專利名稱：一種制備β-甘露聚糖酶的方法及專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備β -甘露聚糖酶的方法及專用菌株。
背景技術(shù)：
β -甘露聚糖酶(β -l，4-D-mannan mannohydrolase ；EC31211178)是一類降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈3-l，4-D-甘露吡喃糖的酶，它在利用現(xiàn)存在于一些植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕櫚樹的堅(jiān)果、瓜爾豆、洋槐、咖啡樹以及魔芋的塊莖中的各種甘露聚糖有著潛在的重要性。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)主要用于造紙工業(yè)紙漿的漂白、油井的破膠、降解植物膠生產(chǎn)低聚糖用作雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子，防病抗衰老的保健食品以及飼料工業(yè)中作為抗?fàn)I養(yǎng)因子。β -甘露聚糖酶按其最適PH值的不同有酸性、中性、堿性之分，其中堿性β -甘露聚糖酶是指在堿性條件下催化活力最高的β -甘露聚糖酶，其研究相對(duì)較晚，發(fā)現(xiàn)主要由嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)生，某些地衣芽孢桿菌也產(chǎn)生堿性β -甘露聚糖酶，如楊文博等報(bào)道了一株地衣芽孢桿菌ΝΚ-27，其最適ρΗ值為9.0。一般情況下枯草芽孢桿菌，放線菌等產(chǎn)生中性 β-甘露聚糖酶，而霉菌產(chǎn)生酸性β-甘露聚糖酶。第一個(gè)堿性甘露聚糖酶由Akino等發(fā)現(xiàn)。馬延和等于1991報(bào)道了嗜堿芽孢桿菌Ν16-5的三個(gè)胞外堿性甘露聚糖酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)，并于2004年報(bào)道了其中一種嗜堿甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004年發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬的一個(gè)菌株JAMB-602產(chǎn)堿性甘露聚糖酶，此酶屬于GH家族5，最適ρΗ為 9。目前所發(fā)現(xiàn)的嗜堿甘露聚糖酶的最適PH值最高為10，由Takeda等于2004年報(bào)道。堿性β-甘露聚糖酶不僅可以生產(chǎn)用作雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子的低聚糖，而且在需堿性環(huán)境的紙漿漂白等工業(yè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。但到目前為止，堿性甘露聚糖酶的制備仍舊是限制其工業(yè)應(yīng)用的瓶頸，前人的報(bào)道中無論是使用堿性β -甘露聚糖酶的原產(chǎn)菌株還是使用重組菌株生產(chǎn)，其產(chǎn)量都比較低。馬延和等于1991報(bào)道了嗜堿芽孢桿菌Ν16-5的三個(gè)胞外堿性甘露聚糖酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)，并于2004年報(bào)道了其中一種嗜堿甘露聚糖酶的基因序列，其基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位所示。PTM1 溶液將 Cu SO4 ·5Η20 6g，KI 0. 08g, MnSO4 2. 68g, H3BO3 0. 02g, Na2MoO4 ·2Η20 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 20g, FeSO4 · 7H20 65g, CoCl2 · 6H20 0. 916，H2S045mL,生物素 0. 2g 混合， 用水定容至1升，得到PTM1溶液。每1升BMGY液體培養(yǎng)基按照如下方法制備將8克-12克或10克酵母提取物、18 克-22克或20克蛋白胨、12克-15克或13. 4克YNB、3X 10_4克-5X 10_4克或4X 10_4克生物素和8克-12克或10克甘油溶于水中，用水定容至1升，得到BMGY液體培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明所提供的重組菌，是將甘露聚糖酶的編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌株，得到的重組菌；所述β -甘露聚糖酶的編碼基因序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位核苷酸所示。上述重組菌中，所述β-甘露聚糖酶的編碼基因是通過重組載體導(dǎo)入出發(fā)菌株的；所述重組載體為如下(1)或( 或C3)所示(1)將 SEQ ID NO 1 所示 DNA 片段插入 pA0815alpha 的 XhoI 和 EcoRI 酶切位點(diǎn)間，得到的重組載體，記作ρΑΟ α-Isman ；其中，XhoI酶切位點(diǎn)位于SEQ ID NO :1所示DNA片段的5'端上游，EcoRI酶切位點(diǎn)位于SEQ ID NO 1所示DNA片段的3‘端下游；(2)用 BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -Isman,回收 2932bp 片段；用 BamHI 單酶切 ρΑΟ α-Isman,回收載體大片段；將所述^32bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 ρΑΟ α -2sman ；(3)用 BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -2sman,回收 5864bp 片段；用 BamHI 單酶切 pA0a-2sman,回收載體大片段；將所述5864bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 PAO α -4sman ；所述pA0815alpha按照如下方法得到將載體pPICZ α用McI/EcoRI雙酶切，收集IOOObp片段；用McI/EcoRI雙酶切載體pA0815，回收載體大片段；將所述IOOObp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體即為pA0815alpha ；所述出發(fā)菌株為酵母菌，優(yōu)選為畢赤酵母菌，再優(yōu)選為巴斯德畢赤酵母菌株 GS115。上述重組菌中，所述重組菌為巴斯德畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS4SMAN，其保藏編號(hào)為 CGMCC N0. 4095。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備甘露聚糖酶的方法。本發(fā)明所提供的制備甘露聚糖酶的方法，包括如下步驟將上述任一所述重組菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，得到甘露聚糖酶；將發(fā)酵容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作發(fā)酵體系。上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，且其中含有甘油；所述發(fā)酵培養(yǎng)依次按照如下三個(gè)階段進(jìn)行階段一包括如下步驟從接種開始培養(yǎng)至發(fā)酵體系中的甘油耗盡；階段二 包括如下步驟在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)，開始流加甘油或甘油溶液， 培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D_值達(dá)到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；階段三為如下1)或2)所示1)包括如下步驟在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)，向發(fā)酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；2)包括如下步驟在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)，將發(fā)酵體系的溫度調(diào)至^TC 四°C或沈°C或27°C或觀°C或四°C，向發(fā)酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；所述甘油溶液由甘油、PTM1溶液和水組成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM1溶液和水組成。上述方法中，所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇與甲醇的質(zhì)量比為1 20 1 5 或 1 20 或 1 10 或 1 5。上述方法中，所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇的濃度為36g/L_144g/L 或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的濃度為720g/L。上述方法中，所述階段一和所述階段二中的培養(yǎng)在pH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為30%以上的條件下進(jìn)行；上述方法中，所述階段三中的1)中，誘導(dǎo)表達(dá)在PH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為 30%以上的條件下進(jìn)行；上述方法中，所述階段三中的2)中，誘導(dǎo)表達(dá)在pH值為6.0、溫度為 或或27°C或或^°C、溶氧為30%以上的條件下進(jìn)行。上述方法中，所述階段三中，誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間為60h_160h，具體為iai_84h或 36h-84h 或 48h-84h 或 60h_84h 或 19h_i;34h 或 43h_i;34h 或 64h_i;34h 或 86h_i;Mh 或 lllh-134h ；再具體為 12h、36h、48h、60h、72h、84h 或 19h、43h、64h、86h、Illh 或 134h ；上述方法中，所述階段一中，所述接種量為5% ；上述方法中，所述階段三中，所述在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)為從停止流加甘油時(shí)計(jì)起，0.5 Ih后；(在補(bǔ)加甲醇前，將溫度降至沈 四1，菌體及饑餓0.5 111，以耗盡甘油，達(dá)到AOXl啟動(dòng)子去阻遏的目的)。上述方法中，所述溶氧為30%以上為溶氧為30% -100% ；上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY液體培養(yǎng)基；上述方法中，所述甘油溶液按照如下方法制備將600g-650g或625g甘油、 1 Oml-Hml或12mL PTM1溶液混合，用水定容至1升。上述方法中，所述階段三中，所述向發(fā)酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的方式為先向發(fā)酵體系中加入甲醇，使甲醇在發(fā)酵體系中的體積濃度為3/1000-7/1000或5/1000，1. 5小時(shí)-2. 5小時(shí)或2小時(shí)后，再向發(fā)酵體系中流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液；上述方法中，所述階段一中，所述溶氧為30%以上是通過向發(fā)酵體系中通入空氣并調(diào)節(jié)通入空氣的速率和攪拌發(fā)酵體系并調(diào)節(jié)攪拌發(fā)酵體系的速率實(shí)現(xiàn)的；所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min-1. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/ min ；上述方法中，所述階段二中，所述溶氧為30%以上是通過向發(fā)酵體系中通入空氣并調(diào)節(jié)通入空氣的速率、攪拌發(fā)酵體系并調(diào)節(jié)攪拌發(fā)酵體系的速率、和調(diào)節(jié)甘油或甘油溶液的流加速率實(shí)現(xiàn)的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min-1. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min ；所述流加甘油或甘油溶液的速率為5ml甘油或甘油溶液/L發(fā)酵培養(yǎng)基/h-15ml甘油或甘油溶液/L發(fā)酵培養(yǎng)基/h ；上述方法中，所述階段三中，所述溶氧為30%以上是通過向發(fā)酵體系中通入空氣并調(diào)節(jié)通入空氣的速率、攪拌發(fā)酵體系并調(diào)節(jié)攪拌發(fā)酵體系的速率、和調(diào)節(jié)山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的流加速率實(shí)現(xiàn)的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min-1. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min ；所述流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的速率為anl山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液/L發(fā)酵培養(yǎng)基/h-6ml山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液/L發(fā)酵培養(yǎng)基/h。本發(fā)明公開的重組菌含有多個(gè)拷貝的、由甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的甘露聚糖酶基因。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的用該重組菌進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)堿性甘露聚糖酶的工藝，可使最終堿性甘露聚糖酶在84h的誘導(dǎo)周期內(nèi)，酶活達(dá)到6336u/ml。本發(fā)明方法成本低、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高。 因此，本發(fā)明方法在甘露聚糖酶的制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為分泌型表達(dá)載體pA0815alpha的構(gòu)建示意圖。圖2為重組表達(dá)載體ρΑΟ α -lsman, ρΑΟ α -2sman, ρΑΟ α -4sman的構(gòu)建示意圖。圖3為重組菌GS4SMAN在甲醇誘導(dǎo)高密度發(fā)酵結(jié)果。圖4為重組菌GS4SMAN在山梨醇混合補(bǔ)料，30°C誘導(dǎo)時(shí)高密度發(fā)酵結(jié)果圖5為重組菌GS4SMAN在山梨醇混合補(bǔ)料，誘導(dǎo)時(shí)高密度發(fā)酵結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、堿性甘露聚糖酶分泌表達(dá)載體的構(gòu)建一、堿性甘露聚糖酶基因的克隆設(shè)計(jì)和合成引物引物 I(Forward) 5’ ATATCTCGAGAAAAGATCCCCATCAGAAGC 3'引物 2 (Reverse) 5’ CGGGCGAATTCTATCTTAAAGTAACATTAT 3，在α -mating因子信號(hào)肽編碼序列下游有一個(gè)BioI酶切位點(diǎn)(CTCGAG，對(duì)應(yīng)氨基酸為L(zhǎng)eu-Glu)，其后緊跟一個(gè)Kex2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(AAAAGA，對(duì)應(yīng)氨基酸序列Lys-Arg)，因此，引物1的設(shè)計(jì)是在甘露聚糖酶基因之前引入》ιοΙ位點(diǎn)和Kex2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)序列。通過該設(shè)計(jì)，即可將甘露聚糖酶基因直接連接在信號(hào)肽序列之后，這樣蛋白翻譯后，在畢赤酵母自身Kex2蛋白酶的作用下，即可切表達(dá)出氨基酸不變的目的蛋白(而不會(huì)因酶切位點(diǎn)的原因引入額外的氨基酸殘基)。引物2包含終止密碼子TAG，并引入一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)。以嗜堿芽孢桿菌附6_5總DNA為模板(或以人工合成的SEQ ID NO :1所示基因?yàn)槟０?，加入引物1、引物2、HiFi Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，進(jìn)行降落PCR(touchdown PCR)，反應(yīng)條件如下:94V 5min ；94°C 30s, 60-50°C 30s, 72°C 90s，每個(gè)循環(huán)降 1°C，共 10 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，共 25 個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增得到1400bp的片段，命名為sman，用Omega純化試劑盒純化后，連接入 PMD18-T載體(購(gòu)自TaKaRa公司)，得到重組載體pMD18_sman，將pMD18_sman送北京奧科進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增得到的片段中含有SEQ ID NO :1所示序列。二、分泌表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建流程如圖1和圖2所示。pA0815alpha 的制備 JfpPICZa (購(gòu)自 Invitrogen 公司)用 SacI/EcoRI 雙酶切， 收集IOOObp片段(即含有α -mating因子信號(hào)肽編碼基因的片段)；用McI/EcoRI雙酶切pA0815載體(購(gòu)自hvitrogen公司)，回收載體大片段；將所述IOOObp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體即為pA0815alpha ；1、單拷貝堿性甘露聚糖酶分泌表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟一得到的pMD18_sman用XhoI和EcoRI雙酶切，與同樣經(jīng)過XhoI和EcoRI 雙酶切的pA0815alpha質(zhì)粒連接，形成單拷貝堿性甘露聚糖酶分泌表達(dá)載體ρΑΟ α -Isman02、2拷貝sman的菌株的獲得將步驟1中得到的重組表達(dá)載體ρΑΟ α -Isman用BamHI/BglII雙酶切，回收 2932bp 片段(即 BamHI-sman-Bglll 片段)；用 BamHI 單酶切 ρΑΟ α -lsman,回收載體大片段；將所述^32bp片段和所述載體大片段連接，即可得2拷貝sman的表達(dá)載體 ρΑΟα -2sman ；3、4拷貝sman的菌株的獲得用BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -2sman,回收 5864bp 片段(艮口 BamHI-sman-sman-Bglll片段)；用BamHI單酶切pAOa -2sman，回收載體大片段；將所述 5864bp片段和所述載體大片段連接，即可得4拷貝sman的表達(dá)載體ρΑΟ α -4sman。三、表達(dá)甘露聚糖酶的酵母菌株的獲得1、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的制備接種巴斯德畢赤酵母菌株GS115(Invitrogen，Ca. 18100)于500ml YPD培養(yǎng)基(10 克/升酵母膏、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、15克/升瓊脂糖)，30°C，200r/min培養(yǎng)至0D600 = 1.3-1.5。4°C，l，500g離心5min收集菌體，分別用500ml、250ml預(yù)冷的滅菌水和20ml預(yù)冷的lmol/L山梨醇各洗一次。每次洗后均在4°C，1，500g下離心5min收集菌體，最后用Iml預(yù)冷的lmol/L山梨醇懸浮，即獲得電擊感受態(tài)細(xì)胞。2、重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞將實(shí)驗(yàn)二中構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒ρΑΟ α -lsman、pA0 α -2sman和ρΑΟ α -4sman 各約IOug分別用MlI酶切線性化，乙醇沉淀回收線性DNA并溶解于IOul無菌水中。將上述線性化DNA與80ul GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中。采用美國(guó) BIO-RAD公司電轉(zhuǎn)化儀，根據(jù)所使用電轉(zhuǎn)化儀預(yù)設(shè)的畢赤酵母參數(shù)進(jìn)行電擊。電擊結(jié)束后立即加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇至電擊杯中，然后將電擊杯中的溶液全部轉(zhuǎn)移至一無菌離心管中，37°C孵育l_2h，取500ul涂布MD O克/升葡萄糖、13. 4克/升YNB、4X 10_4克/升生物素、1. 5克/升瓊脂)平板，于30°C倒置培養(yǎng)2-4天直至菌落出現(xiàn)。至此，得到含1、2、4拷貝sman的重組畢赤酵母菌株。含有1拷貝sman的重組畢赤酵母菌株(即轉(zhuǎn)入ρΑΟ α -Isman的重組畢赤酵母菌株)的分子鑒定方法以GAP基因?yàn)閮?nèi)參基因，用熒光定量PCR法測(cè)定該菌株sman的拷貝數(shù)為1拷貝。具體測(cè)定方法參見Taicheng Zhu et al.，Efficient generation of multi-copystrains for optimizing secretory expression of porcine insulin precursor in yeast Pichiapastoris, Journal of Applied Microbiology,2009,107 954-963 ；含有2拷貝sman的重組畢赤酵母菌株(即轉(zhuǎn)入ρΑΟ α -2sman的重組畢赤酵母菌株)的分子鑒定方法以GAP基因?yàn)閮?nèi)參基因，用熒光定量PCR法測(cè)定該菌株sman的拷貝數(shù)為2拷貝。含有4拷貝sman的重組畢赤酵母菌株(即轉(zhuǎn)入ρΑΟ α -4sman的重組畢赤酵母菌株)的分子鑒定方法以GAP基因?yàn)閮?nèi)參基因，用熒光定量PCR法測(cè)定該菌株sman的拷貝數(shù)為4拷貝。四、重組菌株的搖瓶發(fā)酵1、重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)將步驟三中獲得的表達(dá)堿性甘露聚糖酶的單拷貝sman的菌株、2拷貝sman的菌株和4拷貝sman的菌株分別接種于25ml BMGY液體培養(yǎng)基中(10克/升酵母精提物、20克/ 升蛋白胨，121°C滅菌20min后，溫度降至室溫時(shí)加入13. 4克/升YNB、4X 10_4克/升生物素、10克/升甘油)，于30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h，OD600達(dá)20，3000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1-2次。將菌體用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(10克/升酵母精提物、20克/升蛋白胨，121°C滅菌20min后，溫度降至室溫時(shí)加入13. 4克/升YNB、4X 10_4 克/升生物素、0. 5%甲醇)，稀釋至OD6tltl = 10，用4層紗布代替棉花塞，于30°C，200r/min 搖床培養(yǎng)。每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5% (V/V)。在30°C培養(yǎng)3天后，取發(fā)酵液進(jìn)行酶活檢測(cè)。將發(fā)酵容器中的所有物質(zhì)記作發(fā)酵液。2、胞外酶活的測(cè)定吸取發(fā)酵液ImL于離心管中，以lOOOOr/min離心lOmin，吸取上清液于試管中。加 Λ 0. Olml稀釋的樣品溶液和0. 19mL反應(yīng)液，72°C保溫IOmin ；加入0. 2ml DNS,煮沸5min ； 取上清液在540nm處測(cè)定吸光值。以滅過活的酶液做空白對(duì)照，空白對(duì)照的處理方法與樣品的處理一樣。酶活定義在37°C、pH值為9. O的條件下，每分鐘降解甘露聚糖釋放1 μ mol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U。滅過活的酶液的制備方法將步驟1得到的上清液在100°C煮沸5min，得到滅過活的酶液?；倍鼓z購(gòu)自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為G0753?；倍鼓z的主要成分為甘露聚糖。反應(yīng)液配制方法將0. 5g槐豆膠放入250ml燒杯中，加入90ml在70°C預(yù)熱的 pH9. 0,0. 05M甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(50ml0. 2M甘氨酸+8. 8ml0. 2N氫氧化鈉，加水稀釋至200ml)磁力攪拌混勻，然后用水定容到500ml，得到反應(yīng)液。DNS 稱取酒石酸鉀鈉182. 0g，溶于500mL蒸餾水中，加熱(不超過50°C )，于熱溶液中依次加入3，5- 二硝基水楊酸6. 3g，NaOH 21. 0g,苯酚5. Og,無水亞硫酸鈉5. Og,攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至IOOOmL,貯存于棕色瓶中，室溫保存。酶活與OD54tl的換算公式為發(fā)酵液酶活=[(0D540+0. 187)/0. 025/18] X發(fā)酵液稀釋倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。誘導(dǎo)發(fā)酵7 后，1-4拷貝菌株搖瓶發(fā)酵液酶活見表1。同時(shí)以轉(zhuǎn)入pA0815alpha 的畢赤酵母菌株GS115為對(duì)照，結(jié)果對(duì)照與空白對(duì)照結(jié)果相同，檢測(cè)不到酶活。表1.不同拷貝菌株的酶活
9
權(quán)利要求
1.一種重組菌，是將甘露聚糖酶的編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌株，得到的重組菌；所述 β -甘露聚糖酶的編碼基因序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位核苷酸所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于所述甘露聚糖酶的編碼基因是通過重組載體導(dǎo)入出發(fā)菌株的；所述重組載體為如下(1)或( 或C3)所示(1)將SEQID NO 1所示DNA片段插入pA0815alpha的XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)間，得到的重組載體，記作ρΑΟ α -Isman ；其中，XhoI酶切位點(diǎn)位于SEQ ID NO=I所示DNA片段的 5'端上游，EcoRI酶切位點(diǎn)位于SEQ ID NO :1所示DNA片段的3'端下游；(2)用BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -Isman,回收 2932bp 片段；用 BamHI 單酶切 ρΑΟ α-Isman,回收載體大片段；將所述^32bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 ρΑΟ α -2sman ；(3)用BamHI/Bglll 雙酶切 pAOa -2sman，回收 5864bp 片段；用 BamHI 單酶切 pA0a-2sman,回收載體大片段；將所述5864bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 PAO α -4sman ；所述pA0815alpha按照如下方法得到將載體pPICZa用McI/EcoRI雙酶切，收集 IOOObp片段；用McI/EcoRI雙酶切載體pA0815，回收載體大片段；將所述IOOObp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體即為pA0815alpha ；所述出發(fā)菌株為酵母菌，優(yōu)選為畢赤酵母菌，再優(yōu)選為巴斯德畢赤酵母菌株GS115。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)GS4SMAN，其保藏編號(hào)為 CGMCC N0. 4095。
4.一種制備β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1-3中任一所述重組菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，得到甘露聚糖酶；將發(fā)酵容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作發(fā)酵體系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，且其中含有甘油；所述發(fā)酵培養(yǎng)依次按照如下三個(gè)階段進(jìn)行階段一包括如下步驟從接種開始培養(yǎng)至發(fā)酵體系中的甘油耗盡；階段二 包括如下步驟在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)，開始流加甘油或甘油溶液，培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D_值達(dá)到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；階段三為如下1)或2)所示1)包括如下步驟在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)，向發(fā)酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；2)包括如下步驟在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)，將發(fā)酵體系的溫度調(diào)至^rc ^rc或沈°C或27 °C或觀°C或四°C，向發(fā)酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；所述甘油溶液由甘油、PTM1溶液和水組成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM1溶液和水組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中， 山梨醇與甲醇的質(zhì)量比為1 20 1 5或1 20或1 10或1 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇的濃度為36g/L-144g/L或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的濃度為720g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述階段一和所述階段二中的培養(yǎng)在PH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為30%以上的條件下進(jìn)行；所述階段三中的1)中，誘導(dǎo)表達(dá)在PH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為30%以上的條件下進(jìn)行；所述階段三中的2)中，誘導(dǎo)表達(dá)在pH值為6. 0、溫度為 或或27°C或觀！或四！、溶氧為30%以上的條件下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述階段三中，誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間為 60h-160h，具體為 12h-84h 或 36h_84h 或 48h_84h 或 60h_84h 或 19h_i;34h 或 43h_i;34h 或 64h-134h 或 86h_134h 或 lllh_134h ；再具體為 12h、36h、48h、60h、72h、84h 或 19h、43h、 64h、86h、lllh 或 134h ；所述階段一中，所述接種量為5% ；所述階段三中，所述在發(fā)酵體系中的甘油耗盡時(shí)為從停止流加甘油時(shí)計(jì)起，0. 5 Ih后；所述溶氧為30%以上為溶氧為30% -100% ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY液體培養(yǎng)基；所述甘油溶液按照如下方法制備將600g-650g或625g甘油、IOml-Hml或UmLPTM1 溶液混合，用水定容至1升。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述階段三中，所述向發(fā)酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的方式為先向發(fā)酵體系中加入甲醇，使甲醇在發(fā)酵體系中的體積濃度為3/1000-7/1000 或5/1000，1. 5小時(shí)-2. 5小時(shí)或2小時(shí)后，再向發(fā)酵體系中流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液；所述階段一中，所述溶氧為30%以上是通過向發(fā)酵體系中通入空氣并調(diào)節(jié)通入空氣的速率和攪拌發(fā)酵體系并調(diào)節(jié)攪拌發(fā)酵體系的速率實(shí)現(xiàn)的；所述攪拌速率為 200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min-1. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/ min ；所述階段二中，所述溶氧為30%以上是通過向發(fā)酵體系中通入空氣并調(diào)節(jié)通入空氣的速率、攪拌發(fā)酵體系并調(diào)節(jié)攪拌發(fā)酵體系的速率、和調(diào)節(jié)甘油或甘油溶液的流加速率實(shí)現(xiàn)的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/ min-1. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min ；所述流加甘油或甘油溶液的速率為5ml甘油或甘油溶液/L 發(fā)酵培養(yǎng)基/h_15ml甘油或甘油溶液/L發(fā)酵培養(yǎng)基/h ；所述階段三中，所述溶氧為30%以上是通過向發(fā)酵體系中通入空氣并調(diào)節(jié)通入空氣的速率、攪拌發(fā)酵體系并調(diào)節(jié)攪拌發(fā)酵體系的速率、和調(diào)節(jié)山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的流加速率實(shí)現(xiàn)的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min-1. 5L/L發(fā)酵培養(yǎng)基/min ；所述流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇的速率為2ml/L發(fā)酵培養(yǎng)基/h-6ml/L發(fā)酵培養(yǎng)基/h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備β-甘露聚糖酶的方法及專用菌株。該菌株為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS4SMAN CGMCC NO.4095。本發(fā)明公開的重組菌含有多個(gè)拷貝的、由甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的甘露聚糖酶基因。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的用該重組菌進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)堿性甘露聚糖酶的工藝，可使最終堿性甘露聚糖酶在84h的誘導(dǎo)周期內(nèi)，酶活達(dá)到6336u/ml。本發(fā)明方法成本低、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高。因此，本發(fā)明方法在甘露聚糖酶的制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102433267SQ20101029713
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者朱泰承, 李寅, 游麗金, 薛燕芬, 馬延和 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所