專利名稱：一種磷酸甘露糖異構(gòu)酶等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種磷酸甘露糖異構(gòu)酶的檢測(cè)方法，屬于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域，具體 地講，涉及用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法來(lái)檢測(cè)磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的技術(shù)。
背景技術(shù)：
植物遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化頻率通常較低，篩選時(shí)必須利用選擇標(biāo)記來(lái)保證轉(zhuǎn)化細(xì)胞的 存活和防止非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生。傳統(tǒng)的篩選方法是利用抗生素和除草劑類選擇劑，但這些 物質(zhì)對(duì)人類和環(huán)境的影響還不完全了解，因此，非抗生素篩選系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。甘露糖陽(yáng)性選擇系統(tǒng)屬于非抗生素篩選系統(tǒng)之一，它是利用大腸桿菌的磷酸甘露 糖異構(gòu)酶基因(Pmi)作為選擇基因，甘露糖作為選擇劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的篩選。甘露糖經(jīng) 由植物內(nèi)源己糖激酶催化磷酸化為6-磷酸甘露糖，反應(yīng)消耗ATP和磷酸鹽，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分 裂、生長(zhǎng)缺少能量，并且6-磷酸甘露糖的過(guò)量積累對(duì)植物細(xì)胞有毒害作用。整合有外源pmi 基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能將6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶為6-磷酸果糖，使得代謝可繼續(xù)進(jìn)行，避免了因 6-磷酸甘露糖的大量積累，并產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞的正常代謝提供了能量。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞因缺乏 磷酸甘露糖異構(gòu)酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生長(zhǎng)。因此，在含有甘露糖的培養(yǎng)基上，只 有轉(zhuǎn)化細(xì)胞能正常生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被淘汰。在轉(zhuǎn)基因植株篩選過(guò)程中主要用氯酚法(chlorophenol red，CPR)進(jìn)行檢測(cè)，這種 方法僅適用于活植株的篩選，對(duì)于已經(jīng)沒(méi)有活性的植株或加工產(chǎn)品就不適用。楊彩云等為 了方便載體構(gòu)建在引物前都設(shè)計(jì)了 Xho玉的酶切位點(diǎn)，并在引物兩邊加入保護(hù)堿基。引物 序列為Ppmi-I 5' -GCACTCGAGCATGCAAAAACTCATTAACTCAG-3‘；Ppmi-2 5' -GCACTCGAGCTCTTACAGCTTGTTGTAAAC-3‘?dāng)U增片段大小1. 2kb左右，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)就不太適用。因?yàn)槭称反蟛糠质沁M(jìn) 行深加工處理，DNA片段破碎比較嚴(yán)重，檢測(cè)目標(biāo)片段太長(zhǎng)就容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本專利應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立的檢測(cè)方法用于快速篩選鑒別磷酸甘露糖 異構(gòu)酶基因。為基層實(shí)驗(yàn)室開展轉(zhuǎn)基因玉米篩選檢測(cè)和監(jiān)控工作提供有效的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種應(yīng)用等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)磷酸甘露糖異構(gòu)酶的 方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1.磷酸甘露糖異構(gòu)酶核酸序列2.引物的設(shè)計(jì)通過(guò)I^rimer Premier 5. 0和01igo6. 0針對(duì)磷酸甘露糖異構(gòu)酶基 因設(shè)計(jì)特異性引物和特異性探針。磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的全基因序列1 TCCCCGATCA TGCAAAMCT CATTAACTCA GTGCMAACT ATGCCTGGGG CAGCAAAACG61 GCGTTGACTG MCTTTATGG TATGGMAAT CCGTCCAGCC AGCCGATGGC CGAGCTGTGG
121ATGGGCGCACATCCGAMAGCAGTTCACGAGTGCAGAATGCCGCCGGAGATATCGTTTCA
181CTGCGTGATGTGATTGAGAGTGATAMTCGACTCTGCTCGGAGAGGCCGTTGCCAAACGC
241TTTGGCGAACTGCCTTTCCTGTTCAMGTATTATGCGCAGCACAGCCACTCTCCATTCAG
301GTTCATCCAAACAAACACAATTCTGMATCGGTTTTGCCAAAGAMATGCCGCAGGTATC
361CCGATGGATGCCGCCGAGCGTAACTATAAAGATCCTAACCACAAGCCGGAGCTGGTTTTT
421GCGCTGACGCCTTTCCTTGCGATGAACGCGTTTCGTGAATTTTCCGAGATTGTCTCCCTA
481CTCCAGCCGGTCGCAGGTGCACATCCGGCGATTGCTCACTTTTTACAACAGCCTGATGCC
541GMCGTTTAAGCGAACTGTTCGCCAGCCTGTTGAATATGCAGGGTGAAGAAAAATCCCGC
601GCGCTGGCGATTTTAAMTCGGCCCTCGATAGCCAGCAGGGTGAACCGTGGCAMCGATT
661CGTTTAATTTCTGAATTTTACCCGGMGACAGCGGTCTGTTCTCCCCGCTATTGCTGAAT
721GTGGTGMATTGAACCCTGGCGAAGCGATGTTCCTGTTCGCTGAAACACCGCACGCTTAC
781CTGCAAGGCGTGGCGCTGGAAGTGATGGCAAACTCCGATAACGTGCTGCGTGCGGGTCTG
841ACGCCTMATACATTGATATTCCGGMCTGGTTGCCAATGTGAAATTCGAAGCCAAACCG
901GCTAACCAGTTGTTGACCCAGCCGGTGAAACAAGGTGCAGAACTGGACTTCCCGATTCCA
F3
961GTGGATGATTTTGCCTTCTCGCTGCATGACCTTAGTGATAAAGAAACCACCATTAGCCAG
F2
1021CAGAGTGCCGCCATTTTGTTCTGCGTCGAAGGCGATGCAACGTTGTGGAA AGGTTCTCAG
FlCBlC
1081CAGTTACAGCTTAAACCGGGTGAATCAGCGTTTATTGCCGCCAACGAATC ACCGGTGACTB21141 GTCAAAGGCC ACGGCCGTTT AGCGCGTGTT TACAACAAGC TGTAAGAGCT TACTGAAAMB31201 ATTA引物 1 :5-TCCCGATTCCAGTGGATGA引物 2 5-ACAGTCACCGGTGATTCGT 引物 3 5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC引物 4 5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT這一系列的引物可以使不與上述堿基序列的互補(bǔ)鏈完全互補(bǔ)的寡核苷酸。S卩，前 述各引物中，除3’末端的堿基以外的部分可以與完全互補(bǔ)的寡核苷酸有1-5個(gè)堿基不同。而且，本發(fā)明的磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用試劑，其特征在于，其為用于通過(guò)基因擴(kuò) 增法擴(kuò)增磷酸甘露糖異構(gòu)酶的試劑，含有上述本發(fā)明的磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物對(duì)。本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，其為通過(guò)基因擴(kuò)增法制備磷酸甘露 糖異構(gòu)酶擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，含有下述步驟以試樣中的核酸作為模板，使用本發(fā)明所述的磷 酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物對(duì)，在反應(yīng)液中擴(kuò)增所述的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的步驟。試樣可以是玉米、甜菜、小麥、水稻、木薯、甜橙和葡萄及其加工產(chǎn)品，通過(guò)磷酸甘 露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增來(lái)判斷其是否有轉(zhuǎn)基因成分。如果出現(xiàn)磷酸甘露糖異構(gòu)酶陽(yáng)性結(jié)果則試樣 中含有轉(zhuǎn)基因成分，如果出現(xiàn)磷酸甘露糖異構(gòu)酶陰性結(jié)果則試樣中不含轉(zhuǎn)基因成分。此外，根據(jù)常規(guī)方法，將等溫?cái)U(kuò)增的引物用于PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括以下組分Thermopol buffer、dNTP、MgS04、Betaine、ddH20、Bst DNApol。反應(yīng)體系組分可以有變化， 例如加入甘油、礦物油等。根據(jù)常識(shí)，各組分的體積可根據(jù)條件不同而變化，每次不同批次 試劑的最佳組合均可能會(huì)不同。反應(yīng)條件可以是55°C -65°C, 30-75分鐘。最佳的溫度可以是60°C _63°C，時(shí)間是 40-50分鐘。3.檢測(cè)方法其檢測(cè)方法可以是STOR Green染色方法，也可以是常規(guī)電泳或者實(shí)時(shí)熒光的方法。 PCR反應(yīng)體系可以和上述一致，也可以有變動(dòng)。酶可以是Bst DNApol，也可以是其他具有相同功能的酶。應(yīng)當(dāng)理解的是，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系可以是每個(gè)組分是單獨(dú)存放，在進(jìn)行擴(kuò)增前將 各組分按照合適的濃度加入，混勻后進(jìn)行反應(yīng)。也可以事先將所有的組分按照一定的配比 混好后，在進(jìn)行擴(kuò)增前加入去離子水和模板即可以進(jìn)行擴(kuò)增。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的引物能夠特異地?cái)U(kuò)增磷酸甘露糖異構(gòu)酶；2.能夠在等溫條件下對(duì)磷酸甘露糖異構(gòu)酶進(jìn)行擴(kuò)增，可以不用高端的儀器只需要 保溫杯即可完成擴(kuò)增，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；3.當(dāng)使用本發(fā)明的引物對(duì)時(shí)，能以優(yōu)于以往的擴(kuò)增效率進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此還能 夠縮短擴(kuò)增時(shí)間；4.由于本引物設(shè)計(jì)時(shí)針對(duì)目標(biāo)片段上6個(gè)不同的區(qū)域，因此檢測(cè)特異性提高，假 陰性結(jié)果大大降低，有效提高陽(yáng)性檢出率；5.適用范圍更加廣泛，不僅能檢測(cè)植株，而且能夠?qū)ι罴庸な称愤M(jìn)行檢測(cè)。總之，本發(fā)明的引物對(duì)、含有其的試劑以及使用他們的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法，能夠 迅速而簡(jiǎn)單地檢測(cè)磷酸甘露糖異構(gòu)酶，在檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)等是非常有效地。


圖 1 是用 SYBRG reen 染色進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果。1 :3272,2 :MIR604，3 :M0N89034,4 BT176, ,5 :1507,6 :M0N810，7 :M0N863，8 :NK603，9 :GA21，10 :BT21，11 空白對(duì)照。從該檢測(cè)
結(jié)果可以看出，1，2為磷酸甘露糖異構(gòu)酶陽(yáng)性。圖2 是用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。1 :3272,2 :MIR604，3 :M0N89034，4 :BT176，， 5:1507,6:M0N810，7 :M0N863，8:NK603，9:GA21，10 :BT21，11 空白對(duì)照，M :DL2000DNA
marker.從該檢測(cè)結(jié)果可以看出，圖2中1，2為磷酸甘露糖異構(gòu)酶陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解， 下面的實(shí)施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對(duì)上述本發(fā)明總體的限制。除非有 其它說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例使用本領(lǐng)域中的分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟 知的，并在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見(jiàn)，例如，分子克隆等。各引物長(zhǎng)度自身沒(méi)有特別的限制，可以適當(dāng)調(diào)整到通常的長(zhǎng)度，作為引物長(zhǎng)度的一例，例如在13-50mer的范圍內(nèi)，優(yōu)選1445mer，更優(yōu)選15_40mer。而且由于上述引物的3， 末端被固定，由引物延伸出的區(qū)域是固定的，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的總長(zhǎng)根據(jù)所使用的引物長(zhǎng) 度而變化。實(shí)施例1樣品已知是轉(zhuǎn)基因玉米事件3272，MIR604, M0N89034, BT176,1507, M0N810, M0N863，NK603, GA21，BT21，其中3272和MIR604磷酸甘露糖異構(gòu)酶陽(yáng)性，檢測(cè)時(shí)用到的引 物對(duì)為磷酸甘露糖異構(gòu)酶引物 1 5-TCCCGATTCCAGTGGATGA引物 2 5-ACAGTCACCGGTGATTCGT引物 3 5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC引物 4 5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT反應(yīng)體系如下表1磷酸甘露糖異構(gòu)酶檢測(cè)體系權(quán)利要求
1.一種磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物對(duì)，其特征在于，其為用于通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增法擴(kuò)增 磷酸甘露糖異構(gòu)酶的引物對(duì)，含有以下引物對(duì)引物 1 :5-TCCCGATTCCAGTGGATGA引物 2 5-ACAGTCACCGGTGATTCGT引物 3 :5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC引物 4 :5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物對(duì)，所述磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò) 增用引物對(duì)是用于擴(kuò)增生物試樣中的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物對(duì)，所述試樣可以是玉米、甜 菜、小麥、水稻、木薯、甜橙和葡萄及加工產(chǎn)品。
4.一種磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用試劑，其特征在于，其為用于通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增磷 酸甘露糖異構(gòu)酶的試劑，含有權(quán)利要求1所述的磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物對(duì)。
5.一種擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，其為通過(guò)基因擴(kuò)增法制備磷酸甘露糖異構(gòu) 酶擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，含有下述步驟以試樣中的核酸作為模板，適用權(quán)利要求1所述的磷酸 甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物對(duì)，在反應(yīng)液中擴(kuò)增所述的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法，其在所述步驟中，還向反應(yīng)液中添加 能夠與磷酸甘露糖異構(gòu)酶的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的熒光標(biāo)記探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法，其還含有下述步驟對(duì)于所述反應(yīng)液， 測(cè)定所述熒光標(biāo)記探針的熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)展產(chǎn)物的檢測(cè)方法，反應(yīng)條件可以是55-65°C，30-75分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)展產(chǎn)物的檢測(cè)方法可以是試紙條、常規(guī)電泳和染色法。
10.一種檢測(cè)結(jié)果的判斷方法，其特征在于，如果出現(xiàn)磷酸甘露糖異構(gòu)酶陽(yáng)性結(jié)果則試 樣中含有轉(zhuǎn)基因成分，如果出現(xiàn)磷酸甘露糖異構(gòu)酶陰性結(jié)果則試樣中不含轉(zhuǎn)基因成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磷酸甘露糖異構(gòu)酶等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，屬于食品檢驗(yàn)領(lǐng)域。本發(fā)明為一種磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用引物，以及一種磷酸甘露糖異構(gòu)酶擴(kuò)增用試劑及擴(kuò)增產(chǎn)物制備方法。本發(fā)明靈敏度高、精確度好，適合于玉米、甜菜、小麥、水稻、木薯、甜橙和葡萄中轉(zhuǎn)基因成分篩查，便于在各檢測(cè)機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102094085SQ201010566579
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者劉偉, 劉躍庭, 廖芳, 張?jiān)＞? 朱水芳, 賀艷, 鄭文杰 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心