專利名稱：糖蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)糖蛋白的方法，所述糖蛋白具有包含甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈，其中所述糖鏈可以作為所述糖蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)哺乳動物如人類細(xì)胞的溶酶體的標(biāo)記性標(biāo)記。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明，當(dāng)天然蛋白被除去糖鏈時，它們不能顯示固有的生物學(xué)活性(A.Kibata，Tanpakushitsu Kakusan Koso 36，775-788(1991))。這提示糖鏈在發(fā)揮生物學(xué)活性中起重要作用。然而，由于糖鏈結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性之間的相關(guān)關(guān)系并不總是明顯的，因此需要發(fā)展允許靈活地修飾和控制附著于蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)(糖的類型、連接位置、鏈長度等)的技術(shù)。
糖蛋白的糖鏈主要分為Ash連接型、粘蛋白型、O-GlcNAc型、GPI錨定型和蛋白聚糖型(M.Takeuchi，Glycobiology Series 5，Glycotechnology；由A.Kibata，S.Hakomori，K.Nagai編輯，KodanshaScientific，191-208(1994))，每種類型都有獨特的生物合成途徑，執(zhí)行不同的生理學(xué)功能。Asn連接型糖鏈的生物合成途徑已經(jīng)得到廣泛研究和詳細(xì)分析。
Asn連接型糖鏈的生物合成開始于合成在脂載體中間體上由N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖組成的前體，以及所述前體轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中糖蛋白的特定序列(Asn-X-Ser或Thr)。然后所述前體受到加工(切割葡萄糖殘基和特定甘露糖殘基)，合成由8個甘露糖殘基和2個N-乙酰葡萄糖胺殘基組成的M8高甘露糖型糖鏈(Man8GlcNAc2)。包含所述高甘露糖型糖鏈的蛋白被轉(zhuǎn)運到高爾基體，在高爾基體中接受各種修飾，高爾基體中進(jìn)行的這些修飾在酵母和哺乳動物之間有顯著不同(Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem.，56，915-944(1987))。
在哺乳動物細(xì)胞中，根據(jù)接受糖鏈修飾的蛋白類型，采用三種不同途徑中的一種。所述三種途徑是1)核心糖鏈不受到改變，2)在核心糖鏈的Man的位置6添加UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸酯部分(GlcNAc-1-P)，產(chǎn)生Man-6-P-1-GlcNAc，然后僅去除GlcNAc部分，以轉(zhuǎn)化為具有酸性糖鏈的糖蛋白，以及3)從核心糖鏈順序去除五個Man分子，留下Man3GlcNAc2，在其上幾乎順序同時加入GlcNAc、半乳糖(Gal)和N-乙酰神經(jīng)氨酸(也稱為唾液酸(NeuNAc))，產(chǎn)生多種不同雜種與復(fù)合糖鏈的混合物[R.Kornfeld和S.Kornfeld，Ann.Rev.Biochem.，第54卷，第631-664頁(1985)](

圖1)。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動物糖鏈具有與糖蛋白功能密切相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)。
另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酵母產(chǎn)生甘露聚糖型糖鏈，或“外部鏈”，在上述核心糖鏈(Man8GlcNAc2)上有幾個到上百個甘露糖殘基，同時也產(chǎn)生在所述核心糖鏈部分和外部糖鏈部分上添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈(見圖2)。該修飾與動物細(xì)胞的修飾不同，已經(jīng)報道，在酵母中，所述修飾不作為將糖蛋白定位到液泡(對應(yīng)與動物細(xì)胞中溶酶體的細(xì)胞器)的分揀信號。因此，酵母中磷酸化糖鏈的生理功能仍是個謎[Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem.，第56卷，第915-944頁(1987)]。
如圖2所示，酵母中包含甘露糖磷酸酯的糖鏈的磷酸化位點有時添加到在ER中合成的Man8GlcNAc2核心糖鏈的α-1，3分支側(cè)和α-1，6分支側(cè)，有時添加到高爾基體中合成的甘露糖外部鏈上大量存在的α-1，2分支，或者添加到甘露糖外部鏈的非還原端[Herscovics和P.Orlean，F(xiàn)ASEB J.，第7卷，第540-550頁(1993)]。
人們相信，酵母屬(Saccharomyces)酵母中外部鏈的生物合成沿著圖2所示的途徑發(fā)生[Ballou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷，第3368頁(1990)]。
具體地說，發(fā)生延長起始反應(yīng)，其中甘露糖以α-1，6鍵添加到M8高甘露糖型糖鏈上(圖2，反應(yīng)I、B)。已經(jīng)顯示，進(jìn)行該反應(yīng)的酶是由OCH1基因編碼的蛋白(Nakayama等，EMBO J.，11，2511-2519(1992))。此外，通過α-1，6鍵連續(xù)延伸甘露糖的反應(yīng)(圖2II)形成外部鏈的骨架，即聚α-1，6連接甘露糖(圖2E)。所述α-1，6連接甘露糖具有α-1，2連接甘露糖分支(圖2C、F、H)，并且α-1，3連接甘露糖常常添加到所述分支的α-1，2連接甘露糖的末端(圖2D、G、H、I)。MNN1基因產(chǎn)物進(jìn)行這些α-1，3連接甘露糖的添加(Nakanishi-Shindo等，J.Biol.Chem.，268，26338-26345(1993))。已經(jīng)證明，產(chǎn)生一些酸性糖鏈，所述酸性糖鏈在高甘露糖型糖鏈部分添加甘露糖-1-磷酸酯(圖2*)，以及在外部鏈部分添加甘露糖-1-磷酸酯。已經(jīng)顯示，該反應(yīng)依賴于由MNN6基因編碼的蛋白(Wang等，J.Biol.Che m.，272，18117-18124(1997))，另外已經(jīng)鑒定一個基因(MNN4)，該基因編碼積極控制該轉(zhuǎn)移反應(yīng)的一種蛋白(Odani等，Glycobiology，6，805-810(1996)；Odani等，F(xiàn)EBS Letters，420，186-190(1997))。
在大多數(shù)情況下，外部鏈導(dǎo)致異源蛋白產(chǎn)物，使蛋白純化變得復(fù)雜并降低比活(Bekkers等，Biochim.Biophys.Acta，1089，345-351(1991))。此外，由于糖鏈結(jié)構(gòu)上的巨大差異，酵母中產(chǎn)生的糖蛋白并不表現(xiàn)與哺乳動物產(chǎn)生的糖蛋白相同的生物學(xué)活性，并在哺乳動物具有很強(qiáng)的免疫原性。例如，已知在釀酒酵母(S.cerevisiae)中MNN1基因產(chǎn)生的α-1，3甘露糖苷鍵具有強(qiáng)免疫原性(Ballou，C.E.，MethodsEnzymol.，185，440-470(1990))。已經(jīng)報道，酵母本身具有甘露糖-6-磷酸酯-α-1-甘露糖(Man-6-P-1-Man)形式的甘露糖-6-磷酸酯(Man-6-P)，該形式并不結(jié)合Man-6-P受體(Kukuruzinska等，Annu.Rev.Biochem.，56，915-944(1987)；Faust和Kornfeld，J.Biol.Chem.，264，479-488(1989)；Tong等，J.Biol.Chem.，264，7962-7969(1989))。因此，人們認(rèn)為酵母作為生產(chǎn)有用哺乳動物糖蛋白的宿主是不合適的。學(xué)術(shù)界和工業(yè)界都希望開發(fā)出能夠產(chǎn)生具有與哺乳動物相當(dāng)生物活性的糖鏈(即哺乳動物型糖鏈)的糖蛋白的酵母。本發(fā)明的發(fā)明人以前已經(jīng)成功地創(chuàng)造缺乏外部鏈的突變體和具有哺乳動物型糖鏈的酵母(日本專利申請第11-233215號)。
如上文所述，酵母通過MNN4基因和MNN6基因的作用，產(chǎn)生在核心糖鏈部分和外部鏈部分添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈。已經(jīng)證明，由所述產(chǎn)生核心糖鏈并且編碼外部鏈合成酶的基因為缺陷型的突變體生產(chǎn)的糖蛋白的糖鏈包括中性糖鏈(圖3結(jié)構(gòu)式I)和酸性糖鏈(圖3結(jié)構(gòu)式II到IV)(Proceedings of the 12th BiotechnologySymposium，p.153-157，10/14/2004，Biotechnology DevelopmentalTechnology Research Society)。
所述酸性糖鏈具有在哺乳動物糖鏈中未曾發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。具體地說，在哺乳動物細(xì)胞中不是添加甘露糖-1-磷酸酯，而是添加N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸酯，然后僅去除N-乙酰葡萄糖胺部分，產(chǎn)生圖1中標(biāo)記為“*”的最終酸性糖鏈。正如將在下文進(jìn)一步解釋并在Methodsin Enzymology，[第185卷，第440-470頁(1990)]中教導(dǎo)的，該糖鏈在哺乳動物細(xì)胞中作為溶酶體轉(zhuǎn)運信號起作用。
溶酶體是包含各種酸性水解酶的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，所述水解酶分解從細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外吸收入溶酶體的物質(zhì)。定位于人溶酶體內(nèi)的這類酶中的大多數(shù)酶一旦被生物合成并轉(zhuǎn)運到高爾基體，就在高甘露糖型糖鏈的非還原端甘露糖殘基的位置6添加磷酸酯基團(tuán)，由此轉(zhuǎn)化為攜帶酸性糖鏈的糖蛋白，并且所述磷酸酯基團(tuán)用作溶酶體酶特異性識別標(biāo)記。它們通過結(jié)合高親和力甘露糖-6-磷酸酯受體(MPR)而與其它蛋白區(qū)分開來，然后被攜帶進(jìn)入前溶酶體，在前溶酶體的酸性環(huán)境下，它們從MPR解離，然后轉(zhuǎn)運到溶酶體(von Figura和Hasilik，Annu.Rev.Biochem.，54，167-193(1984))。與甘露糖-6-磷酸酯受體(MPR)的結(jié)合需要每個糖鏈包含一個或多個甘露糖-6-磷酸酯分子。該溶酶體酶特異性磷酸酯基團(tuán)添加由兩個不同的酶反應(yīng)完成。W.Canfield等已經(jīng)成功克隆編碼參與甘露糖-6-磷酸酯合成的兩個酶的基因(GlcNAc-磷酸-磷酸轉(zhuǎn)移酶，GlcNAc-磷酸二酯-GlcNAc酶)(Abstractof the XV International Symposium on Glycoconjugates.GlycoconjugateJournal第16卷No.4/5 S41(1999))。
這些溶酶體酶中的遺傳缺陷、涉及添加磷酸酯反應(yīng)的酶的遺傳缺陷或促進(jìn)所述溶酶體酶激活或穩(wěn)定的因子的遺傳缺陷導(dǎo)致一組特征在于酶反應(yīng)受到阻斷和細(xì)胞內(nèi)底物積累的疾病，所述疾病統(tǒng)稱為“溶酶體病”(Leroy和DeMars，Science，157，804-806(1967))。已知人類有超過30種不同類型的溶酶體病，它們共同構(gòu)成兒科和內(nèi)科中的一組重要疾病。發(fā)展針對所述疾病的基本治療的策略包括骨髓移植和基因療法。也已經(jīng)嘗試過使用溶酶體酶的酶補(bǔ)充療法，但靶器官吸收差成為主要障礙，目前僅觀察到酶補(bǔ)充對戈謝病有令人滿意的效果。
戈謝病源于編碼葡糖腦苷脂酶(一種降解葡糖苷脂酰鞘氨醇的溶酶體酶)的基因內(nèi)突變，該突變導(dǎo)致其底物葡糖苷脂酰鞘氨醇主要在骨髓巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞中積累，表現(xiàn)為顯著的肝脾腫大和包括貧血和出血在內(nèi)的造血功能障礙。如上文所述，對該疾病的治療方法包括酶補(bǔ)充療法，所述療法產(chǎn)生有利的治療結(jié)果，但所述療法必須終生持續(xù)，并且所述酶制劑異常昂貴。如下產(chǎn)生葡糖腦苷脂酶制劑修飾CHO細(xì)胞表達(dá)的人重組葡糖腦苷脂酶的糖鏈末端，形成使甘露糖暴露的形式。由于這種疾病中的發(fā)病細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞，因此葡糖腦苷脂酶可能在通過巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體被吸收入細(xì)胞后被轉(zhuǎn)運到溶酶體。已知葡糖腦苷脂酶被轉(zhuǎn)運進(jìn)溶酶體，而不論其糖鏈上是否有甘露糖-6-磷酸酯。因此，推測該酶通過不依賴于甘露糖-6-磷酸酯受體(MPR)的轉(zhuǎn)運機(jī)制被轉(zhuǎn)運到溶酶體。
然而，大多數(shù)其它溶酶體病中的缺陷酶通過甘露糖-6-磷酸受體介導(dǎo)的系統(tǒng)轉(zhuǎn)運到溶酶體，因此用于酶補(bǔ)充療法的溶酶體酶必須具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈，作為與甘露糖-6-磷酸酯受體(MPR)結(jié)合所需的溶酶體遷移信號。因此，在這些溶酶體酶鏈上添加甘露糖-6-磷酸酯是關(guān)鍵策略。
目前，已經(jīng)報道的獲取溶酶體酶的方法包括從胎盤純化的方法、使用培養(yǎng)細(xì)胞例如成纖維細(xì)胞或黑素瘤細(xì)胞的生產(chǎn)方法、使用培養(yǎng)細(xì)胞例如昆蟲細(xì)胞或中國地鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的重組方法、以及從轉(zhuǎn)基因兔奶獲取所述酶的方法。然而，這些方法有下面缺點1)帶有添加磷酸酯的糖鏈的溶酶體酶含量低，因此溶酶體攝入的效率低，和2)低生產(chǎn)率/高培養(yǎng)成本。因此，缺點1)要求高劑量給藥，而缺點2)導(dǎo)致高治療費用。此外，還沒有實現(xiàn)使用酵母細(xì)胞的重組方法生產(chǎn)。因此，希望的目標(biāo)是在糖鏈上具有甘露糖-6-磷酸酯并且溶酶體攝入活性高的酶。
其中一種稱為法布萊病(Fabry disease)的溶酶體病是一種X染色體遺傳疾病，其特征在于α-半乳糖苷酶活性降低以及其體內(nèi)底物神經(jīng)酰胺三己糖苷在體內(nèi)積累。典型法布萊病的患者一般從少年期或青年期開始就遭受極度疼痛、皮膚血管瘤和出汗障礙，并隨著年齡增加出現(xiàn)腎病或心血管病和腦血管病。在最近幾年，鑒定出一種相對溫和的法布萊病“亞型”，該“亞型”的特征是中年期后期或更晚的時候出現(xiàn)心肌病，并且已經(jīng)報道，該疾病的患者可能隱藏在被誤診為心肌病的患者組中。
α-半乳糖苷酶與上文提到的葡糖腦苷脂酶不同，因為它通過甘露糖-6-磷酸酯受體介導(dǎo)的系統(tǒng)轉(zhuǎn)運到溶酶體。因此，它必須具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈，以便被靶細(xì)胞有效吸收。然而，還不存在大量生產(chǎn)適用于治療的高純度具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈的α-半乳糖苷酶的技術(shù)。例如，甘露糖-6-磷酸酯糖鏈的比例據(jù)認(rèn)為占成纖維細(xì)胞衍生的糖蛋白(α-半乳糖苷酶)約20％，該糖蛋白已經(jīng)顯示作為酶補(bǔ)充注射液在10名人類患者的9名中有優(yōu)越性(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，97365-370(2000))。
由于添加到蛋白的糖鏈的結(jié)構(gòu)在酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞中不同，因此通過遺傳工程方法在酵母中生產(chǎn)的有用的人或其它哺乳動物糖蛋白并不顯示與從哺乳動物獲得的糖蛋白的相同活性，或者它們由于不同的糖鏈而可能具有不同的抗原性。由于該原因，在酵母中生產(chǎn)哺乳動物糖蛋白是困難的。此外，具有與在人類細(xì)胞和其它哺乳動物細(xì)胞中添加的相同糖鏈結(jié)構(gòu)的有用的包含磷酸酯的酸性糖鏈雖然作為轉(zhuǎn)運糖蛋白進(jìn)入人類或其它哺乳動物細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)記性標(biāo)志是有利的，但目前無法均一大量地提供所述具有酸性糖鏈的糖蛋白。因此，非常需要發(fā)展所述技術(shù)。
本發(fā)明的發(fā)明人以前已經(jīng)提議一種方法，包括使用糖鏈合成突變體(ΔOCH1 mnn1)生產(chǎn)糖蛋白，允許所述MNN6基因產(chǎn)物在體內(nèi)或體外作用于其上，獲得添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈，然后進(jìn)行酸處理，獲得有效作為溶酶體轉(zhuǎn)運信號的哺乳動物樣糖鏈(未經(jīng)審查的日本專利公開HEI No.9-135689)。然而，由于用于該方法的極端變性條件(0.01N鹽酸，100℃，30分鐘)，實際上所有糖蛋白都被變性。因此，該方法作為獲得具有生理活性的糖蛋白的方法是不令人滿意的。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個目標(biāo)是克服上述在酵母中生產(chǎn)糖蛋白有關(guān)的問題，并由此提供使用酵母的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)具有與在人類或其它哺乳動物細(xì)胞中添加的相同糖鏈結(jié)構(gòu)的有用的包含磷酸酯的酸性糖鏈，以及具有所述糖鏈的糖蛋白。
作為許多致力于解決上述問題的研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用酵母的糖鏈合成突變體獲取具有包含大量磷酸酯的糖鏈的糖蛋白，并允許α-甘露糖苷酶作用于所述糖蛋白，有可能大量生產(chǎn)高純度并且保留生理活性的具有包含甘露糖-6-磷酸酯的無抗原性酸性糖鏈的糖蛋白，其中所述酸性糖鏈可作為轉(zhuǎn)運進(jìn)哺乳動物細(xì)胞(包括人類細(xì)胞)的溶酶體的標(biāo)記性標(biāo)志。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)得到的帶有包含磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白可以用作有效治療人溶酶體酶缺乏等的藥物。由此，完成本發(fā)明。
換句話說，本發(fā)明提供生產(chǎn)具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈的糖蛋白，其特征是在產(chǎn)生受到高度磷酸化的核心糖鏈的酵母糖鏈生物合成突變體中引入和表達(dá)編碼靶糖蛋白的基因，然后用α-甘露糖苷酶處理得到的包含添加了甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白，去除所述甘露糖部分。
本發(fā)明還提供具有包含磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白，包括人類溶酶體酶，所述糖蛋白通過使用依照本發(fā)明的酵母的生產(chǎn)方法生產(chǎn)。
本發(fā)明還提供用于治療溶酶體病的治療組合物，其中使用依照本發(fā)明產(chǎn)生的人溶酶體酶。
更具體地說，本發(fā)明提供(1)到(27)。
(1)一種使用酵母生產(chǎn)活性形式糖蛋白的方法，其中糖蛋白的所述活性形式具有在非還原端攜帶甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈。
(2)上述(1)的方法，其中所述攜帶甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈可以結(jié)合甘露糖-6-磷酸酯受體。
(3)一種使用酵母生產(chǎn)活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非還原端攜帶甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖鏈，其中所述高甘露糖型糖鏈顯示于下面結(jié)構(gòu)式I到VIII

(4)上述(1)到(3)中任一項的方法，其中所述酵母含有酸性糖鏈，并且在所用的酵母菌株中至少α-l，6-甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶基因被打斷。
(5)上述(1)到(3)中任一項的方法，其中所述酵母含有酸性糖鏈，并且在所用的酵母菌株中至少α-1，6-甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶基因和α-1，3-甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶基因被打斷。
(6)上述(4)或(5)的方法，其中所述α-1，6-甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶基因是釀酒酵母的OCH1基因，所述α-1，3-甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶基因是釀酒酵母的MNN1基因。
(7)上述(1)到(6)中任一項的方法，其中所述酵母是包含受到高度磷酸化的糖鏈的突變體。
(8)上述(7)的方法，其中所述酵母是釀酒酵母菌株HPY21。
(9)上述(1)到(8)中任一項的方法，其中所述具有攜帶甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈的活性形式糖蛋白是溶酶體酶。
(10)上述(9)的方法，其中所述溶酶體酶是α-半乳糖苷酶。
(11)上述(10)的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因是來自人類的基因。
(12)上述(11)的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因具有SEQID NO5核苷酸序列表示的核苷酸序列。
(13)上述(10)到(12)中任一項的方法，其中生產(chǎn)所述α-半乳糖苷酶的所述酵母是菌株HPY21G。
(14)上述(1)到(13)中任一項的方法，通過允許α-甘露糖苷酶作用于由權(quán)利要求4到8中任一項定義的酵母所產(chǎn)生的糖蛋白，從糖鏈中的甘露糖-1-磷酸酯鍵去除甘露糖殘基。
(15)上述(14)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有從甘露糖-1-磷酸酯鍵去除甘露糖殘基的活性。
(16)上述(14)或(15)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有非特異性破壞α-1，2-甘露糖苷鍵、α-1，3-甘露糖苷鍵和α-1，6-甘露糖苷鍵的活性。
(17)上述(16)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶活性是外切型活性，并且不具有內(nèi)切型活性。
(18)上述(17)的方法，其中所述α-甘露糖苷酶是來自纖維單胞菌屬(Cellulomonas)細(xì)菌的α-甘露糖苷酶。
(19)上述(18)的方法，其中所述纖維單胞菌屬細(xì)菌是纖維單胞菌SO-5。
(20)一種糖蛋白，所述糖蛋白由酵母產(chǎn)生，具有在非還原末端攜帶甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈。
(21)上述(20)的糖蛋白，所述糖蛋白是溶酶體酶。
(22)上述(20)或(21)的糖蛋白，所述糖蛋白通過上述(1)到(19)中任一項的方法產(chǎn)生。
(23)上述(21)或(22)的方法，所述糖蛋白是α-半乳糖苷酶。
(24)上述(23)的糖蛋白，所述糖蛋白是由人基因編碼的α-半乳糖苷酶。
(25)上述(20)的糖蛋白，所述糖蛋白具有在非還原端包含甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈，其中所述糖鏈顯示于下面結(jié)構(gòu)式I到VIII

(26)一種治療和/或預(yù)防溶酶體病的藥用組合物，所述組合物包含依照上述(20)到(25)中任一項的糖蛋白。
(27)上述(26)的藥用組合物，所述藥用組合物用于治療法布萊病，其中所述糖蛋白是人α-半乳糖苷酶。
本說明書結(jié)合在日本專利申請第2001-180907號中的說明書和/或圖公開的內(nèi)容，本申請要求該申請的優(yōu)先權(quán)。
附圖簡述圖1舉例說明哺乳動物體內(nèi)N-連接糖鏈的一般生物合成途徑(konfeld等)。
圖2舉例說明酵母(釀酒酵母)中N-連接糖鏈的生物合成途徑。
圖3顯示酵母菌株HPY21(Δoch1 Δmnn1)產(chǎn)生的核心糖鏈和酸性糖鏈的結(jié)構(gòu)。
圖4顯示依照本發(fā)明的策略圖。
圖5是引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G的培養(yǎng)物上清液的蛋白質(zhì)印跡分析的照片。
1)僅引入載體的菌株(HPY21)2)引入α-半乳糖苷酶基因的菌株(HPY21G)圖6顯示對用Blue Sepharose從引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G的培養(yǎng)物上清濃縮液中分離的α-半乳糖苷酶糖鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果。
圖7顯示對用Asahi-Pak NH2-P柱從引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G的培養(yǎng)物上清濃縮液中純化的α-半乳糖苷酶糖鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果。
1)從培養(yǎng)物上清液純化的α-半乳糖苷酶的糖鏈(在每個糖鏈中包含一個磷酸酯分子)。
2)來自α-甘露糖苷酶處理過的上述1)的糖鏈。
3)來自堿性磷酸酶處理過的上述2)的糖鏈。
4)來自從α-甘露糖苷酶處理過的培養(yǎng)物上清液純化得到的α-半乳糖苷酶的用α-甘露糖苷酶和堿性磷酸酶處理過的糖鏈部分(在每個糖鏈條上包含兩個磷酸酯分子)的糖鏈。
圖8是對純化的α-半乳糖苷酶進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析的照片，所述純化的α-半乳糖苷酶已經(jīng)進(jìn)一步用纖維單胞菌屬SO-5菌株產(chǎn)生的α-甘露糖苷酶處理。
1)未用α-甘露糖苷酶進(jìn)行處理2)α-甘露糖苷酶進(jìn)行處理圖9顯示對用Asahi-Pak NH2-P柱從α-半乳糖苷酶獲得的糖鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果，所述α-半乳糖苷酶已經(jīng)用纖維單胞菌屬SO-5菌株產(chǎn)生的α-甘露糖苷酶進(jìn)行處理。
圖10顯示依照本發(fā)明獲得的純化的α-半乳糖苷酶的攝入實驗(酶活性分析)的結(jié)果，所述攝入實驗使用來自一名法布萊病患者的培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞。
圖11是一幅照片，顯示通過將依照本發(fā)明獲得的純化α-半乳糖苷酶給予從一名法布萊病患者獲得的培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，對底物積累的效應(yīng)。
符號解釋GlcNAc，GNN-乙酰葡萄糖胺Man，M甘露糖PA2-氨基吡啶化的實施本發(fā)明的最佳模式下面將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
依照本發(fā)明生產(chǎn)具有包含磷酸酯的酸性糖鏈(其中所述糖鏈可用作轉(zhuǎn)運進(jìn)入溶酶體的標(biāo)記性標(biāo)記)的糖蛋白的方法基本上包括下面步驟。
1)一個步驟是將編碼目的糖蛋白的基因引入產(chǎn)生所需磷酸化核心糖鏈的糖鏈合成突變體酵母菌株，以表達(dá)具有添加了甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白。
2)一個步驟是用α-甘露糖苷酶處理所獲得的具有添加了甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白，切除甘露糖部分，由此產(chǎn)生具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈的糖蛋白。
可以用下面方法制備本發(fā)明的在對酵母特異性的外部鏈生物合成基因破壞的突變體酵母菌株。首先，分離破壞靶基因所需的DNA基因片段，釀酒酵母基因組計劃(Goffeau等，Nature，387(增刊)，1-105(1997))已經(jīng)闡明所有靶基因的染色體位置，所述DNA基因片段可以從圍繞所述靶基因的任何基因片段分離得到，所述靶基因可以從公共機(jī)構(gòu)例如ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)(ATCC RecombinantDNA materials，第三版，1993)獲得?；蛘?，通過常規(guī)方法從釀酒酵母提取基因組DNA，然后篩選靶基因，可以獲得這些DNA基因片段?？梢酝ㄟ^例如Cryer等的方法(Methods in Cell Biology，12，39-44(1975))或P.Philippsen等的方法(Methods Enzymol.，194，169-182(1991))從釀酒酵母中提取基因組DNA。
通過PCR擴(kuò)增靶基因，然后將其破壞。PCR方法是使用在目的區(qū)兩端的有義/反義引物組合、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和DNA擴(kuò)增系統(tǒng)，允許在約2-3小時內(nèi)體外擴(kuò)增特定DNA片段幾十萬倍的技術(shù)。當(dāng)使用所述技術(shù)擴(kuò)增靶基因時，使用25-30體的合成單鏈DNA作為引物，使用基因組DNA作為模板。
根據(jù)本發(fā)明，可以基本根據(jù)Rothstein在Methods Enzymol.，101，202-211(1983)中公開的方法完成靶基因的破壞。該方法包括首先切割或部分缺失質(zhì)粒上的靶基因，然后插入合適的選擇性標(biāo)記基因DNA，產(chǎn)生其中所述選擇性標(biāo)記夾在所述靶基因上游部分和下游部分之間的構(gòu)建物，然后將所述構(gòu)建物引入酵母細(xì)胞。通過該程序，重組事件在所引入的片段(夾著所述選擇性標(biāo)記的DNA構(gòu)建物)兩端和染色體上所述靶基因的同源部分之間出現(xiàn)兩次，使得染色體上的所述靶基因被所引入的片段取代。
下面將構(gòu)建一個OCH1基因破壞的菌株作為具體實例來解釋。用限制性內(nèi)切酶從Alani等構(gòu)建的質(zhì)粒切除hisG-URA3-hisG盒，所述質(zhì)粒具有連接URA3基因兩端的沙門氏菌屬hisG基因DNA片段(Alani等，Genetics，116，541-545(1987))，然后將該盒插入質(zhì)粒上的靶基因，構(gòu)建所述破壞基因的等位基因。使用該質(zhì)粒取代染色體上的靶基因，獲得基因被破壞的突變體。插入染色體的URA3基因被兩個hisG基因夾在中間，在hisG序列之間的同源重組時該基因和一個拷貝的hisG可能從染色體上除去。染色體上的所述靶基因仍然保留一個拷貝破壞的hisG片段，但宿主細(xì)胞具有URA-表型?？梢杂?-氟乳清酸(5-FOA)完成所述兩個hisG基因之間的同源重組。一種ura3突變體對5-FOA有抗性(Boeke等，Mol.Gen.Genet.，197，345-346(1984)；Boeke等，Methods Enzymol.，154，165-174(1987))，但Ura3+表型的酵母菌株不能在5-FOA培養(yǎng)基中生長。因此，可以分離在含5-FOA的培養(yǎng)基中表現(xiàn)抗性性狀的菌株，使得能夠通過使用所述URA3標(biāo)記的程序再次操作所述菌株。
然后用同樣程序破壞該OCH1基因破壞的菌株的MNN1基因，獲得所需的雙突變體菌株(Δoch1 Δmnn1)。
酵母Δoch1突變體是添加甘露糖外部鏈到糖蛋白核心糖鏈上所需的起始α-1，6連接甘露糖添加反應(yīng)缺陷的，而Δmnn1突變體是添加α-1，3-連接甘露糖到核心糖鏈非還原端和外部糖鏈分支的反應(yīng)缺陷的。正如本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)提出的(日本專利公開第3091851號)，所述具有兩個突變的雙突變體(Δoch1 Δmnn1)產(chǎn)生中性核心糖鏈Man8GlcNAc2，同時除所述中性糖鏈外產(chǎn)生副產(chǎn)物即包含甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈(Proceedings of the 12th Biotechnology Symposium，第153-157頁，10/14/1994，Biotechnology Developmental TechnologyResearch Society)。
用于本發(fā)明的酵母菌株必須具有攜帶甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈。已知所述糖鏈在酵母中普遍存在。涉及糖鏈合成的釀酒酵母基因包括催化添加甘露糖-1-磷酸酯到甘露糖位置6上的反應(yīng)的基因(MNN6)(該基因在圖2所示的糖鏈結(jié)構(gòu)式中用“*”號指示)，以及控制甘露糖-1-磷酸酯添加的基因(MNN4)。
從對數(shù)生長期到培養(yǎng)晚期(穩(wěn)定期)檢測到大量包含磷酸酯的糖鏈。這與控制添加甘露糖-1-磷酸酯的基因(MNN4)的表達(dá)模式一致。增強(qiáng)MNN4和MNN6基因的表達(dá)可以允許培育包含大量具有甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈的酵母。
釀酒酵母KK4是在MNN4基因啟動子區(qū)具有突變并且組成型表達(dá)MNN4基因的菌株。因此，它包含許多磷酸化糖鏈。因此，它被認(rèn)為適于生產(chǎn)具有甘露糖-6-磷酸酯的糖蛋白。
將所述DNA引入細(xì)胞和用其轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法可以是常規(guī)方法，例如用噬菌體載體等感染大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，以將所述DNA有效摻入所述宿主細(xì)胞。作為使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母的方法，可以使用通過鋰鹽處理產(chǎn)生天然攝入DNA的條件而摻入所述質(zhì)粒的方法，或者使用電將DNA引入所述細(xì)胞的方法(Becker和Guarente，MethodsEnzymol.，194，182-187(1991))。
也可以依照常規(guī)方法進(jìn)行上述程序的DNA分離、純化等，以大腸桿菌為例，可以通過堿/SDS方法和乙醇沉淀提取DNA，隨后通過RNase處理、PEG沉淀等純化DNA?？梢酝ㄟ^常用方法例如雙脫氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463-5467(1977))確定所述基因的DNA序列。可以利用市場購買的測序試劑盒等容易地確定DNA核苷酸序列。
為產(chǎn)生具有上述糖鏈的不同物種的糖蛋白，可以構(gòu)建包含連接到能夠在酵母中表達(dá)的啟動子下游的編碼靶糖蛋白基因的基因(cDNA等)，通過同源重組將所述構(gòu)建物加入作為宿主的上述酵母突變體，或者可以將所述基因引入質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子，然后通過眾所周知的方法培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子，以允許收集由所述酵母在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生的靶糖蛋白。
在這種情況下，編碼靶糖蛋白的基因具有相同的翻譯氨基酸序列就足夠了。因為人類的密碼子使用與酵母不同，所以來自人類的基因通常在酵母中表達(dá)欠佳。因此，假如合成一種基因，將其密碼子使用轉(zhuǎn)變到酵母系統(tǒng)，那么預(yù)期會有更好的表達(dá)。基本上使用的基因必須是編碼與來自人類的酶相同氨基酸序列的基因，因為不同物種的酶將增加有關(guān)抗原性的考慮。
可以應(yīng)用通常用于培養(yǎng)酵母的常規(guī)方法培養(yǎng)所述酵母突變體?？梢允褂煤铣膳囵B(yǎng)基(包括氮源、碳源、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素等)，所述合成培養(yǎng)基包含例如從Difco Laboratories獲得的各種培養(yǎng)成分，并且缺乏可以根據(jù)復(fù)制和保留質(zhì)粒所需的標(biāo)記提供的氨基酸(Sherman，Methods Enzymol.，194，3-57(1991))。將外源基因摻入染色體而不是質(zhì)粒將防止排除所述基因并因此允許在普通富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
可以使用常見的蛋白分離和純化方法從培養(yǎng)產(chǎn)物(培養(yǎng)物溶液或培養(yǎng)的細(xì)胞)中分離和純化糖蛋白。例如，在糖蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)的情況下，完成培養(yǎng)后通過離心分離收集細(xì)胞，懸浮于水性緩沖溶液中，然后用超聲波破碎儀、French壓榨機(jī)(French press)、Manton-Gaulin勻漿器、Dynomill等破碎細(xì)胞，隨后離心所述無細(xì)胞提取物，獲得上清液。在糖蛋白存在于培養(yǎng)物上清液情況下，完成培養(yǎng)后離心分離細(xì)胞，然后通過超濾、鹽析等濃縮。可以通過單獨或組合使用常規(guī)蛋白分離和純化方法進(jìn)行隨后的程序，獲得純化產(chǎn)物，所述常規(guī)蛋白分離和純化方法例如溶劑萃取、用硫酸銨等鹽析、脫鹽、用有機(jī)溶劑沉淀、用二乙基氨乙基(DEAE)Sepharose等的陰離子交換層析、用磺丙基(SP)Sepharose(Pharmacia)等的陽離子交換層析、用Phenyl Sepharose等的疏水層析、用帶有Sephacryl的分子篩等的凝膠過濾、用基團(tuán)特異性載體、植物凝集素配體、金屬鰲合物等的親和層析、層析聚集或電泳方法例如等電電泳。
根據(jù)本發(fā)明成功地進(jìn)行親和層析，分離具有磷酸化糖鏈的α-半乳糖苷酶和沒有磷酸化糖鏈的α-半乳糖苷酶。具體地說，使用BlueSepharose層析分離靶糖蛋白。Blue Sepharose使用的親和配體是Cibacron Blue F3GA，即一類氯三嗪色素，有可能應(yīng)用允許分離磷酸化糖鏈的所述色素作為配體的親和層析，純化攜帶包含甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白。
在離子交換、層析聚集或等電電泳中可以利用糖鏈上依賴于磷酸的電荷差異來純化和濃縮具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈的糖蛋白，更具體地說，純化和濃縮下面從甘露糖-1-磷酸酯中除去甘露糖的酵母特異性糖蛋白。
此外，可以利用被認(rèn)為是識別甘露糖的植物凝集素的伴刀豆凝集素A(ConA)的結(jié)合特異性差異用α-甘露糖苷酶切割攜帶未磷酸化糖鏈的來自酵母的糖蛋白的糖鏈，因此降低或消除所述糖蛋白對ConA的親和力。另一方面，由于在包含磷酸酯的糖鏈的情況下，甘露糖-6-磷酸酯不被識別為底物，因此不發(fā)生對所述糖鏈的進(jìn)一步切割，對ConA的親和力也不降低。可以利用該情況獲得具有高生物學(xué)活性的純?nèi)苊阁w酶樣品，所述高生物學(xué)活性即細(xì)胞攝入活性高，更具體地說是與甘露糖-6-磷酸酯受體的結(jié)合活性高，所述純?nèi)苊阁w酶樣品適于作為高度功能性藥用產(chǎn)物。
依照本發(fā)明用于除去酵母特異性甘露糖的α-甘露糖苷酶沒有具體限制，只要該酶降解甘露糖-1-磷酸酯鍵、具有外切型活性、作用于糖蛋白并且在需要處理的糖蛋白穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)作用。所述α-甘露糖苷酶具有廣泛范圍的底物特異性，作用于α-1，2、α-1，3或α-1，6連接的甘露糖苷鍵，同時也作用于合成底物例如對硝基苯-α-吡喃甘露糖苷或4-甲基傘形基-α-吡喃甘露糖苷。需要使用的可能的α-甘露糖苷酶包括刀豆(Jack Bean)α-甘露糖苷酶和來自酵母液泡的甘露糖苷酶。然而，刀豆α-甘露糖苷酶對糖蛋白糖鏈具有相對低的酶活性，并且需要長時間的反應(yīng)，同時其最佳pH也稍稍接近酸性端(pH4.5)。因此，因為在輕微酸性條件下不穩(wěn)定的蛋白可能被失活，所以該酶被認(rèn)為不適于通過從糖蛋白去除糖鏈而獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白。因此，需要提供具有更強(qiáng)酶活性、容易純化并且可以在糖蛋白穩(wěn)定的中性pH下作用的新型α-甘露糖苷酶。由本發(fā)明的發(fā)明人獲得的纖維單胞菌屬SO-5菌株產(chǎn)生的α-甘露糖苷酶滿足這些條件，可以認(rèn)為是對本發(fā)明有效的酶。上述纖維單胞菌屬SO-5菌株在2001年6月12日作為FERMBP-7628國際保藏于International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，Tsukuba Central6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan。
本發(fā)明所述產(chǎn)生酶的酵母沒有具體限制，只要所述酵母用α-甘露糖苷酶處理時最終產(chǎn)生甘露糖-6-磷酸酯，并且可以產(chǎn)生沒有抗原性的糖鏈。例如，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種甲醇酵母，它產(chǎn)生攜帶具有甘露糖-1-磷酸酯的糖鏈的糖蛋白，并且用α-甘露糖苷酶的處理應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生與芽殖酵母的糖鏈等價的糖鏈。
此外，依照本發(fā)明產(chǎn)生的溶酶體酶并不特定限制于α-半乳糖苷酶。例如，可以用同樣方法表達(dá)和純化下面基因，作為藥物應(yīng)用于治療和/或預(yù)防各種溶酶體疾病編碼β-己糖胺酶A(泰薩病的治療劑)的基因、編碼β-己糖胺酶A和B(?；舴虿〉闹委焺?的基因、編碼半乳糖腦苷脂酶(克拉貝病的治療劑)的基因、編碼α-艾杜糖苷酸酶(胡爾勒病的治療劑)的基因、編碼β-葡糖苷酸酶(斯賴病的治療劑)的基因、編碼巖藻糖苷酶(巖藻糖苷貯積病的治療劑)的基因或編碼α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(Schindler病和Kanzaki病的治療劑)的基因。
在α-半乳糖苷酶的情況下，可以將其用作法布萊病的治療劑，以治療所需量給予α-半乳糖苷酶。這里，治療所需量指α-半乳糖苷酶的量顯著緩解法布萊病癥狀的量。根據(jù)本發(fā)明的詳細(xì)說明，α-半乳糖苷酶具有多種包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈，表現(xiàn)結(jié)合甘露糖-6-磷酸酯受體的活性。將α-半乳糖苷酶作為包含標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、等滲溶液等的藥用組合物給予，并且，例如，可以將該酶通過常規(guī)方法靜脈輸注給予。依照本發(fā)明產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶具有包含甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈，所述糖鏈的量等于或多于從人組織獲得的純化酶樣品以及由培養(yǎng)動物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生的重組酶樣品，因此能夠以更低劑量表現(xiàn)其效應(yīng)，同時避免病毒等的污染(使用動物組織的藥物產(chǎn)生的問題)，以便可以提供穩(wěn)定和高度功能性的藥用組合物。
根據(jù)本發(fā)明，所述藥用組合物除所述糖蛋白外，還可以包含合適的藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、緩沖劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、矯味劑、著色劑、芳香劑等，并且可以制備成為注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、微粒劑、散劑等形式。本發(fā)明所述藥用組合物的劑型可以是口服給藥或胃腸外給藥，例如靜脈注射、肌內(nèi)注射等。劑量將依賴于患者的年齡、體重和癥狀以及給藥途徑，但就對一名成人的活性成分量而言，在口服給藥的情況下優(yōu)選每劑量1-10mg的范圍，在胃腸外給藥的情況下優(yōu)選每劑量10-50mg的范圍。
本發(fā)明不限于溶酶體病的治療劑，因為本發(fā)明還可用作轉(zhuǎn)運糖蛋白到溶酶體的技術(shù)。所述技術(shù)可用于溶酶體酶轉(zhuǎn)運機(jī)制或溶酶體中廢物產(chǎn)物降解機(jī)制的研究，由此導(dǎo)致相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)研究的進(jìn)一步前進(jìn)。
下面將通過實施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，所述實施例不是以任何方式限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。
構(gòu)建包含高度磷酸化糖鏈的糖鏈生物合成雙突變體酵母(釀酒酵母Δoch1 Δmnn1菌株)用BglIII和BamHI從pNK51切割其中沙門氏菌屬hisG基因通過直接重復(fù)連接到URA3基因兩端的盒(HUH)，這已經(jīng)有報道(Alani等，Genetics，116，541-545(1987))，然后將該盒插入大腸桿菌質(zhì)粒pSP73中的BamHI位點。將該質(zhì)粒命名為pSP73-HUH。
OCH1基因位于酵母染色體7上，OCH1基因的DNA核苷酸序列以保藏號D11095在GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊(Nakayama等，EMBO J.，11，2511-2519(1992))。用SalI和HindIII切割以前構(gòu)建的破碎OCH1基因的載體poch1∷LEU2-1(Nakayama等，EMBO J.，11，2511-2519(1992))，切下包含Δoch1∷LEU2的區(qū)，通過乙酸鋰方法(Ito等，J.Bacteriol.，153，163-168(1983))用該區(qū)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生高度磷酸化糖鏈的酵母，即釀酒酵母KK4菌株(MATa URA3 his1或his3 trp1 leu2 gal80；Nogi等，Mol.Gen.Genet.，195，29-34(1984))。Δoch1破壞的菌株表現(xiàn)低滲敏感性。因此，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪展在含0.3M KCl的SD-Ura培養(yǎng)基(2％葡萄糖，0.67％Yeast Nitrogen Base w/o氨基酸(Difco)，除尿嘧啶以外的核堿基(nucleobase)以及氨基酸混合物(20-400mg/L))平板上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得轉(zhuǎn)化子。
從所述轉(zhuǎn)化子制備基因組DNA，通過PCR證實尿嘧啶標(biāo)記整合進(jìn)染色體的Δoch1區(qū)。該轉(zhuǎn)化子命名為HPY11菌株。
MNN1因位于酵母染色體5著絲粒附近，MNN1基因的DNA核苷酸序列以保藏號L23753注冊于GenBank數(shù)據(jù)庫(Yip等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9，2723-2727(1994))。通過PCR用引物A(GGATCCGAAGAAAACCTAATACATTGAAGTSEQ ID NO1)和引物B(GCATGCCCTTTGGTTTAATATAAATCTCCGGAGTGCSEQID NO2)擴(kuò)增MNN1基因的3′區(qū)，通過PCR用引物C(GCATGCTACATAACTCCAATCAGCAGCAAATATGTCSEQ IDNO3)和引物D(GCGGCCGCGTGTTCTGTTCGGGTAACGTTTAAACCAATSEQ IDNO4)擴(kuò)增該基因的5′區(qū)。將獲得的DNA片段加入攜帶HIS3標(biāo)記的質(zhì)粒pHYH中的SphI位點，構(gòu)建pHYHΔmnn1。為使用所述HUH盒破壞MNN1基因，從pHYHΔmnn1獲得1.8kb SphI片段，然后插入pSP73-HUH的SphI位點，構(gòu)建pSP73-Δmnn1∷HUH。在需要線性化的NotI位點切割該質(zhì)粒，通過乙酸鋰方法用于轉(zhuǎn)化菌株HPY11。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪展在含0.3M KCl的SD-Ura培養(yǎng)基平板上，在30℃下培養(yǎng)2天，獲得轉(zhuǎn)化子。
從所述轉(zhuǎn)化子制備基因組DNA，通過PCR證實尿嘧啶標(biāo)記整合入該染色體的MNN1區(qū)。該轉(zhuǎn)化子命名為HPY22菌株。從該菌株開始，在含0.3M KCl和5-FOA的YSD培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％葡萄糖，腺嘌呤(40mg/L)，尿嘧啶(20mg/L))內(nèi)進(jìn)行選擇，由此獲得URA3基因缺陷性菌株。以上述同樣方式，通過PCR證實缺乏URA3基因的mnn1破壞菌株。包含Δoch1∷LEU2 Δmnn1∷hisG的該菌株命名為包含高度磷酸化糖鏈的雙突變體酵母菌株釀酒酵母HPY21。
將α-半乳糖苷酶基因引入Δoch1Δmnn1雙破壞菌株人α-半乳糖苷酶基因的序列作為NM000169在GenBank數(shù)據(jù)庫注冊(Nucleic Acids Res.17(8)，3301-3302(1989))。用EcoRI切割以前報道的pCXN2(在Ishii等，Hum.Genet.89，29-32(1992))，切出人α-半乳糖苷酶的cDNA區(qū)(-16到+1290；SEQ ID No5)。為在酵母中表達(dá)的目的，然后將其插入酵母表達(dá)載體質(zhì)粒YEP352-GAP的EcoRI位點。得到的質(zhì)粒命名為YEP352-GAP-GLN。然后用BamHI從所述質(zhì)粒切下包括啟動子和終止子區(qū)在內(nèi)的編碼人α-半乳糖苷酶的cDNA區(qū)，插入整合載體pRS404的BamHI位點。用Bst1107I切割該質(zhì)粒pRS-GLN-4后，用其轉(zhuǎn)化在實施例1中構(gòu)建的釀酒酵母HPY21菌株。通過乙酸鋰方法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪展在含0.3M KCl的SD-Trp培養(yǎng)基(2％葡萄糖，0.67％Yeast Nitrogen Base w/o氨基酸(Difco)，核堿基/除色氨酸外的氨基酸的混合物(20-400mg/L))平板上，在30℃下培養(yǎng)2天，獲得轉(zhuǎn)化子釀酒酵母HPY21G。
在30℃下5ml含0.3MKCl的YPAD培養(yǎng)基(2％聚胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，腺嘌呤(40mg/L))中培養(yǎng)所述釀酒酵母HPY21G菌株3天，然后離心收集培養(yǎng)物上清液。使用超濾膜(Ultrafree C3LGC(分子量截斷值10,000)，Millipore)獲得作為粗酶溶液的約5倍濃縮物。該粗酶溶液根據(jù)常規(guī)方法用SDS樣品緩沖液變性，然后接受蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)印跡分析使用兔抗α-半乳糖苷酶抗體作為第一抗體，抗兔Ig抗體/堿性磷酸酶復(fù)合物作為第二抗體，通過使用CDP-Star系統(tǒng)(Pierce)的X-射線底片曝光進(jìn)行檢測。
結(jié)果用對照菌株HPY21完全沒有檢測到信號，而在轉(zhuǎn)化子HPY21G的培養(yǎng)物上清中在約50kDa分子量證實有信號(圖5)。
測定所述粗酶溶液中的α-半乳糖苷酶活性。將10μl酶溶液加入60μl 0.15M乙酸緩沖液(pH4.6)中的5mM 4-甲基傘基-D-吡喃半乳糖苷后，使所述混合物在37℃反應(yīng)30分鐘。在所述混合物中加入700μl 0.2M甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液(pH10.7)，終止反應(yīng)。然后使用熒光光度計(Ex365nm，Em450nm)測量所述反應(yīng)混合物。結(jié)果與使用來自對照菌株HPY21的粗酶溶液作為酶來源相比，當(dāng)使用來自菌株HPY21G的粗酶溶液作為酶來源時，熒光顯著增加(表1)。
表1 粗酶溶液中的α-半乳糖苷酶活性
從引入α-半乳糖苷酶基因的菌株的培養(yǎng)物上清液中純化α-半乳糖苷酶，并分析所純化的酶的糖鏈結(jié)構(gòu)以實施例2的相同方式培養(yǎng)引入α-半乳糖苷酶基因的菌株HPY21G并制備其粗酶溶液。將所述粗酶溶液調(diào)節(jié)到pH4.5，用BlueSepharose CL-6B(Pharmacia)進(jìn)行柱層析。用乙酸鈉緩沖液(pH4.5)洗滌后，用含4M NaCl的MES緩沖液(pH6.0)進(jìn)行洗脫。測定每個組分的酶活性后，檢測柱流通組分和洗脫組分中的α-半乳糖苷酶活性。將各組分應(yīng)用于ConA Sepharose。用含0.15M氯化鈉，0.5mM氯化鈣和0.5mM氯化鎂的MES緩沖液(pH6.0)洗滌后，用含0.15M氯化鈉，0.5mM氯化鈣，0.5mM氯化鎂和0.2Mα-甲基甘露糖苷的MES緩沖液(pH6.0)洗脫。然后將洗脫組分上樣到MonoQ。用MES緩沖液(pH6.0)洗滌后，用含1MNaCl的MES緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。透析有強(qiáng)酶活性的組分，然后濃縮獲得純化的α-半乳糖苷酶制備物。
用酶處理獲得的α-半乳糖苷酶，獲得連接天冬酰胺的糖鏈。將糖鏈的凍干產(chǎn)物溶解于100μl N-糖苷酶F緩沖液(含0.5％SDS和0.35％2-巰基乙醇的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0))，然后煮沸所述溶液5分鐘。冷卻到室溫后，加入50μl 7.5％Noridet P-40、138μl H2O和12μl N-糖苷酶F(Behringer)。然后在37℃下處理所述混合物16小時。用BioRad AG50W-X8柱進(jìn)行脫鹽，獲得糖鏈制備物。
執(zhí)行下面程序，熒光標(biāo)記(吡啶基胺化，下文簡寫為“PA”)得到的糖鏈。濃縮所述糖鏈制備物到干燥，然后在其中加入40μl偶聯(lián)試劑(在200μl乙酸中含552mg 2-氨基吡啶的溶液)。密封所述混合物，在90℃處理60分鐘。冷卻到室溫后，加入140μl還原劑(在50μlH2O和80μl乙酸中含200mg硼烷/二甲基胺復(fù)合物的溶液)。密封所述混合物，在80℃處理80分鐘。反應(yīng)后，用TOYOPEARL HW-40F(TOSOH)進(jìn)行凝膠過濾，除去未反應(yīng)的2-氨基吡啶。用0.22μm濾器過濾所述糖鏈組分，由此制備PA-寡糖制備物。
根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人提議的方法(未經(jīng)審查的日本專利公開第9-135689號)分析所述糖鏈結(jié)構(gòu)。應(yīng)用裝備氨基柱的HPLC，有可能根據(jù)鏈長度分離PA-寡糖，并且由于磷酸酯與氨基柱強(qiáng)吸附引起的洗脫時間延遲，還有可能分離磷酸化的糖鏈和未磷酸化的糖鏈。使用Asahipak NH2P-50氨基柱(4.6×250mm)作為柱子。使用的溶劑是200mM乙酸-三乙胺(pH7.2)作為溶劑A，乙腈作為溶劑B。事先以1.0ml/分鐘的流速流過30％溶劑A和70％溶劑B，平衡柱子。以1.0ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫，在50分鐘內(nèi)線性梯度從70％溶劑B開始直到20％溶劑B，然后洗脫PA-寡糖。結(jié)果顯示于圖6。在約20分鐘(峰A)洗脫用Blue Sepharose洗脫組分中α-半乳糖苷酶制備的糖鏈，而在約30分鐘(峰B)和約38分鐘(峰C)洗脫用Blue Sepharose流出組分內(nèi)α-半乳糖苷酶制備的糖鏈。
峰A在與Man8GlcNAc2-PA相同的位點洗脫出。這指出它是具有未添加磷酸酯的Man8GlcNAc2結(jié)構(gòu)的糖鏈。峰B和峰C的洗脫點指出峰B是具有一個分子甘露糖-1-磷酸酯的糖鏈，峰C是具有兩分子甘露糖-1-磷酸酯的糖鏈。根據(jù)下文描述的方法，通過堿性磷酸酶處理進(jìn)一步證實峰B和峰C的結(jié)構(gòu)。
這些結(jié)果證明其中已經(jīng)引入α-半乳糖苷酶基因的包含高度磷酸化糖鏈的酵母糖鏈生物合成雙突變體菌株HPY21G產(chǎn)生具有糖鏈的α-半乳糖苷酶，所述糖鏈?zhǔn)翘砑恿姿狨サ母吒事短切吞擎?Man-P)2-Man8GlcNAc2和(Man-P)-Man8GlcNAc2以及高甘露糖型糖鏈Man8GlcNAc2，比例約為1∶1∶1。
已知Blue Sepharose層析能夠分離具有磷酸化糖鏈的α-半乳糖苷酶以及沒有磷酸化糖鏈的α-半乳糖苷酶。
分析反應(yīng)產(chǎn)物(峰B和C)(圖6)，確認(rèn)它們是否是添加甘露糖-1-磷酸酯的產(chǎn)物。首先，對已經(jīng)通過NMR證實結(jié)構(gòu)的化合物(圖3，結(jié)構(gòu)式II、III和IV)進(jìn)行HPLC，由此具有結(jié)構(gòu)式II和III的化合物在約30分鐘洗脫。因此，得出結(jié)論在活性測定中出現(xiàn)的峰B也包含具有一個分子甘露糖-1-磷酸酯的糖鏈。具有兩分子甘露糖-1-磷酸酯的結(jié)構(gòu)式IV的洗脫點比該峰晚很多，因此假設(shè)峰C是具有兩分子甘露糖-1-磷酸酯的糖鏈。
為直接證實峰B代表具有一分子甘露糖-1-磷酸酯的糖鏈，分級分離峰B，用刀豆α-甘露糖苷酶消化，從甘露糖-1-磷酸酯殘基上切下甘露糖部分。通過凍干除去所述分級分離組分中的溶劑，然后加入在乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中的60mU刀豆α-甘露糖苷酶(SeikagakuCorp.)，在37℃過夜。如圖7b所示，結(jié)果在比原始糖鏈更遲的一點洗脫。在接受堿性磷酸酶處理時，洗脫出現(xiàn)在與Man4GlcNAc2-PA相同的點，指出用刀豆α-甘露糖苷酶處理的糖鏈具有結(jié)構(gòu)PO4-Man4GlcNAc2-PA。峰C也以同樣方式進(jìn)行刀豆α-甘露糖苷酶處理和堿性磷酸酶處理，和峰B一樣，洗脫出現(xiàn)在更遲的一點。此外，清楚地證明峰C代表圖3中結(jié)構(gòu)式IV顯示的酸性糖鏈，因為當(dāng)僅接受堿性磷酸酶處理時，它在Man6GlcNAc2-PA的同一點洗脫(圖7d)。
上面結(jié)果指出接受測試的菌株適于產(chǎn)生具有添加甘露糖-1-磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白，作為有效的具有添加甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白的前體。
來自纖維單胞菌屬SO-5的α-甘露糖苷酶以及污染酶的活性測定當(dāng)從土壤細(xì)菌篩選新型產(chǎn)生α-甘露糖苷酶的細(xì)菌時，本發(fā)明的發(fā)明人通過使用α-甘露聚糖作為底物的反應(yīng)，并隨后測量游離糖的還原能力，測定甘露聚糖降解活性。具體地說，在含α-甘露聚糖(最終濃度0.1％)和酶溶液的反應(yīng)溶液(0.4M磷酸緩沖液，pH7.0)中37℃下進(jìn)行反應(yīng)10分鐘，然后使用甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)，通過Nelson-Somogyi方法測定還原性糖(Sakuzo Fukui，Seibutukagaku-jikkenhou Series 1，“Kangentou no teiryouhou(還原性糖定量方法)”(Gakkai shuppanCenter)，第10頁(1979))。
通過使用4-甲基傘形基(MU)-α-吡喃甘露糖苷作為底物的反應(yīng)，然后測量游離4-MU，測定粗酶和每個純化階段部分純化酶的α-甘露糖苷酶活性。具體地說，在含0.5mM 4-MU-α-吡喃甘露糖苷和酶溶液的70μl反應(yīng)溶液(含0.15M NaCl的20mM磷酸緩沖液，pH7.5)中37℃下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。隨后，在所述混合物中加入700μl 0.2M甘氨酸緩沖液(pH10.7)，終止反應(yīng)。取其100μl等分物樣，用微量培養(yǎng)板讀板器(Ex385nm，Em450nm)測量游離4-MU的熒光。對于酶活性，在該反應(yīng)中每1分鐘釋放1μmol 4-MU的酶量定義為一單位(下文表示為“U”)。
如下測定共存的污染酶。
通過使用α-1，6-甘露聚糖作為底物的反應(yīng)，然后測量游離糖的還原能力，測定內(nèi)切-α-甘露糖苷酶活性。具體地說，在含α-1，6-甘露聚糖(終濃度0.1％)和酶溶液的反應(yīng)溶液中37℃下反應(yīng)10分鐘，然后使用甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)，通過Nelson-Somogyi方法測定還原性糖(SakuzoFukui，Seibutukagaku-jikkenhou Series 1，“Kangentou no teiryouhou(還原性糖定量方法)”(Gakkai shuppan Center)，第10頁(1979))。
通過使用對硝基苯(pNP)-β-D-吡喃甘露糖苷作為底物的反應(yīng)，然后測量游離pNP，測定β-甘露糖苷酶活性。具體地說，在含5mMpNP-β-D-吡喃甘露糖苷和酶溶液的70μl反應(yīng)溶液(含0.15M NaCl的20mM磷酸緩沖液，pH7.5)中37℃下進(jìn)行反應(yīng)24小時。隨后在所述混合物中加入700μl 0.2M甘氨酸緩沖液(pH10.7)，終止反應(yīng)。取其100μl等分物樣，用微量培養(yǎng)板讀板器(Ex385nm，Em450nm)測量游離4-MU的熒光。對于酶活性，在該反應(yīng)中每1分鐘釋放1μmol4-MU的酶量定義為一單位(下文表示為“U”)。
篩選產(chǎn)生α-甘露糖苷酶的細(xì)胞以下面方式制備用于誘導(dǎo)產(chǎn)生甘露糖苷酶的培養(yǎng)基(甘露聚糖液體培養(yǎng)基。在2g baker’s酵母甘露聚糖，500mg硫酸銨[(NH4)2SO4]，20mg硫酸鐵(II)[Fe2SO4]，400mg硫酸鎂[MgSO4·7H2O]，60mg氯化鈣[CaCl2·2H2O]，1g酵母提取物，7.54g磷酸氫二鉀[K2HPO4]和2.32g單磷酸鉀[KH2PO4]的混合物中加水到1L體積。在上述甘露聚糖液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉達(dá)到1.5％的濃度，制備用于分離產(chǎn)生甘露糖苷酶的細(xì)胞的平板培養(yǎng)基。
用接種環(huán)將土壤懸浮液中的細(xì)胞接種到含2ml甘露聚糖液體培養(yǎng)基的試管中，30℃下震蕩培養(yǎng)2個晚上。用接種環(huán)再次將所述培養(yǎng)物接種到2ml新鮮的甘露聚糖液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在30℃下震蕩培養(yǎng)兩個晚上。總共三個循環(huán)的兩夜震蕩培養(yǎng)后，進(jìn)行兩次震蕩培養(yǎng)過夜。離心培養(yǎng)物，上清液對10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，獲得粗酶溶液，然后測定粗酶溶液的甘露聚糖降解酶活性。進(jìn)一步篩選表現(xiàn)所述活性的土壤樣品中產(chǎn)生α-甘露糖苷酶的菌株。
通過劃線法和稀釋法將所述活性培養(yǎng)物接種到平板上，在30℃培養(yǎng)。幾天后，檢取出現(xiàn)的集落，接種到甘露聚糖液體培養(yǎng)基，30℃下震蕩培養(yǎng)兩夜。離心所述培養(yǎng)物，上清液對10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，獲得粗酶溶液，然后使用α-甘露聚糖和合成底物測定所述粗酶溶液的酶活性。
重復(fù)該程序幾個循環(huán)后，檢取清晰的單集落，分離合乎標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)生α-甘露糖苷酶的菌株。得到的生產(chǎn)菌株命名為SO-5。所述SO-5于2001年6月12日以保藏號FERM BP-7628國際保藏于InternationalPatent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)。
鑒定新型產(chǎn)生α-甘露糖苷酶的菌株SO-5核糖體RNA基因的核苷酸序列同源性在分子系統(tǒng)演化和分類學(xué)上是重要的。核糖體RNA基因的構(gòu)型和拷貝數(shù)量根據(jù)生物物種的不同而不同。這允許技術(shù)人員根據(jù)核糖體RNA的核苷酸序列鑒定細(xì)菌。
使用Wizard基因組DNA純化試劑盒(Promega)從菌株SO-5分離基因組DNA。使用所述基因組DNA作為PCR擴(kuò)增編碼核糖體RNA區(qū)的核苷酸序列的模板DNA。使用的引物是SPF1(AGAGTTTGATCCTGGCTCAGSEQ ID No5)和SPR1(GGTTACCTTGTTACGACTTSEQ ID No6)。將得到的約1.5kb片段克隆進(jìn)PGEM-T載體(Promega)，然后通過雙脫氧方法部分確定核苷酸序列。結(jié)果顯示于SEQ ID No7。
使用BLAST系統(tǒng)對該序列進(jìn)行同源性搜索，所述BLAST系統(tǒng)可以在Japanese DNA Databank網(wǎng)站上獲得。結(jié)果指出該序列與溶黃嘌呤厄氏菌(Oerskovia xanthineolytica)和纖維單胞菌屬都有高同源性。已知厄氏菌屬(Oerskovia)形成分支集落，而SO-5形成一般的圓形集落。這提示菌株SO-5是一種纖維單胞菌屬菌種。
生產(chǎn)和部分純化α-甘露糖苷酶為誘導(dǎo)產(chǎn)生α-甘露糖苷酶，參考實施例2中獲得的菌株SO-5在甘露聚糖培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，在4℃，15,000xg下離心10分鐘，去除細(xì)胞。上清液對含2mM氯化鈣的10mM HEPES-Na緩沖液(pH7.0)透析，獲得粗酶溶液。
然后在所述粗酶溶液中加入硫酸銨達(dá)到1.2M的終濃度，4℃下混合過夜。離心后，將上清液與沉淀分開，加入硫酸銨達(dá)到1.7M的終濃度，然后繼續(xù)在4℃下混合過夜。所述混合物在4℃下15,000xg離心10分鐘，收集沉淀的蛋白。獲得的沉淀溶解于H2O，對含2mM氯化鈣的10mM HEPES-Na緩沖液(pH7.0)透析。然后將其上樣到用含2mM氯化鈣的10mM HEPES-Na緩沖液(pH7.0)平衡的HiTrap Q柱。用增加直到1M的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，由此獲得活性組分。將該組分對含2mM氯化鈣的10mM HEPES-Na緩沖液(pH7.0)透析，獲得部分純化的樣品。
根據(jù)參考實施例1的程序，測定所述部分純化的制備物中的α-甘露糖苷酶活性、內(nèi)切α-甘露糖苷酶活性和β-甘露糖苷酶活性。比活是31.9mU/mg，沒有檢測到內(nèi)切α-甘露糖苷酶活性或β-甘露糖苷酶活性。
來自纖維單胞菌屬的α-甘露糖苷酶的酶學(xué)活性對參考實施例4中獲得的純化酶進(jìn)行下面檢查。
(a)最佳pH通過分別使用乙酸鈉緩沖液(pH4.0-6.5)、磷酸鹽緩沖液(pH6.0-8.0)和Tris緩沖液(pH7.5-10.0)，在37℃下酶反應(yīng)30分鐘，測試所述酶。確定最佳pH是pH7-8，尤其是約7.5。
(b)最佳溫度通過在磷酸鹽緩沖液(PH7.5)內(nèi)20-80℃之間的不同溫度反應(yīng)30分鐘，測試所述酶。確定最佳溫度是35-45℃，尤其是約40℃。
(c)穩(wěn)定溫度所述酶在0-80℃范圍內(nèi)在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中處理30分鐘，然后通過37℃下酶反應(yīng)30分鐘檢查殘余活性(相對活性)。該酶在直到40℃都是穩(wěn)定的。
(d)金屬離子效應(yīng)將無機(jī)離子和抑制劑加入反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃下酶反應(yīng)30分鐘后，檢測它們對所述酶的效應(yīng)。通過加入Ca2+產(chǎn)生輕微激活(10％)。加入Hg2+和乙二胺四乙酸(EDTA)100％抑制活性，但加入Ca2+則恢復(fù)活性。
(e)米氏常數(shù)通過用底物濃度倒數(shù)對反應(yīng)速率倒數(shù)作圖，確定該酶對4-MU-α-吡喃甘露糖苷的米氏常數(shù)(Km)。Km是0.32mM-1。用高濃度底物(≥1mM)觀察到底物抑制。
(f)對高甘露糖糖鏈的作用使用裝備氨基柱的HPLC，根據(jù)鏈長度可分離熒光標(biāo)記(PA)的寡糖。使用的柱子是SHODEX AsahiPakNH2P-50(4.6×250mm，Showa Denko)。制備如下的混合物作溶劑200mM乙酸-三乙胺緩沖液(PH7.0)和乙腈的30∶70混合物作為溶劑A，200mM乙酸-三乙胺緩沖液(pH7.0)和乙腈的50∶50混合物作為溶劑B。事先用溶劑A以流速1.0ml/分鐘流過，平衡柱子，進(jìn)樣后立即在50分鐘內(nèi)將溶劑B的比例線性增加到100％，洗脫PA-寡糖。使用熒光檢測器(激發(fā)波長320nm，熒光波長400nm)檢測PA-寡糖。37℃下在含100pmol糖鏈的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中加入20μU本發(fā)明的酶組分處理10分鐘到2小時。當(dāng)使用下面結(jié)構(gòu)式的Man8GlcNAc2-PA(M8)作為底物時 該底物相當(dāng)快速地降解為Man5GlcNAc2-PA(M5)，然后緩慢產(chǎn)生Man4GlcNAc2-PA(M4)以及少量Man2GlcNAc2-PA(M2)。反應(yīng)2小時后，除Man4GlcNAc2-PA外，還觀察到代表Man3GlcNAc-PA(M3)、Man2GlcNAc2-PA(M2)和Man1GlcNAc2-PA(M1)的3個峰。這指出，該酶非特異性地作用于非還原端的α-甘露糖苷鍵，包括α-1，2-甘露糖苷鍵、α-1，3-甘露糖苷鍵和α-1，6-甘露糖苷鍵。根據(jù)這些結(jié)果，還預(yù)測不會同時存在內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。
(g)對具有β-甘露糖苷鍵的糖鏈的作用使用對硝基苯-β-D-甘露糖苷作為底物沒有觀察到活性，由此指出該酶不作用于β-甘露糖苷。
(h)對酵母中含磷酸酯的酸性糖鏈的作用已知由酵母產(chǎn)生的糖鏈的一個例子是含磷酸酯的糖鏈(Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem.，56，915-944(1987))。檢查對具有下面結(jié)構(gòu)式所示結(jié)構(gòu)的糖鏈的作用。
使用SuperQ 5PW(Toso)進(jìn)行分析。制備以下溶劑2mM乙酸鈉緩沖液(PH5.0)作為溶劑A，0.25M乙酸鈉緩沖液(pH5.0)作為溶劑B。事先用溶劑A以流速1.0ml/分鐘流過，平衡柱子，進(jìn)樣后立即在30分鐘內(nèi)將溶劑B的比例線性增加到100％，洗脫PA-寡糖。在含100pmol糖鏈的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中加入20μU酶組分，37℃過夜。由于磷酸酯基團(tuán)的負(fù)電荷增加，因此已經(jīng)切除連接磷酸酯的甘露糖的糖鏈在延遲的保留時間洗脫。對照糖鏈(未經(jīng)酶處理)在約10分鐘洗脫，而暴露于酶的那些糖鏈在12分鐘后出現(xiàn)另一個峰。由于該洗脫點匹配其中連接磷酸酯的甘露糖已經(jīng)通過化學(xué)處理從結(jié)構(gòu)式6的糖鏈上去除的糖鏈的洗脫點。因此證明該酶能夠切割連接磷酸二酯的α-甘露糖。
對糖蛋白的作用已知核糖核酸酶B(RNase B)是一種攜帶高甘露糖型糖鏈的糖蛋白。在參考實施例2中獲得的100μUα-甘露糖苷酶組分加入20μg核糖核酸酶B中，反應(yīng)在0.1M磷酸鉀緩沖液(PH7.0)存在下于37℃進(jìn)行14小時。作為對照，僅加入等量緩沖液而不是α-甘露糖苷酶組分。在通過SDS-PAGE逐一進(jìn)行分析時，添加α-甘露糖苷酶組分的樣品與對照相比表觀分子量降低。該表觀分子量接近具有相同肽序列并且僅缺乏糖鏈的核糖核酸酶A(RNase A)的表觀分子量。在測定核糖核酸酶活性時，事實上與反應(yīng)前相比沒有發(fā)現(xiàn)活性降低。這提示，所述添加酶組分的樣品僅切割所述高甘露糖型糖鏈的α-甘露糖苷鍵部分，而保留所述糖鏈的Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc根部分，對蛋白部分沒有影響。
用不同α-甘露糖苷酶進(jìn)行的消化實驗用不同α-甘露糖苷酶處理實施例3中獲得的α-半乳糖苷酶，確定所述α-甘露糖苷酶是否作用于糖蛋白并且能夠降解所述糖鏈的甘露糖-1-磷酸酯鍵。
在實施例3中純化的1mgα-半乳糖苷酶中加入乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中的2mU刀豆α-甘露糖苷酶(Seikagaku Corp.)，反應(yīng)在37℃下進(jìn)行過夜。對α-半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)印跡分析顯示與未處理的α-甘露糖苷酶相同的遷移率。對該糖鏈的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果指出，該糖鏈中的甘露糖-1-磷酸酯鍵沒有受到切割。因此得出結(jié)論，在這些條件下甘露糖-1-磷酸酯鍵不被切割。
因此考慮有必要篩選新型甘露糖苷酶。嘗試使用來自如上文所述的纖維單胞菌屬SO-5的α-甘露糖苷酶切割甘露糖-1-磷酸酯鍵。
在實施例3純化的1mgα-半乳糖苷酶內(nèi)加入90μU來自上述纖維單胞菌屬SO-5的α-甘露糖苷酶后，反應(yīng)在37℃下進(jìn)行過夜。對α-半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)印跡分析顯示比未處理的α-甘露糖苷酶更大的遷移率(圖8)。如實施例3同樣方式對所述α-半乳糖苷酶的糖鏈進(jìn)行的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果指出，所述糖鏈的甘露糖-1-磷酸酯鍵受到切割，并且洗脫點與暴露的磷酸酯基團(tuán)的洗脫點一致(圖9)。
此外，由于進(jìn)一步用堿性磷酸酶處理后洗脫出現(xiàn)在與Man6GlcNAc2-PA的同一點，因此證明通過用α-甘露糖苷酶處理獲得的糖鏈具有(PO4)2Man6GlcNAc2-PA或PO4-Man4GlcNAc2-PA的結(jié)構(gòu)。
大規(guī)模制備包含高度磷酸化糖鏈的α-半乳糖苷酶制備大量具有高度磷酸化糖鏈的α-半乳糖苷酶。在實施例3純化的300μgα-半乳糖苷酶中加入磷酸緩沖液(pH7.5)中30mU上述來自纖維單胞菌屬SO-5的α-甘露糖苷酶，反應(yīng)在37℃下進(jìn)行6小時，然后加入30mUα-甘露糖苷酶，繼續(xù)反應(yīng)12小時。反應(yīng)后，使用MonoQ柱進(jìn)行純化。在組分15-18收集α-半乳糖苷酶活性，在組分26-29收集α-甘露糖苷酶活性。
使用來自法布萊病患者的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞對純化的α-半乳糖苷酶進(jìn)行攝取實驗在37℃，5％CO2下，在3.5cm直徑碟內(nèi)補(bǔ)充10％FCS的Ham’sF10培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自法布萊病患者的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞(F377，F(xiàn)87)。然后，在所述培養(yǎng)物中加入實施例5中甘露糖苷酶處理的α-半乳糖苷酶或者未接受處理的α-半乳糖苷酶直到0.1μg/ml或1μg/ml的終濃度，18小時后，收集細(xì)胞，測定細(xì)胞提取物中的α-半乳糖苷酶活性。作為對照，還測定來自正常個體的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞(F592)的細(xì)胞內(nèi)活性。在抑制實驗中，為證實依賴于甘露糖-6-磷酸酯受體的攝取，在所述培養(yǎng)物中加入甘露糖-6-磷酸酯達(dá)到5mM的終濃度。結(jié)果顯示于圖10。
當(dāng)加入α-半乳糖苷酶達(dá)到1μg/ml的終濃度時，與使用未經(jīng)甘露糖苷酶處理的酶相比，使用處理過的酶使來自法布萊病患者的細(xì)胞中α-甘露糖苷酶活性增加到約3倍。此外，由于甘露糖-6-磷酸酯抑制酶活性的增加，因此用甘露糖苷酶處理的α-半乳糖苷酶明顯地以依賴于甘露糖-6-磷酸酯受體的方式被攝入細(xì)胞。這提示，所述用甘露糖苷酶處理的α-半乳糖苷酶具有與人類酶相同的攜帶甘露糖-6-磷酸酯的糖鏈結(jié)構(gòu)。
然后，在Nunc的8室載玻片上每室接種5×103個來自法布萊病患者的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞(F377)，然后培養(yǎng)24小時，加入α-半乳糖苷酶達(dá)到1μg/ml。作為對照，用來自一名健康人的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞(F592)進(jìn)行同樣程序。培養(yǎng)18小時或5天后，使用針對累積的globotriosylceramide(CTH)作為第一抗體，進(jìn)行免疫熒光染色(圖11)。
通過免疫染色檢查在所述培養(yǎng)物中加入α-半乳糖苷酶對來自法布萊病患者的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中CTH積累的效應(yīng)(圖11的右邊酶(+))。通過用抗CTH抗體作為第一抗體處理，然后用FITC-抗鼠IgG抗體作為第二抗體染色，檢測CTH，顯色為綠色。通過用抗α-半乳糖苷酶抗體作為第一抗體和Cy3-抗兔IgG抗體作為第二抗體進(jìn)行處理，檢測細(xì)胞內(nèi)α-半乳糖苷酶，顯色為紅色。兩種顏色合并的區(qū)域表現(xiàn)為黃色。為進(jìn)行比較，在左邊(酶(-))顯示來自一名健康人的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞的染色，以及來自法布萊病患者的未受處理的培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞的α-半乳糖苷酶的染色。
結(jié)果，加入用甘露糖苷酶處理的α-半乳糖苷酶使得用抗CTH抗體的染色5天后明顯降低。此外，由于α-半乳糖苷酶在添加后18小時被攝入細(xì)胞中，并且染色甚至在5天后仍然存在，因此推斷其高度穩(wěn)定。累計的CTH被降解的事實提示，依照本發(fā)明產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶作為溶酶體病的治療劑是有效的。
工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明通過使用酵母的遺傳工程的方法允許大量和高純度地生產(chǎn)具有包含磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白，其中所述糖鏈可以作為轉(zhuǎn)運進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞如人的溶酶體中的標(biāo)記性標(biāo)記。依照本發(fā)明的具有包含磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白可以用作有效治療例如人類溶酶體酶缺陷的藥物。
在本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請都通過引用完整地結(jié)合到本文中。
序列表<110>National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research<120>藥用組合物及其制備方法<130>PH-1592-PCT<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增MNN1基因3′區(qū)的引物A<400>1ggatccgaag aaaacctaat acattgaagt 30<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增MNN1基因3′區(qū)的引物B
<400>2gcatgccctt tggtttaata taaatctccg gagtgc36<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增MNN1基因5′區(qū)的引物C<400>3gcatgctaca taactccaat cagcagcaaa tatgtc36<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增MNN1基因5′區(qū)的引物D<400>4gcggccgcgt gttctgttcg ggtaacgttt aaaccaat 38<210>5<211>1306<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(17)(1306)
<400>5tccggtcacc gtgacaatgc agctgaggaa cccagaacta catctgggct gcgcgcttgc 60gcttcgcttc ctggccctcg tttcctggga catccctggg gctagagcac tggacaatgg 120attggcaagg acgcctacca tgggctggct gcactgggag cgcttcatgt gcaaccttga 180ctgccaggaa gagccagatt cctgcatcag tgagaagctc ttcatggaga tggcagagct 240catggtctca gaaggctgga aggatgcagg ttatgagtac ctctgcattg atgactgttg 300gatggctccc caaagagatt cagaaggcag acttcaggca gaccctcagc gctttcctca 360tgggattcgc cagctagcta attatgttca cagcaaagga ctgaagctag ggatttatgc 420agatgttgga aataaaacct gcgcaggctt ccctgggagt tttggatact acgacattga 480tgcccagacc tttgctgact ggggagtaga tctgctaaaa tttgatggtt gttactgtga 540cagtttggaa aatttggcag atggttataa gcacatgtcc ttggccctga ataggactgg 600cagaagcatt gtgtactcct gtgagtggcc tctttatatg tggccctttc aaaagcccaa 660ttatacagaa atccgacagt actgcaatca ctggcgaaat tttgctgaca ttgatgattc 720ctggaaaagt ataaagagta tcttggactg gacatctttt aaccaggaga gaattgttga 780tgttgctgga ccagggggtt ggaatgaccc agatatgtta gtgattggca actttggcct 840cagctggaat cagcaagtaa ctcagatggc cctctgggct atcatggctg ctcctttatt 900catgtctaat gacctccgac acatcagccc tcaagccaaa gctctccttc aggataagga 960cgtaattgcc atcaatcagg accccttggg caagcaaggg taccagctta gacagggaga 1020caactttgaa gtgtgggaac gacctctctc aggcttagcc tgggctgtag ctatgataaa 1080ccggcaggag attggtggac ctcgctctta taccatcgca gttgcttccc tgggtaaagg 1140agtggcctgt aatcctgcct gcttcatcac acagctcctc cctgtgaaaa ggaagctagg 1200gttctatgaa tggacttcaa ggttaagaag tcacataaat cccacaggca ctgttttgct 1260tcagctagaa aatacaatgc agatgtcatt aaaagactta ctttaa 1306<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物SPF1
<400>6agagtttgat cctggctcag 20<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物SPR1<400>7ggttaccttg ttacgactt 19<210>8<211>619<212>DNA<213>纖維單胞菌(Cellulomonas sp.)<400>8ggatgaaggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga agaagcgcaa gtgacggtac 60ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaac 120gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc tggtgtgaaa 180actcgaggct caacctcgag cttgcatcgg gtacgggcag actagagtgc ggtaggggag 240actggaattc ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa 300ggcaggtctc tgggccgcaa ctgacgctga ggagcgaaag catggggagc gaacaggatt 360agataccctg gtagtccatg ccgtaaacgt tgggcactag gtgtggggct cattccacga 420gttccgtgcc gcagcaaacg cattaagtgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa 480aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt aattcgatgc 540aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat gcacgggaag ccaccagaga tggtggtctc 600tttggacact cgtgcacag 619
權(quán)利要求
1.一種使用酵母生產(chǎn)活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非還原端攜帶甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈可以結(jié)合甘露糖-6-磷酸酯受體。
3.一種使用酵母生產(chǎn)活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非還原端攜帶甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖鏈，其中所述高甘露糖型糖鏈顯示于下面結(jié)構(gòu)式I到VIII
4.權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其中所述酵母包含酸性糖鏈，并且使用的所述酵母菌株中至少α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)被破壞。
5.權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其中所述酵母包含酸性糖鏈，并且使用的所述酵母菌株中至少α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因和α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)被破壞。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因是釀酒酵母(S.cerevisiae)的OCH1基因，所述α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因是釀酒酵母的MNN1基因。
7.權(quán)利要求1到6中任一項的方法，其中所述酵母是含高度磷酸化糖鏈的突變體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述酵母是釀酒酵母菌株HPY21。
9.權(quán)利要求1到8中任一項的方法，其中所述具有攜帶甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈的活性形式糖蛋白是一種溶酶體酶。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述溶酶體酶是α-半乳糖苷酶。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因是來自人類的基因。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因具有SEQ.ID.No5表示的核苷酸序列。
13.權(quán)利要求10到12中任一項的方法，其中生產(chǎn)所述α-半乳糖苷酶的酵母是菌株HPY21G。
14.權(quán)利要求1到13中任一項的方法，所述方法允許α-甘露糖苷酶作用于由權(quán)利要求4到8中任一項定義的酵母產(chǎn)生的糖蛋白，從而從糖鏈中的甘露糖-1-磷酸酯鍵除去甘露糖殘基。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有從甘露糖-1-磷酸酯鍵除去甘露糖殘基的活性。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有非特異性破壞α-1，2-甘露糖苷鍵、α-1，3-甘露糖苷鍵和α-1，6-甘露糖苷鍵的活性。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述α-甘露糖苷酶活性是外切型活性，并且不包含內(nèi)切型活性。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述α-甘露糖苷酶是來自纖維單胞菌屬(Cellulomonas)細(xì)菌的α-甘露糖苷酶。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述纖維單胞菌屬細(xì)菌是纖維單胞菌SO-5。
20.一種糖蛋白，所述糖蛋白由酵母產(chǎn)生而且具有在非還原端攜帶甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖鏈。
21.權(quán)利要求20的糖蛋白，所述糖蛋白是一種溶酶體酶。
22.權(quán)利要求20或21的糖蛋白，所述糖蛋白是用權(quán)利要求1到19中任一項的方法產(chǎn)生獲得的。
23.權(quán)利要求21或22的糖蛋白，所述糖蛋白是α-半乳糖苷酶。
24.權(quán)利要求23的糖蛋白，所述糖蛋白是由人類基因編碼的α-半乳糖苷酶。
25.權(quán)利要求20的糖蛋白，所述糖蛋白具有在非還原端攜帶甘露糖-6-磷酸酯的高甘露糖型糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈，其中所述糖鏈顯示于下面結(jié)構(gòu)式I到VIII
26.一種用于治療和/或預(yù)防溶酶體病的藥用組合物，所述組合物包含依照權(quán)利要求20到25中任一項的糖蛋白。
27.權(quán)利要求26的藥用組合物，所述藥用組合物用于治療法布萊病，其中所述糖蛋白是人α-半乳糖苷酶。
全文摘要
一種生產(chǎn)具有包含甘露糖－6－磷酸酯的酸性糖鏈的溶酶體酶的方法，所述方法的特征在于包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過將溶酶體酶引入酵母糖鏈合成酶變體而獲得的酶細(xì)胞，從所述培養(yǎng)物收集具有包含磷酸酯的糖鏈的溶酶體酶，然后用α－甘露糖苷酶處理所述酶；以及用所述方法產(chǎn)生的用于治療人類溶酶體酶缺陷的藥用組合物。使用上述酶，利用遺傳工程技術(shù)可大量和高純度生產(chǎn)具有包含磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白，所述酸性糖鏈可以用作轉(zhuǎn)運進(jìn)入哺乳動物例如人的細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)記性標(biāo)志。可以利用上述具有包含磷酸酯的酸性糖鏈的糖蛋白作為有效治療人類溶酶體酶缺陷等的藥物。
文檔編號A61P43/00GK1541275SQ0281580
公開日2004年10月27日 申請日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月14日
發(fā)明者竹內(nèi)誠, 典, 千葉靖典, 地神芳文, 文, 櫻庭均, 男, 小林和男 申請人:獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所, 財團(tuán)法人東京都醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)