]盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍`內(nèi)的變動(dòng)。
【權(quán)利要求】
1.一種編碼海帶中磷酸甘露糖異構(gòu)和GDP-甘露糖焦磷酸化雙功能酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種由權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示，其僅具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸變構(gòu)活性，但具有顯著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化的活性。
3.權(quán)利要求1所述的雙功能酶基因在合成褐藻膠和巖藻多糖中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所 述蛋白在合成褐藻膠和巖藻多糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK103710369SQ201410003833
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】劉濤, 池姍 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)