專利名稱：：一種酸性β-甘露聚糖酶VMAN及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種酸性β-甘露聚糖酶及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘露聚糖是豆類、谷類中普遍存在的一種植物半纖維素，是由i3-l，4_D-甘露糖連接而成的線狀多聚體，具有高吸水性。飼料中所含的甘露聚糖在單胃動物的消化道內(nèi)大量吸水，使食糜粘度增加，從而對胃腸的蠕動產(chǎn)生抵抗作用，直接影響了動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。近年來，隨著豆類產(chǎn)品(豆粕等)在飼料中的廣泛應(yīng)用，甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)問題也越來越受到重視，在飼料中添加酶制劑是解決這一問題的主要途徑。甘露聚糖的完全酶解需要β_甘露聚糖酶、β_甘露糖苷酶、β_葡糖苷酶、半乳糖苷酶和脫乙酰酶的協(xié)同作用，其中甘露聚糖酶在飼料中的應(yīng)用比較廣泛。目前，一般選用大腸桿菌、釀酒酵母和畢赤酵母作為β-甘露聚糖酶基因的表達(dá)宿主。由于在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)量較低，蛋白易形成包涵體，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)困難。因此采用真核生物，如釀酒酵母和畢赤酵母等作為表達(dá)宿主成為當(dāng)前的主要趨勢。如雙孢菇(TangCΜ,etal..Thecel4geneofAgaricusbisporuseneodesaβ-mannanase.ApplEnvironMicrobiol,2001,67(5):2298_2303.)、貽貝(XuBingze,SellosD,JansonJC.CloningandexpressioninPichiapastorisofabluemussel(Mytilusedulis)β-mannanasegene.EurJBiochem，2002，269:1753.)、芽孢桿菌(譚秀華等.耐堿性甘露聚糖酶的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).微生物學(xué)報(bào)，2005，45(4)=543-544.)來源的甘露聚糖酶基因分別在畢赤酵母中得到成功表達(dá)，表達(dá)的酶活力分別為3.3U/ml、41.04U/ml、41.8U/ml。喬宇等將來自枯草芽抱桿菌的甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，最高酶活可達(dá)1102IU/ml，表達(dá)量為lmg/mL(喬宇，陳小兵，丁宏標(biāo)，岳明.甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].中國生物工程雜志，2006，26(7):52-56)。目前，真菌來源的β_甘露聚HBS基13，只有棘包曲β(ChristgauS,etal..Expressioncloning,purificationandcharacterizationofabeta~l,4-mannanasefromAspergillusaculeatus.BioehemMolBiolInt.1994，33(5)917-925)和里氏木酶(黃生平，汪昌麗，馬立新.一種新型巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及甘露聚糖酶的表達(dá).生物技術(shù)通訊，2007，18(2)=220-223.)的基因序列在釀酒酵母中得到了表達(dá)，但酶活較低?？傮w上來說，目前所報(bào)道的甘露聚糖重組酶酶活普遍較低，酶解產(chǎn)物組成不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本較高。因此篩選高比活酶基因，構(gòu)建高效產(chǎn)酶微生物，進(jìn)行基因改良，優(yōu)化酶的性質(zhì)，是當(dāng)前亟待解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，Aspergillusniger，其保藏號為CGMCCNo.4235。本發(fā)明的再一目的是提供一種來源于上述菌株的酸性β“甘露聚糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供上述酸性甘露聚糖酶的基因。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述β“甘露聚糖酶基因的重組載體本發(fā)明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重組菌株。本發(fā)明的再一目的是提供一種高效表達(dá)β“甘露聚糖酶的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述甘露聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明從土壤環(huán)境中篩選到一種天然菌株，黑曲霉AN070902(AspergiIlusniger)，該菌株于2010年10月20日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號是CGMCCNo.4235。從上述菌株中分離得到一種酸性β-甘露聚糖酶VMAN，其氨基酸序列如SEQIDN0.1所示MKFSSSLLALDSLALANVSTTLTKTSPAPSTSSSAASTSFPSTSGLQFTIDGETGYFAGT60NSYffIGFLTDSADVDLVMGHLKSSGLKILRVffGFNDVTSQPSSGTVffYQLDQDGKSTINT120GADGLQRLDYVVSSTEQHDIKLIINFINYffTNYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSA180YQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWVEKASKFLKGLDADRMVCIG240DEGFGLNIDSDGSYPYKFSEGLNFTMNVGIHTIDFGTLHLYPDSffGTSDDWGNGffITAHG300ATCKAAGKPCLLEEYGVTSNHCSVEGSffQKTALSATRVGADLFffQYGDDLSTGKSPDDGN360TIYYGTSDYQCLVTDHVADIHSA383該酶基因編碼383個(gè)氨基酸，N端前16個(gè)氨基酸為信號肽序列，其理論pI/Mw為4.48/41555.72。經(jīng)檢索表明，本發(fā)明獲得的甘露聚糖酶與已報(bào)道的來源于黑曲霉的甘露聚糖酶氨基酸序列同源性約94%(Cloning,expressioninPichiapastoris,andcharacterizationofathermostableGH5mannanendo—1,4_β—mannosidasefromAspergillusnigerBKO1)。本發(fā)明獲得的β_甘露聚糖酶最適溫度為65°C，最適pH值為3.0，因此本發(fā)明的甘露聚糖酶是一種酸性甘露聚糖酶。與已報(bào)道的黑曲霉的甘露聚糖酶相比具有更強(qiáng)的耐酸性。該酶在PH2.09.0的條件下酶活穩(wěn)定，動物消化道全程的各種PH環(huán)境均不會顯著降低酶活，同時(shí)蛋白酶體外水解實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明獲得的甘露聚糖酶具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化能力。此外，該重組酶的熱穩(wěn)定性較好，在70°C水浴中放置Ih酶活力仍能保持75%以上，在一定程度上能減少高溫制粒時(shí)引起的酶活喪失。因此該酶可廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中，有效降低動物胃腸道食糜的粘度，促進(jìn)動物對飼料的利用率。本發(fā)明還提供了編碼上述β-甘露聚糖酶的基因VMAN，該基因的序列如SEQIDN0.2所示atgaagttctccagctccctcctcgccctggatagcctggcgctggccaacgtctccacg60actctgacgaaaacctcccctgcaccgagcaccagcagcagtgctgcctccacctccttc120cccagcacctccggcctccaattcaccattgatggcgaaactggctacttcgccggaacg180aacagctactggatcggtttcctcactgacagcgcggacgtcgacctcgtcatgggccac240ctgaagtcgtccggcctcaagatcctccgcgtgtggggcttcaacgatgtcacctcgcag300ccctcctccggcacagtctggtaccaactggaccaggacggcaaatcgacaatcaacacg360ggtgccgacggtctccagcgcctcgactacgtcgtctcgtctaccgaacaacacgacatc420aaactcatcatcaacttcatcaactactggaccaattacggtggtatgtctgcgtacgtg480agcgcgtatggcggttccggcgagacggatttctataccagtgataccatgcagagtgcc540tatcagacatatatcaagacggtcgtggagcggtacagtaactcctcggcggtgtttgcg600tgggagttggcgaatgagccgagatgtccgagttgcgatacttctgtgttgtataactgg660gttgagaaggcgagtaagtttcttaaggggttggatgcggatcgtatggtttgtattggt720gatgagggcttcggtctcaacatcgactcggacggcagctacccttataaattctccgag780ggcttgaactttacgatgaacgtcggtatccatactattgactttggtaccctccacttg840taccctgatagctggggcacctccgacgactggggcaacggctggatcaccgcccacggc900gcaacctgcaaagcggccggcaagccatgtctcctggaggaatacggagtcacctcgaac960cactgcagtgtggagggctcgtggcagaagacagcgctcagcgcaacgcgcgtcggcgcg1020gatctgttctggcagtatggtgatgatttgagtaccgggaagtcgccggatgatgggaat1080actatctactatgggactagtgattatcagtgcctggtgacggatcatgttgctgatatt1140catagcgcctaa1152本發(fā)明通過同源克隆的方法分離得到上述β-甘露聚糖酶基因VMAN，該基因全長1152bp，其中l(wèi)-48bp為信號肽序列。本發(fā)明還提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因VMAN的重組載體，優(yōu)選為pPICzaA-VMAN。將本發(fā)明的β_甘露聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的β-甘露聚糖酶基因插入到質(zhì)粒pPICzalphaA上的EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICzαA-VMAN。本發(fā)明還提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因VMAN的重組菌株，優(yōu)選重組菌株是畢赤酵母菌株Χ33。本發(fā)明還提供了一種高效表達(dá)上述β-甘露聚糖酶基因VMAN的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，得重組菌株；2)重組菌株在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，誘導(dǎo)重組β-甘露聚糖的表達(dá)；以及3)發(fā)酵結(jié)束后，回收并純化所表達(dá)的β-甘露聚糖酶VMAN0其中，重組菌株在發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程可分為3個(gè)階段第一階段為菌體培養(yǎng)階段，按10%比例接入種子，培養(yǎng)24-30小時(shí)，以補(bǔ)完葡萄糖為標(biāo)志；第二階段為饑餓階段，當(dāng)葡萄糖補(bǔ)完之后，不流加任何碳源，當(dāng)溶氧上升至80%以上即表明該階段結(jié)束，為期約30-60min；第三階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并且保持溶氧在20%以上，培養(yǎng)時(shí)間在180-200小時(shí)之間。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理后獲得粗酶液。利用本發(fā)明的方法高效表達(dá)上述的重組甘露聚糖酶，可達(dá)到11785U/mL的發(fā)酵水平，同目前已有的現(xiàn)有技術(shù)相比，本法明的β-甘露聚糖酶通過高效表達(dá)后能夠達(dá)到更高的發(fā)酵水平。本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，從土壤中篩選、分離得到一種酸性β_甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)，可達(dá)到比現(xiàn)有技術(shù)更高的表達(dá)水平。因此，本發(fā)明的甘露聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中可大大降低生產(chǎn)成本，使其在飼料、食品、石油化工、釀酒等工業(yè)中顯示出更大應(yīng)用潛力。圖1重組甘露聚糖酶在50L罐中的發(fā)酵過程曲線圖2重組菌株分泌表達(dá)甘露聚糖酶的SDS-PAGE圖譜，1純化后的重組甘露聚糖酶；2對照Χ33；M蛋白標(biāo)準(zhǔn)。圖3重組甘露聚I套酶的最適反應(yīng)溫度圖4重組甘露聚I套酶的最適反應(yīng)PH值圖5重組甘露聚I套酶的溫度耐受性圖6重組甘露聚I套酶的PH耐受性圖7重組甘露聚I套酶在胃蛋白酶，胰蛋白酶處理后剩余酶活圖8金屬離子和EDTA對重組甘露聚糖酶酶活力的影響m曲志閱霉AN070902(Aspergillusniger)，該菌株于2010年10月20日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號是CGMCCNo.4235。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)驗(yàn)材料和試劑1、菌株與載體大腸桿菌菌株ToplO、畢赤酵母X33、載體pPICzalphaA購自Invitrogen公司，載體pMD18-T購自TaKaRa公司。2、酶與試劑盒逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMIII、RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR純化試劑盒購自上海生工公司。限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司。3、培養(yǎng)基基本鹽培養(yǎng)基磷酸氫二銨5%、磷酸二氫鉀0.5%、七水硫酸鎂1.5%、硫酸鉀1.95%、硫酸鈣0.1%、氫氧化鉀0.1%、消泡劑0.03%。高壓后每升加4.35毫升PTMlPTMl(微量鹽溶液)硫酸銅0.6%、碘化鉀0.018%、一水硫酸錳0.3%、二水鉬酸鈉0.02%、硼酸0.002%、六水氯化鈷0.05%、氯化鋅2%、七水硫酸鐵6.5%、濃硫酸0.5%、生物素0.02%實(shí)施例1、產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株Aspergillusniger的分離、培養(yǎng)從魔芋根附近的天然土壤中分離得到一株具有甘露聚糖酶活性的霉菌，后經(jīng)鑒定為黑曲霉Aspergillusniger(保藏編號CGMCCNo.4235)實(shí)施例2、黑曲霉Aspergillusnigerβ-甘露聚糖酶基因VMAN的克隆運(yùn)用RNA提取試劑盒，提取黑曲霉Aspergillusniger總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄酶superscriptIIIReverseTranscriptase操作說明合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)甘露聚糖酶引物(VMAN5EcoRI，VMAN3NotI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物由EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)過同樣酶切的畢赤酵母表達(dá)載體pPICzalphaA相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素Zeocin篩選后，獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒。送樣到上海英駿生物公司測序，測序結(jié)果表明，獲得克隆DNA插入片段含有β-甘露聚糖酶基因完整的開放閱讀框。該β-甘露聚糖酶基因VMAN，全長1152bp，編碼383個(gè)氨基酸。得到的重組表達(dá)載體命名為PPICzαA-VMAN。VMAN5EcoRI5’CTGAAGCTGAATTCAAGTTCTCCAGCTCCCTCCTCACC3'VMAN3NotI5，AAAGCTGGCGGCCGCTTAGGCGCTATGAATATCAGCAACATG3，實(shí)施例3、包含β-甘露聚糖酶基因VMAN的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建將上述重組表達(dá)載體pPICzαA-VMAN用SacI進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母Χ33，得到畢赤酵母重組菌株X33/VMAN。實(shí)施例4、β-甘露聚糖酶重組菌株的高效表達(dá)將上述重組菌X33/VMAN單菌落進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。配制20L基本鹽培養(yǎng)基，在50L自動控制發(fā)酵罐中滅菌后，冷卻至常溫備用。用氨水和磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ρΗ值至4.8，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和空氣流量控制溶氧大于30%，發(fā)酵溫度為30°C。整個(gè)發(fā)酵過程分3個(gè)階段第一階段為菌體培養(yǎng)階段，將重組菌X33-VMAN-pPIC按照10%的接種量接種至發(fā)酵罐中，流加已滅菌的4L50%的葡萄糖，培養(yǎng)24-30小時(shí)，以補(bǔ)完葡萄糖為標(biāo)志；第二階段為饑餓階段，當(dāng)葡萄糖補(bǔ)完之后，不流加任何碳源，當(dāng)溶氧上升至80%以上即表明該階段結(jié)束，為期約30-60min；第三階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并且保持溶氧在20%以上，培養(yǎng)時(shí)間在180-200小時(shí)之間。發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理后獲得酶液。在發(fā)酵過程中的不同時(shí)間點(diǎn)取樣測定酶活，發(fā)酵過程中甘露聚糖酶的表達(dá)情況如圖1所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)192h的發(fā)酵液酶活為11785U/mL。實(shí)施例5、重組β-甘露聚糖酶的活性分析采用DNS法測定水解產(chǎn)生的還原糖。1個(gè)酶活單位(U)定義為在55°C、ρΗ5.0的條件下，每分鐘分解槐豆膠中的β“甘露聚糖產(chǎn)生具有還原能力相當(dāng)于1μmol甘露糖所需的酶量。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，每個(gè)樣品測定均設(shè)三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，相對誤差控制在8%以內(nèi)。實(shí)施例6、重組β-甘露聚糖酶VMAN的性質(zhì)測定1、β-甘露聚糖酶VMAN的分子量大小和比活將上述發(fā)酵液中的β-甘露聚糖酶通過離子交換柱(QSepharoseFastFlowIonExchanger)純化，采用改良型Bradford試劑盒(上海Sangon公司)測定蛋白濃度，得出該甘露聚糖酶比活為2153U/mg，將純化后的蛋白液進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測(見圖2)。2、β-甘露聚糖酶VMAN的最適反應(yīng)溫度及ρΗ測定最適反應(yīng)溫度將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度(2580°C)下反應(yīng)，測定β_甘露聚糖酶的酶活。以在55°C的酶活力為基礎(chǔ)，其它溫度下測得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對酶活。最適反應(yīng)ρΗ:將稀釋后的酶液，與不同ρΗ(2.O7.5)的0.4M磷酸鈉_醋酸鈉_硼酸鈉緩沖液配制的槐豆膠底物反應(yīng)，分別測定相對于PH5.O的相對酶活。結(jié)果如圖3和圖4所示該重組β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為65°C，最適反應(yīng)ρΗ為3.O。3、β-甘露聚糖酶VMAN的溫度及ρΗ穩(wěn)定性的測定溫度穩(wěn)定性將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度(6580°C)下處理酶液5、10、20、30、40、60min后，以未處理的酶活力為對照測定β-甘露聚糖酶的相對酶活。ρΗ穩(wěn)定性將稀釋后的酶液與不同PH的緩沖液混合，室溫放置2h，以未處理的酶液為對照，測定β-甘露聚糖酶的相對酶活。結(jié)果如圖5和圖6所示該重組酶在低于70°C下穩(wěn)定性較好，在70°C水浴中放置Ih酶活仍能保持75%以上，但在75°C和80°C放置IOmin后，酶活分別僅剩47%和10%；該酶的ρΗ穩(wěn)定范圍較廣，在pH2.O9.O的環(huán)境下室溫保持2h，酶活未見顯著下降。4、β-甘露聚糖酶VMAN對胃蛋白酶、胰蛋白酶消化耐受性測定取0.ImL甘露聚糖酶液，分別加入0.5mL0.lmg/mL胃蛋白酶(pH2.0濃度80U/mL)和0.5mL0.lmg/mL胰蛋白酶(ρΗ7·0濃度150U/mL)，于37°C處理2h后測酶活。結(jié)果如圖7所示，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2h后，甘露聚糖酶酶活分別維持在80%和65%左右，具有較好的抗胃蛋白酶和抗胰蛋白酶活性。5、金屬離子和EDTA對酶活力的影響將含有ImMK+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Cu2+和EDTA的溶液與稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液混合，室溫放置30min，以未處理的酶液為對照，測定β-甘露聚糖酶的相對酶活。結(jié)果如圖8所示，在供試的9種金屬離子中，ImM的Fe3+和Mn2+對該酶的活性有顯著抑制作用，而ImMCo2+對該酶有激活作用，其余ImM的金屬離子和EDTA對該酶酶活影響不顯著。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)β-甘露聚糖酶的黑曲霉Aspergillusniger，其保藏號為=CGMCCNo.423502.—種酸性β-甘露聚糖酶VMAN，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一種酸性β-甘露聚糖酶基因VMAN，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的β-甘露聚糖酶。4.如權(quán)利要求3所述的酸性β-甘露聚糖酶基因VMAN，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.2所示。5.包含權(quán)利要求3或4所述的β-甘露聚糖酶基因的重組載體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPICzαA-VMAN。7.包含權(quán)利要求3或4所述甘露聚糖酶基因的重組菌株。8.一種高效表達(dá)甘露聚糖酶VMAN的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求6所述的重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，得重組菌株；2)重組菌株在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，誘導(dǎo)重組甘露聚糖酶的表達(dá)；以及3)發(fā)酵結(jié)束后，回收并純化所表達(dá)的甘露聚糖酶VMAN。9.權(quán)利要求2所述的β-甘露聚糖酶VMAN在飼料添加劑、食品、石油化工、釀酒工業(yè)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供一種來源于Aspergillusniger保藏編號是CGMCCNo.4235的β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述β-甘露聚糖酶的基因，其序列如SEQIDNO.2所示。該甘露聚糖酶的最適溫度為75℃，最適pH值為3.0，是一種酸性的β-甘露聚糖酶，因此，在動物腸胃的酸性環(huán)境中能夠更有效的降低甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，促進(jìn)動物對飼料的利用率。本發(fā)明還提供了該甘露聚糖酶基因高效表達(dá)的方法，其表達(dá)量可達(dá)到11785U/mL，同現(xiàn)有技術(shù)相比其表達(dá)量更高，因此，可大大降低工業(yè)生產(chǎn)成本，使其在飼料、食品、石油化工、釀酒等工業(yè)中顯示出更大的應(yīng)用潛力。文檔編號C12N15/63GK102002465SQ201010566249公開日2011年4月6日申請日期2010年11月24日優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日發(fā)明者吳迪,張娟,汪云飛,羅長財(cái),謝建華,陳麗芝申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司