專利名稱：葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種試劑盒及其制備方法，特別是一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種最常見的自身免疫性疾病，在全世界大約有1. 0%的人患有此病。其特征為對(duì)稱性的大小關(guān)節(jié)滑膜的炎癥。起初的癥狀包括批關(guān)節(jié)腫脹疼痛， 并且在關(guān)節(jié)部位有晨僵，繼而引起骨質(zhì)破壞。因而，RA的早期診斷和及時(shí)開始合適的治療對(duì)控制該病的病情非常重要。中小型醫(yī)院的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者就診人數(shù)量少，檢測(cè)樣品少，檢測(cè)報(bào)告周期長(zhǎng)，容易延誤患者明確診斷和用藥治療。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者和約64%的健康人群與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎未控制的患者在血清中和關(guān)節(jié)腔積液內(nèi)存在葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)。主要有體內(nèi)T細(xì)胞系統(tǒng)和B淋巴細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生，分泌大量GPI抗原進(jìn)入血清和關(guān)節(jié)腔內(nèi)，使得血清中和關(guān)節(jié)腔內(nèi)GPI濃度升高，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎獨(dú)特的自身免疫生理功能。在RA患者有高效價(jià)的GPI存在，常伴有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)功能受限。提示預(yù)后不良或治療過(guò)程中藥物沒有起到一定作用，當(dāng)RA患者用藥物治療好轉(zhuǎn)，血清和關(guān)節(jié)腔積液中GPI降低，關(guān)節(jié)腫痛減輕。從2001年Nature Immunology 雜志首次發(fā)表文章，從鼠自然生成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的k/BxNT細(xì)胞神經(jīng)未稍細(xì)胞基因中得到 GPI，然后從人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中也得到相同的GPI，而且在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所含高濃度抗原都是一致，幾乎完全為GPI同一酵素酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒及制備方法，所述的這種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒及制備方法是采用膠體金滲濾法和層析法原理來(lái)檢測(cè)人血清中的GPI濃度，解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)血清中的GPI濃度的時(shí)間較長(zhǎng)，程序復(fù)雜的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)抗原體外檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)板、羊抗GPI抗體、由膠體金標(biāo)記的羊抗GPI抗體結(jié)合物、封閉液、洗滌液、陽(yáng)性參考品和陰性參考品。進(jìn)一步的，所述的檢測(cè)板由一個(gè)塑料盒底盒，所述的塑料盒底盒中設(shè)置有一層吸水層，所述的吸水層上設(shè)置有一層硝酸纖維素膜，所述的硝酸纖維素膜上設(shè)置有一個(gè)塑料盒面蓋，所述的塑料盒面蓋中央設(shè)置有一個(gè)檢測(cè)反應(yīng)孔，在檢測(cè)反應(yīng)孔對(duì)應(yīng)的硝酸纖維素膜上點(diǎn)加羊抗GPI抗體。進(jìn)一步的，所述的檢測(cè)反應(yīng)孔為圓形或者其它形狀。進(jìn)一步的，所述的封閉液是含有牛血清白蛋白的磷酸鹽溶液，磷酸鹽溶液的 pH7. 0 7. 5之間，牛血清白蛋白在磷酸鹽溶液中的重量百分比為1. 0%。進(jìn)一步的，所述的洗滌液是含有Tween-20的Tris-HCl溶液，Tris-HCl溶液的pH7. 0 7. 5之間，Tween-20在Tris-HCl溶液中的重量百分比為0. 05% 0進(jìn)一步的，在每毫升膠體金結(jié)合物中，羊抗GPI抗體的質(zhì)量為0. 025毫克。進(jìn)一步的，所述的陽(yáng)性參考品為濃度大于0. 2mg/L的GPI抗原。進(jìn)一步的，所述的陰性參考品小于0. 2mg/L的GPI抗原。本發(fā)明還提供了上述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)抗原體外檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括一個(gè)配制羊抗GPI抗體溶液的步驟，一個(gè)制備檢測(cè)板的步驟，一個(gè)制備膠體金標(biāo)記的羊抗GPI抗體結(jié)合物的步驟，一個(gè)配制封閉液的步驟，一個(gè)配制洗滌液的步驟，一個(gè)制備陽(yáng)性參考品的步驟和一個(gè)制備陰性參考品的步驟。本發(fā)明的工作原理是本試劑盒采用雙抗體夾心免疫吸附法原理、及膠體金滲濾、 膠體金層析檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)人血清中的GPI抗原，將羊抗GPI抗體包被于硝酸纖維素膜，制成固相抗體，用以捕獲人血清中可能存在的GPI抗原，再將羊抗GPI抗體標(biāo)記于膠體金，形成膠體金結(jié)合物作為示蹤物。如被測(cè)人血清中含有GPI抗原，則形成固相羊抗GPI抗體-GPI 抗原-膠體金結(jié)合物，呈紅色斑點(diǎn)反應(yīng)，其顏色深淺與被測(cè)血清中含有的GPI抗原的濃度有關(guān)，但不呈比例關(guān)系。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明可以用于檢測(cè)人血清樣本中葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)抗原，作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎輔助診斷使用。采用本發(fā)明的試劑盒當(dāng)天能收到檢測(cè)報(bào)告，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確而且方便。


圖1顯示了檢測(cè)板反應(yīng)孔中心檢測(cè)點(diǎn)有紅色斑點(diǎn)，為陽(yáng)性結(jié)果。圖2顯示了檢測(cè)板反應(yīng)孔中心檢測(cè)點(diǎn)無(wú)紅色斑點(diǎn)，為陰性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.膠體金制備條件選擇1. 10. 05%氯化金溶液300毫升，加熱至沸；1.2加入5.0%檸檬酸三鈉3. 6毫升；1. 3繼續(xù)加熱煮沸15分鐘，停止加熱，待冷至室溫，用蒸餾水恢復(fù)至原體積；1. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果波長(zhǎng)λ 540 535 530 525 520 510nm。ABS 值:0. 528 0. 715 1. 481 0. 902 0. 699 0. 601目測(cè)膠體金溶液顏色紅色透明。實(shí)施例2.膠體金結(jié)合物制備條件選擇2. 1膠體金標(biāo)記羊抗GPI抗體pH值的選擇選擇膠體金標(biāo)記羊抗GPI抗體的適宜pH值，使用1. 0%無(wú)水碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)膠體金標(biāo)記PH值，通過(guò)檢測(cè)靈敏度比較膠體金標(biāo)記羊抗GPI抗體的合適pH值范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)板、羊抗 GPI抗體、由膠體金標(biāo)記的羊抗GPI抗體結(jié)合物、封閉液、洗滌液、陽(yáng)性參考品和陰性參考品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述的檢測(cè)板由一個(gè)塑料盒底盒，所述的塑料盒底盒中設(shè)置有一層吸水層，所述的吸水層上設(shè)置有一層硝酸纖維素膜，所述的硝酸纖維素膜上設(shè)置有一個(gè)塑料盒面蓋，所述的塑料盒面蓋中央設(shè)置有一個(gè)檢測(cè)反應(yīng)孔，在檢測(cè)反應(yīng)孔對(duì)應(yīng)的硝酸纖維素膜上點(diǎn)加羊抗GPI抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述的封閉液是含有牛血清白蛋白的磷酸鹽溶液，磷酸鹽溶液的PH7. 0 7. 5之間，牛血清白蛋白在磷酸鹽溶液中的重量百分比為1.0%。
4.如權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述的洗滌液是含有Tween-20的Tris-HCl溶液，Tris-HCl溶液的pH在7. 0 7. 5之間， Tween-20在iTris-HCl溶液中的重量百分比為0. 05%。
5.如權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于 在每毫升膠體金結(jié)合物中，羊抗GPI抗體的質(zhì)量為0. 025毫克。
6.如權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述的陽(yáng)性參考品為濃度大于0. 2 mg/L的GPI抗原。
7.如權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述的陰性參考品為濃度小于0. 2 mg/L的GPI抗原。
8.權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶抗原體外檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括一個(gè)配制羊抗GPI抗體溶液的步驟，一個(gè)制備檢測(cè)板的步驟，一個(gè)制備膠體金標(biāo)記的羊抗GPI抗體結(jié)合物的步驟，一個(gè)配制封閉液的步驟，一個(gè)配制洗滌液的步驟，一個(gè)制備陽(yáng)性參考品的步驟和一個(gè)制備陰性參考品的步驟。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，提供了一種葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)抗原體外檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)板、羊抗GPI抗體、膠體金結(jié)合物、封閉液、洗滌液、陽(yáng)性參考品和陰性參考品。本發(fā)明還提供了上述的GPI抗原體外檢測(cè)試劑盒的制備方法。本發(fā)明采用雙抗體夾心膠體金免疫吸附法原理檢測(cè)人血清中的GPI抗原，將羊抗GPI抗體包被于硝酸纖維素膜，制成固相抗體，用以捕獲人外周血清中可能存在的GPI抗原。再將膠體金標(biāo)記于羊抗GPI抗體，形成膠體金結(jié)合物作為示蹤物，如被測(cè)人血清中含有GPI抗原，則形成固相羊抗GPI抗體-GPI抗原-膠體金結(jié)合物。本發(fā)明可應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎輔助診斷。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102323401SQ20111014221
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者劉中令, 劉穎冰, 陸梅生 申請(qǐng)人:上海北加生化試劑有限公司