一種優(yōu)化的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明突變了來源于黑曲霉的甘露聚糖酶MAN5gy，獲得的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，且本發(fā)明提供了編碼上述阿拉甘露聚糖酶的編碼基因man5gy。本發(fā)明突變后的甘露聚糖酶的具有以下性質(zhì)：最適pH4.0，最適溫度65℃。所述甘露聚糖酶適用于飼料工業(yè)，可與木聚糖酶協(xié)同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用。在石油及天然氣開采業(yè)中，甘露聚糖酶能夠很好的降解半乳甘露聚糖，繼而增強(qiáng)石油或天然氣流動(dòng)的流速。由于在石油開采過程中的溫度較高(>80℃)，所以高溫的甘露聚糖酶能夠很好的發(fā)揮作用。
【專利說明】—種優(yōu)化的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程與酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甘露聚糖和木聚糖是半纖維素中最重要的兩種多糖，在軟木和一些特殊組織如果實(shí)和種子中甘露聚糖占據(jù)主導(dǎo)地位。甘露聚糖是以β-1，4-甘露糖甘鍵鍵聚合而成的線狀多糖。依據(jù)主鏈組成的不同可以分為兩大類:線狀甘露聚糖和葡甘露聚糖。甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一類催化水解β -1, 4-甘露聚糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，作用底物比較廣泛，屬于半纖維素酶類。
[0003]甘露聚糖酶的來源比較廣泛，植物中的甘露聚糖酶存在于種子和果實(shí)等儲(chǔ)藏器官中；在一些低等動(dòng)物如海洋軟體動(dòng)物:濱螺、亮大蝸牛和淡菜等動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)含有甘露聚糖酶；微生物來源的甘露聚糖酶最多，其中細(xì)菌、真菌、放線菌等都是其主要的來源，到目前為止，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物已經(jīng)近百余種，它們中絕大多數(shù)微生物生活在水環(huán)境或土壤里，也有一些微生物分布在反芻動(dòng)物的瘤胃里。微生物來源的甘露聚糖酶具有高活性、方便提取，且隨著微生物工程和基因工程的發(fā)展，甘露聚糖酶在食品、飼料、藥品、造紙及石油和天然氣開采等行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。
[0004]在飼料行業(yè)中，甘露聚糖酶的添加主要作用是降低食糜粘度，提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率等。主要因?yàn)棣耞甘露聚糖在豆柏等常用的植物蛋白原料中的含量比其它的常用飼料都高，作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子β_甘露聚糖在動(dòng)物的消化道內(nèi)形成凝膠狀，使消化道內(nèi)容物具有較強(qiáng)的黏性，從而影響動(dòng)物的營養(yǎng)吸收。甘露聚糖酶在飼料行業(yè)應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵問題需要有較好耐高溫特性`，飼料制粒時(shí)需要在高溫環(huán)境下進(jìn)行，不耐高溫的甘露聚糖酶酶的活性將受到較大損失。目前許多研究者從不同的方面對(duì)甘露聚糖酶的耐熱性進(jìn)行了研究，如通過篩選產(chǎn)耐熱植酸酶的菌株、運(yùn)用蛋白質(zhì)工程等現(xiàn)代分子生物學(xué)方法等方法來獲得耐高溫甘露聚糖酶，效果不是很理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種通過定點(diǎn)突變得到的優(yōu)化的耐高溫甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，本發(fā)明通過定點(diǎn)突變甘露聚糖酶氨基酸序列來提高其熱穩(wěn)定性，本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述突變的耐高溫甘露聚糖酶的基因和優(yōu)化后的編碼基因。
[0006]本發(fā)明還提供了包含上述突變得到耐高溫甘露聚糖酶姻ASkF的重組載體，優(yōu)選為pPICZaA-MAN5gy。將突變得到的耐高溫甘露聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的甘露聚糖酶基因插入到質(zhì)粒pPICZa A上的I和I限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-MAN5gy。
[0007]本發(fā)明還提供了包含上述耐高溫甘露聚糖酶姻ASkF的重組菌株，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌，優(yōu)選為重組菌株pPICZa A /man5gy。[0008]本發(fā)明還提供了一種制備耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy的方法，包括以下步驟:
1)用含有甘露聚糖酶MAN5gy的編碼基因的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌
株;
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組甘露聚糖酶表達(dá)；
3)回收并純化所表達(dá)的甘露聚糖酶MAN5gy。
[0009]本發(fā)明的另一目的提供上述耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0010]所述飼料為玉米-豆柏型日糧、小麥-豆柏型日糧、雜糧雜柏型日糧。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是:本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，通過定點(diǎn)突變提供一種具有耐高溫特性的、適合于在飼料、石油及天然氣開采工業(yè)中應(yīng)用新的甘露聚糖酶。
[0012]本發(fā)明通過定點(diǎn)突變黑曲霉甘露聚糖酶氨基酸序列，來提高甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性，并在不改變氨基酸情況下按照畢赤酵母密碼子偏好性改造其基因，以獲得甘露聚糖酶突變體的高效表達(dá)。本發(fā)明得到了突變后的黑曲霉來源的甘露聚糖酶MAN5gy，具有以下性質(zhì):最適溫度65°C，50°C _75°C之間仍具有80%以上的酶活性，具有較高的酶活，具有良好的熱穩(wěn)定性，90°C處理10 min還可保持40%以上最大酶活力；最適pH4.0，并在pH3.0~
5.5范圍內(nèi)具有70%以上的酶活力，具有很好的寬泛的pH穩(wěn)定性，37°C下作用I h后，在pH
2.0~6.5之間,最大酶活力幾乎不變。
[0013]本發(fā)明所述甘露聚糖酶耐高溫特性較好，可使其在需求高溫環(huán)境的工業(yè)如飼料制粒上應(yīng)用。所述甘露聚糖酶適用于飼料工業(yè)，可與木聚糖酶協(xié)同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用。在石油及天然氣開采業(yè)中，甘露聚糖酶能夠很好的降解半乳甘露聚糖，繼而增強(qiáng)石油或天然氣流動(dòng)的流速。由于在石油開采過程中的溫度較高(>80°c )，所以高溫的甘露聚糖酶能夠很好的發(fā)揮作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明重組甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)圖。
[0015]圖2是本發(fā)明重組甘露聚糖酶的蛋白電泳圖。
[0016]圖3是本發(fā)明重組甘露聚糖酶的最適溫度。
[0017]圖4是本發(fā)明重組甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
[0018]圖5是本發(fā)明重組甘露聚糖酶的最適pH。
[0019]圖6是本發(fā)明重組甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明
以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。[0021]實(shí)施例1、黑曲霉甘露聚糖酶蛋白質(zhì)突變體基因的獲得
1、選擇黑曲霉niger中的甘露聚糖酶氨基酸序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0022]SEQ ID N0.1:
【權(quán)利要求】
1.一種優(yōu)化的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy，其特征在于，所述甘露聚糖酶在PH3.0~5.5有較高的酶活性，在50°C _75°C之間具有較高的酶活。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy，其特征在于，所述甘露聚糖酶的最適溫度65°C,最適pH為4.0。
4.權(quán)利要求1所述的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy的編碼基因man5gy,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.權(quán)利要求1所述的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy的優(yōu)化的編碼基因man5gy,其特征在于，其堿基序列如SEQ ID N0.5所示。
6.包含權(quán)利要求4或5所述編碼基因man5gy的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有編碼基因man5gy的重組載體，其特征在于，所述重組載體為 pPICZ a A- man5gy。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用含有甘露聚糖酶MAN5gy的編碼基因man5gy的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株; 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重`組甘露聚糖酶的表達(dá)； 3)回收并純化所表達(dá)的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy。
9.權(quán)利要求1所述的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的耐高溫甘露聚糖酶MAN5gy在制備飼料添加劑中的應(yīng)用，其特征在于所述飼料為玉米-豆柏型日糧、小麥-豆柏型日糧、雜糧雜柏型日糧。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103525790SQ201310473865
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】張大偉, 杜彥龍 申請(qǐng)人:青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司