一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法和培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法和培養(yǎng)方法。該分離方法包括：用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污；將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時(shí)去除臍動(dòng)脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠均勻剪碎；用MSCs培養(yǎng)基重懸剪碎的華通氏膠，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。上述培養(yǎng)方法包括：對培養(yǎng)皿進(jìn)行包被處理，棄去明膠，用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌；將分離獲得的組織塊和細(xì)胞重懸液接種于培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞生長融合至80%-90%時(shí)進(jìn)行消化傳代。
【專利說明】—種胳帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分罔方法和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法和培養(yǎng)方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是廣泛存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中的多能干細(xì)胞，具有良好增殖能力和多向分化潛能，在特定條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞等功能性細(xì)胞分化。因?yàn)镸SCs來源方便，易于分離、體外擴(kuò)增和純化，且在傳代擴(kuò)增后仍可保持干性，因此是組織工程、基因工程和細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞來源。此外，MSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，在移植中具有低免疫原性的特點(diǎn)，在終末期肝病等終末期疾病以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前已經(jīng)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)研究證實(shí)，在終末期肝病治療中，MSCs移植能夠明顯改善患者的肝功能；而將皮膚角質(zhì)細(xì)胞與MSCs混合后進(jìn)行移植，可有效延長移植皮膚的存活時(shí)間并減少異體移植物抗免疫疾病(graft versus host disease, GVHD)。對于MSCs免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究認(rèn)為，MSCs主要通過旁分泌作用，產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)因子，作用于免疫細(xì)胞后，誘導(dǎo)免疫耐受，從而發(fā)揮調(diào)控機(jī)體的免疫的作用。
[0004]此外，通過將MSCs進(jìn)行基因修飾，把IFN β、EPO等基因?qū)肫浠蚪M中，可獲得能夠在體內(nèi)長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)該蛋白或細(xì)胞因子的功能性細(xì)胞。吳祖澤等人把HGF的基因?qū)隡SCs中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HGF基因轉(zhuǎn)染的人骨髓MSC仍維持原有的增殖和分化能力，而對體外細(xì)胞免疫反應(yīng)具有更強(qiáng)的抑制效果，因此在組織器官移植中存在更大的潛在應(yīng)用價(jià)值(邊莉，郭子寬，艾輝勝，王 華，孟二紅，吳祖澤，王立生；HGF基因修飾增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊；2006，30(4):323-328)。正因如此，目前各國均投入大量人力物力經(jīng)費(fèi)進(jìn)行廣泛和深入的研究。但所有的研究或治療方案都必須建立在足夠量MSCs獲取的基礎(chǔ)上，因此建立穩(wěn)定有效快速的MSCs分離、擴(kuò)增、質(zhì)量控制的技術(shù)體系具有重要的意義。
[0005]在人體組織中，骨髓中存在大量的MSCs，然而隨著年齡老化，自體骨髓中的MSCs的數(shù)目會顯著降低、且增殖能力也會大幅衰退。同時(shí)，為保證自體或供體安全，對骨髓MSCs的采集技術(shù)要求嚴(yán)格，配套儀器精密、成本高，不宜應(yīng)用推廣。因此，對于骨髓以外來源的研究越來越被重視。目前，不同的研究已經(jīng)從圍產(chǎn)期的胎盤、臍帶、臍帶血，抽脂術(shù)來源的脂肪以及流產(chǎn)胎兒中分離獲得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而這些組織中，臍帶屬于醫(yī)療廢棄物，具有易于獲得、來源穩(wěn)定可控、無倫理爭議問題的特點(diǎn)，具有良好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。
[0006]目前對于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離的方法主要有貼壁法和酶消化法兩種。其中貼壁法操作簡便，對實(shí)驗(yàn)條件要求最低，是最易于推廣的方式。然而，獲得原代細(xì)胞周期長、不可避免混雜部分內(nèi)皮細(xì)胞，需后期通過酶消化法進(jìn)一步進(jìn)行篩選，因此仍有待于進(jìn)一步改進(jìn)。而酶消化法獲得較高純度的MSCs，但獲取的效率較低、單細(xì)胞貼壁能力弱、生長速度較慢。
[0007]除了分離培養(yǎng)方法，MSCs培養(yǎng)基同樣對細(xì)胞獲得效率以及細(xì)胞質(zhì)量至關(guān)重要。在目前已知來源中，MSCs含量極低，因此為獲得足夠數(shù)量的MSCs，不但需要對分離方法進(jìn)行優(yōu)化，增加細(xì)胞得率，同時(shí)需要對獲得的MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增。含血清培養(yǎng)基雖然可以在較短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增MSCs，但動(dòng)物血清所帶來的異源性污染可為臨床MSCs的應(yīng)用帶來風(fēng)險(xiǎn)。因此，無血清培養(yǎng)基越來越受到關(guān)注。相比起來，無血清培養(yǎng)基成分確定，批次穩(wěn)定，更容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)用中的安全性和可控性。但目前無血清培養(yǎng)基存在的普遍問題在于對原代細(xì)胞的貼壁和生長支持能力不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilicalcord mesenchymal stem cells,MSCs)的高效分離方法和培養(yǎng)方法,具有簡單易行、易于推廣實(shí)踐等優(yōu)點(diǎn)，可在最短的時(shí)間內(nèi)獲得足夠基礎(chǔ)和臨床研究用的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其是在貼壁法的基礎(chǔ)上結(jié)合MSCs培養(yǎng)基的培養(yǎng)，其包括以下步驟:
[0010]用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污；
[0011]將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時(shí)去除臍動(dòng)脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠均勻剪碎，得到華通氏膠組織塊；
[0012]用MSCs培養(yǎng)基重懸剪碎的華通氏膠組織塊，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，優(yōu)選地，上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法可以是在貼壁法的基礎(chǔ)上結(jié)合酶消化法和MSCs培養(yǎng)基的培養(yǎng)，包括以下具體步驟:
[0014](1)用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污；
[0015](2)將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時(shí)去除臍動(dòng)脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠均勻剪碎，加入膠原酶A或者膠原酶A與中性蛋白酶的混合液，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理；
[0016](3)消化處理之后，進(jìn)行離心處理并收集細(xì)胞和殘余組織，利用PBS緩沖液洗去殘留酶，再次進(jìn)行離心分離，棄去上層清液；
[0017](4)加入胰酶，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理，加入PBS緩沖液混勻，離心分離，棄去上層清液；
[0018](5)用MSCs培養(yǎng)基重懸組織和細(xì)胞，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
[0019]在上述分離方法中，優(yōu)選地，在含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液中，青霉素和鏈霉素的總質(zhì)量百分比濃度為2-5%。
[0020]在上述分離方法中，優(yōu)選地，在含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液中，青霉素的含量為100U/mL，鏈霉素的含量為0.01g/100mL。
[0021]在上述分離方法中，優(yōu)選地，在步驟(2)中，膠原酶A的濃度為lmg/mL-3mg/mL，膠原酶A的添加量為每根10-15cm臍帶添加15mL，消化處理的時(shí)間為2_4小時(shí)。
[0022]在上述分離方法中，優(yōu)選地，在步驟(2)中，膠原酶A與中性蛋白酶的混合液是由濃度為lmg/mL的膠原酶A和濃度為lmg/mL的中性蛋白酶混合得到的,膠原酶A與中性蛋白酶的體積比為1:2_1:4。
[0023]在上述分離方法中，優(yōu)選地，在步驟(4)中，胰酶的濃度為0.05%-0.25%，添加量為每10-15cm臍帶添加15mL，消化時(shí)間為10-15分鐘。
[0024]在上述分離方法中，優(yōu)選地，胰酶中添加有0.02wt%的EDTA，以胰酶的總量計(jì)。
[0025]在上述分離方法中，優(yōu)選地，各個(gè)步驟中，離心分離的轉(zhuǎn)速為1300rpm-2000rpm,時(shí)間為5-10分鐘。
[0026]在上述分離方法中，優(yōu)選地，各個(gè)步驟中，CO2培養(yǎng)箱的條件為37°C、5%C02。
[0027]在上述分離方法中，優(yōu)選地，在步驟(5)中，MSCs培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基(BPS-SFM培養(yǎng)基)，以該無血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成:
[0028]α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氫鈉 2.4g/L、L-谷氨酰胺 l_5mM、泊洛沙姆 18850_300mg/L、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10-20mg/L、重組人胰島素2-10mg/L、H印esl_5mM、β-巰基乙醇50ηΜ、脂質(zhì)0.Ι-lmg/L、微量元素l_5mg/L、谷胱甘肽0.l_5mg/L、對氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氫化可的松l-50ng/mL、維生素PP20_50mg/L、維生素C5_50mg/L、式I所示的化合物2-10 μ M、式II所示的化合物5-20 μ Μ、黃體酮10_20ng/mL、腐胺l-10mg/L、肝素1-lOIU/mL、EGFl-10ng/mL、b-FGFl-10ng/mL、HGFl-lOng/mL、VEGFl-10ng/mL ；
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其包括以下步驟: 用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污； 將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時(shí)去除臍動(dòng)脈和臍靜脈，將剝離的華通氏膠均勻剪碎，得到華通氏膠組織塊； 用MSCs培養(yǎng)基重懸剪碎的華通氏膠組織塊，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其包括以下步驟: (1)用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污； (2)將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時(shí)去除臍動(dòng)脈和臍靜脈，將剝離的華通氏膠均勻剪碎，加入膠原酶A或者膠原酶A與中性蛋白酶的混合液，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理； (3)消化處理之后，進(jìn)行離心處理并收集細(xì)胞和殘余組織，利用PBS緩沖液洗去殘留酶，再次進(jìn)行離心分離，棄去上層清液； (4)加入胰酶，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理，加入PBS緩沖液混勻，離心分離，棄去上層清液； (5)用MSCs培養(yǎng)基重懸組織和細(xì)胞，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離方法，其中，在所述含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液中，所述青霉素和鏈霉素的總質(zhì)量百分比濃度為2-5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的分離方法，其中，在所述含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液中，青霉素的含量為100U/mL，鏈霉素的含量為0.01g/100mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離方法，其中，在步驟(2)中，所述膠原酶A的濃度為Img/mL-3mg/mL，膠原酶A的添加量為每根10-15cm臍帶添加15mL，消化處理的時(shí)間為2_4小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離方法，其中，在步驟(2)中，膠原酶A與中性蛋白酶的混合液是由濃度為lmg/mL的膠原酶A和濃度為lmg/mL的中性蛋白酶混合得到的,所述膠原酶A與所述中性蛋白酶的體積比為1:2-1:4。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離方法，其中，在步驟(4)中，所述胰酶的濃度為0.05%-0.25%，添加量為每10-15cm臍帶添加15mL，消化時(shí)間為10-15分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的分離方法，其中，所述胰酶中添加有0.02wt%的EDTA，以所述胰酶的總量計(jì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離方法，其中，所述MSCs培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以所述用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氫鈉 2.4g/L、L-谷氨酰胺 l_5mM、泊洛沙姆 18850_300mg/L、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10-20mg/L、重組人胰島素2-10mg/L、H印esl_5mM、β -巰基乙醇50nM、脂質(zhì)0.1-lmg/L、微量元素l_5mg/L、谷胱甘肽0.l_5mg/L、對氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氫化可的松l-50ng/mL、維生素PP20_50mg/L、維生素C5_50mg/L、式I所示的化合物2-10 μ M、式II所示的化合物5-20 μ Μ、黃體酮10_20ng/mL、腐胺l-10mg/L、肝素l-10IU/mL、EGFl-10ng/mL、b-FGFl-10ng/mL、HGFl-10ng/mL、VEGFl-10ng/mL ；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離方法，其中，所述脂質(zhì)包括膽固醇、花生四烯酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或幾種的組合； 所述微量元素包括 Cu、Zn、Se、Fe、Sn、N1、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ga、Mg、Mn 和Ba中的一種或幾種的組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的分離方法，其中，以該無血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氫鈉2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188100mg/L、重組人白蛋白8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白20mg/L、重組人胰島素10mg/L、Hepes5mM、β-巰基乙醇50nM、膽固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕櫚酸0.26mg/L、棕櫚油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸 0.28mg/L、亞油酸 0.28mg/L、亞麻酸 0.28mg/L、Cu5nM、Se30nM、ZnlmM、Ga0.3mM、Cr5 μ M> Mg0.3mM、Mn5nM、谷胱甘肽lmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L、氫化可的松50ng/mL、維生素PP50mg/L、維生素C20mg/L、式I所示的化合物10 μ M、式II所示的化合物20 μ Μ、黃體酮15ng/mL、腐胺 10mg/L、肝素 10IU/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、HGF10ng/mL、VEGFIOng/mL0
12.根據(jù)權(quán)利要求9或11所述的分離方法，其中，以該無血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其還包括:原兒茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFl-lOng/mL、TGF-β l-10ng/mL ;優(yōu)選地，以該無血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其還包括:原兒茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-110ng/mL、GM-CSF10ng/mL、TGF-β 10ng/mL。
13.一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟: a、采用明膠對培養(yǎng)皿進(jìn)行包被處理，接種細(xì)胞前棄去明膠，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液進(jìn)行洗漆; b、將分離獲得的組織塊和細(xì)胞重懸液接種于步驟a處理后的培養(yǎng)皿中； C、待細(xì)胞生長融合至80%_90%時(shí)進(jìn)行消化傳代； 優(yōu)選地，在步驟a中，采用0.1%-0.2%的明膠對培養(yǎng)皿進(jìn)行包被，然后在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中孵育I小時(shí)或4°C孵育8-12小時(shí)。
14.一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其包括以下步驟:采用權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法對健康的新生兒臍帶組織進(jìn)行分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液； 采用權(quán)利要求13所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法對分離獲得的組織塊進(jìn)行培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N5/0775GK103589683SQ201310585147
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】趙侃, 王春有, 趙宇, 劉湘連, 李莉莉 申請人:北京東方華輝生物醫(yī)藥科技有限公司