專利名稱：一種白色念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的多糖制備領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及制備白色念珠菌細(xì)胞壁的甘露聚糖。
背景技術(shù)：
白色念珠菌是一種條件致病真菌，人體在正常情況下不會受到白色念珠菌的感染，只有機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)時，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。甘露聚糖是白色念珠菌細(xì)胞壁的主要抗原成分。對于白色念珠菌感染的診斷，除了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，測定血清中白色念珠菌甘露聚糖抗 原，逐漸成為白色念珠菌早期診斷的簡單、快捷的方法。而測定抗原作為白色念珠菌感染診斷方法的關(guān)鍵，便是得到制備單克隆抗體的免疫原甘露聚糖。國內(nèi)對于白色念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖制備的研究，主要是林飛卿等人所采用的熱酚法和熱甲酰胺法(林飛卿等，中國免疫學(xué)雜志，1987年，第3卷，第5期，288-292頁)。熱酚法簡述如下1)除蛋白向白念菌菌粉中加入含45%苯酚的1/15M pH7. 2的磷酸鹽緩沖液，勻漿透析過夜除去苯酚，離心得到沉淀物，沉淀用無水乙醇洗盡苯酚，加少量水，100°C水浴抽提I小時；離心得到沉淀物，加10倍體積的3% NaOH，在飽和氮氣流下，10(TC水浴抽提6小時；再進(jìn)行離心，分離上清液，用HCl中和，對蒸餾水透析去鹽，減壓濃縮至少量體積；2)沉淀多糖于上述上清液中加無水乙醇至最終濃度為80%，-200C過夜，以沉淀多糖；離心得沉淀物，用丙酮干燥，即得到粗制甘露聚糖；3)多糖純化使用DEAE-Sephadex A-50 (DEAE葡聚糖凝膠A-50)純化，先用常規(guī)法處理DEAE葡聚糖凝膠A-50，再用O. IN醋酸使之轉(zhuǎn)化為酸型，裝柱(I. 8 X 30cm);將粗制甘露聚糖抗原溶于少量去離子重蒸水中，對同一液體透析后上柱；用去離子重蒸水洗脫，收集洗脫液。用核酸檢測蛋白儀監(jiān)測，并做Molish測糖反應(yīng)，合并陽性各管，減壓濃縮至少量體積，對去離子重蒸水透析，分裝，冷凍干燥得純化甘露聚糖。該方法能得到純度較高的甘露聚糖，但是制備過程較復(fù)雜，需要兩次100°C水浴抽提，同時凝膠層析法進(jìn)行費時費力，每次分離量少，并且在相對分子質(zhì)量估計不清楚時，凝膠的選擇有一定困難。熱甲酰胺法簡述如下1)除蛋白丙酮干燥白念菌粉于圓底燒瓶中，加入甲酰胺(20mL/lg菌粉)，油浴150°C加熱30min，使菌體破裂，冷卻至室溫，20°C下2000g離心30min，棄沉淀；2)沉淀多糖上清液加入2. 5倍體積酸酒精(2N HCl I份，無水乙醇19份)，室溫攪拌30min,20°C下6000g離心30min,棄上清液,得白色沉淀多糖；沉淀用蒸懼水抽提可溶性物質(zhì)，然后在50%的乙醇(cold ethanol)中沉淀,4°C下6000g離心30min,棄上清液；沉淀物溶于蒸餾水，加冷乙醇(最終體積濃度為70% )和IM醋酸鈉(5mL沉淀水溶液加O. 2mL醋酸鈉)，4°C下6000g離心30min，棄上清液；沉淀用無水乙醇洗滌，減壓條件下用丙酮干燥，得粗制Mannan抗原；3)多糖純化粗制抗原溶于蒸懼水,過Sephadex G_75柱(I. 5x26-cm),蒸懼水洗脫,流速lmL/6min ;收集各管,用Molish試劑作糖定性檢測，并用核酸蛋白儀檢測蛋白(280nm)，合并高峰曲線重疊管，凍干得到純化甘露聚糖。該方法過程相對簡單，但是得到的多糖純度不高，含較多的雜蛋白，并且該方法同樣存在凝膠層析的缺點。國外已經(jīng)公開的白色念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖制備方法，主要參考Peat等人的菲林試劑沉淀的方法(1961，J. Chem. Soc. I :29-34)。具體方法為菌粉在19mM的檸檬酸鹽緩沖液中，高壓滅菌鍋中140°C滅菌2小時，離心，膠狀體加入水后，再次相同條件高壓滅菌；混合液減壓濃縮，加入醋酸，混合液離心，分離棕色膠狀物，用醋酸溶液洗滌，收集洗液，上清液為含甘露聚糖溶液，用氫氧化鈉中和；加入乙醇，沉淀用60%乙醇水溶液洗滌兩次，溶解于水中，離心，除去棕色膠狀物，渾濁上清液加入氫氧化鈉調(diào)至堿性，使用菲林試劑沉淀，然后沉淀用乙醇洗滌，最終得到甘露聚糖沉淀。該法雖然不存在凝膠層析的缺點，但是菲林試劑沉淀多糖，產(chǎn)率、純度都較低。要想提高多糖產(chǎn)量和純度，需要反復(fù)使用菲林試劑沉淀，過程繁瑣，其工藝并不適合工業(yè)生產(chǎn)。上世紀(jì)50年代，Scott首先發(fā)現(xiàn)十六烷基三甲基溴化銨(Cetavlon)對酸性多糖 有較強(qiáng)的沉淀作用，能與多糖形成季胺絡(luò)合物而沉淀多糖。目前，十六烷基三甲基溴化銨已經(jīng)廣泛用于各種細(xì)菌莢膜多糖的純化制備。本發(fā)明中，首次使用十六烷基三甲基溴化銨來制備白色念珠菌細(xì)胞壁多糖抗原甘露聚糖的方法。我們發(fā)現(xiàn)，該方法不僅工藝操作流程簡單，并且能夠制備純度較高的白色念珠菌甘露聚糖。本發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明的目的在于提供一種利用十六烷基三甲基溴化銨來制備白色念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖的方法。本發(fā)明所采用的白色念珠菌購買自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。本發(fā)明技術(shù)方案如下步驟I)白色念珠菌培養(yǎng)采用通用的白色念珠菌培養(yǎng)條件，具體地說培養(yǎng)基采用YM肉湯培養(yǎng)基，成分為每升培養(yǎng)基含3g酵母提取物,5g蛋白胨,3g麥芽糖提取物，IOg D-葡萄糖。培養(yǎng)溫度為30°C，震蕩速度為200rpm，培養(yǎng)時間大約28h。2)上述培養(yǎng)液進(jìn)行離心，沉淀即白色念珠菌細(xì)胞用0.9wt%氯化鈉洗滌兩次，56°C加熱2h殺死細(xì)胞，用丙酮干燥得到白色念珠菌菌粉。3)所得白色念珠菌菌粉在pH = 7. 0，濃度為O. 02M的檸檬酸鹽緩沖液中高壓滅菌90min,離心，保留上清液，沉淀膠狀物相同條件下滅菌，離心，合并上清液。4)上述上清液加入到甲醇中，出現(xiàn)沉淀；離心分離得到沉淀，沉淀溶于去離子水，用去離子水透析，凍干，得到粗制甘露聚糖。5)粗制甘露聚糖溶于去離子水中，加入十六烷基三甲基溴化銨的水溶液，混合液靜止一段時間出現(xiàn)沉淀。6)離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌，合并洗滌液和5)步上清液，合并液加入Iwt %的硼酸溶液。7)上述混合液邊攪拌邊加入2M氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至8. 8，生成十六烷基三甲基溴化銨-甘露聚糖絡(luò)合物沉淀，收集沉淀，用PH = 8. 8的O. 5%醋酸鈉洗滌，然后用2%乙酸溶解，所得溶液在乙醇中沉淀。
8)離心，棄上清液，沉淀用2%的醋酸乙醇溶液洗滌，溶于水后用2M氫氧化鈉中和，蒸餾水中透析，凍干，得到白色念珠菌甘露聚糖產(chǎn)物。本發(fā)明中，白色念珠菌細(xì)胞經(jīng)過檸檬酸鹽處理后，上清液在甲醇中沉淀即可得到甘露聚糖粗品，之后加入十六烷基三甲基溴化銨，其目的如下1)中性條件下，出去蛋白質(zhì)和核酸；2)堿性條件下，和甘露聚糖結(jié)合形成絡(luò)合物沉淀，純化多糖。因此，本發(fā)明中，使用十六烷基三甲基溴化銨來制備甘露聚糖，省略了凝膠層析的過程，不但使得制備工藝簡單化，同時能制備出高純度的甘露聚糖。實施例1，用本發(fā)明的制備方法提取白色念珠菌細(xì)胞壁抗原甘露聚糖，其步驟如下配制YM肉湯培養(yǎng)基2. 4L，其成分為7. 2g酵母提取物，12g蛋白胨，7. 2g麥芽糖提 取物，24g D-葡萄糖。培養(yǎng)溫度為30°C，震蕩速度為200rpm，培養(yǎng)時間為28h。離心收集菌體細(xì)胞，離心條件為6000rpm離心15min，使用O. 9wt%氯化鈉洗滌細(xì)胞，56°C加熱2h殺死細(xì)胞，用丙酮干燥得到白色念珠菌菌粉。白色念珠菌菌粉在PH = 7. 0，濃度為O. 02M的檸檬酸鹽緩沖液中高壓滅菌90min，離心，保留上清液，沉淀膠狀物相同條件下滅菌，離心，合并上清液。將上清液加入到3倍體積的甲醇當(dāng)中，出現(xiàn)沉淀，IOOOOrpm離心IOmin,分離得到沉淀，沉淀溶于去離子水，用去離子水透析，凍干，得到粗制甘露聚糖。實施例2，用本發(fā)明的制備方法，利用十六烷基三甲基溴化銨對粗制甘露聚糖進(jìn)行純化，具體步驟如下I)粗制甘露聚糖溶液中，加入濃度為O. 04g/ml的十六烷基三甲基溴化銨水溶液20ml，混合液靜止4小時出現(xiàn)沉淀，IOOOOrpm離心lOmin，沉淀用去離子水洗滌，合并洗滌液和上清液，共得合并液60ml，合并液加入Iwt %的硼酸溶液30ml ；2)上述混合液邊攪拌邊加入2M氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至8. 8，生成十六烷基三甲基溴化銨-甘露聚糖絡(luò)合物沉淀，IOOOOrpm離心lOmin，收集沉淀；3)用pH = 8. 8的O. 5%醋酸鈉洗滌沉淀兩次，每次30ml，然后用10ml2%乙酸溶解，所得溶液在3倍體積的乙醇中沉淀；4) IOOOOrpm離心lOmin，收集沉淀，沉淀用IOml去離子水溶解，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，蒸餾水中透析，凍干，得到白色念珠菌甘露聚糖產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種白色念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖的制備方法，包括以下步驟 (a)白色念珠菌細(xì)胞經(jīng)過檸檬酸鹽的處理后，上清液加入到甲醇中，靜置產(chǎn)生沉淀，離心分離沉淀即為粗制甘露聚糖； (b)將(a)步驟得到粗制甘露聚糖溶于去離子水，加入十六烷基三甲基溴化銨，產(chǎn)生沉淀，離心，上清液加入硼酸溶液； (C)步驟(b)所得混液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至堿性，生成十六烷基三甲基溴化銨-甘露聚糖絡(luò)合物沉淀，收集沉淀； (d)用乙酸鈉洗滌步驟(c)所得沉淀，沉淀在乙酸中溶解后，所得溶液中加入乙醇，從而形成甘露聚糖沉淀； (e)步驟(d)所得沉淀用乙酸乙醇溶液洗滌后，溶于水，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至中性，蒸餾水中透析，凍干，即為純化甘露聚糖。
2.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，上清液在甲醇中產(chǎn)生沉淀，生成沉淀的靜置時間為3_5h,對沉淀進(jìn)行分離的方法為離心,離心條件為IOOOOrpm, 10_15min, 20_25°C。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，加入的十六烷基三甲基溴化銨應(yīng)過量，質(zhì)量為甘露聚糖粗品的2-4倍。
4.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟(b)中，所用硼酸溶液的濃度為lwt%。
5.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟(c)中，所用氫氧化鈉溶液濃度是2mol/L，溶液pH值最終調(diào)節(jié)至8.8。
6.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟(d)所使用乙酸鈉溶液濃度為O.5wt%,pH = 8. 8 ο
7.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所使用乙酸溶液中乙酸的體積分?jǐn)?shù)為2%。
8.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所使用乙酸乙醇溶液中，乙酸的體積分?jǐn)?shù)為2%。
9.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟(b)和(e)中，沉淀溶于水后都使用O.45um濾膜進(jìn)行了過濾。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的多糖制備領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及制備白色念珠菌細(xì)胞壁的甘露聚糖。本發(fā)明提供了一種利用十六烷基三甲基溴化銨來制備白色念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖的方法。白色念珠菌細(xì)胞經(jīng)過在檸檬酸鹽溶液中高溫高壓處理后，上清液在甲醇中沉淀得甘露聚糖粗品，接下來使用十六烷基三甲基溴化銨先沉淀雜蛋白及核酸，然后與甘露聚糖絡(luò)合形成沉淀，絡(luò)合物沉淀用乙酸溶解后，用乙醇沉淀多糖，得到純化甘露聚糖。本發(fā)明中制備白色念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖的方法，不需要凝膠層析過程，制備工藝簡單，利于甘露聚糖的工藝化生產(chǎn)。
文檔編號C12P19/04GK102952200SQ20111024094
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者王東東, 何永勝, 周澤奇, 李寧, 粟艷, 史東東, 劉春龍 申請人:天津貽諾琦生物工程有限公司