一種用于豹紋鰓棘鱸鑒別的引物對和探針、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種用于豹紋鰓棘鱸鑒別的引物對和探針、試劑盒及檢測方法。所述引物對F289和R380，其序列分別為SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2所示的序列；所述探針P309的序列為SEQ?ID?No：3所示的序列，在探針序列的5’端連接有一個熒光報告基團(tuán)FAM，3’端連接有一個熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。本發(fā)明還保護(hù)了含有該引物對、探針的試劑盒及使用該引物對、探針或者試劑盒進(jìn)行豹紋鰓棘鱸鑒別的方法，該方法具有快速、準(zhǔn)確且靈敏的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種用于豹紋鰓棘鱸鑒別的引物對和探針、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及用于豹紋鰓棘鱸鑒別的引物對和探針、試劑盒及實(shí)時熒光PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]物種鑒定是關(guān)系食品安全、質(zhì)量、品質(zhì)和營養(yǎng)等諸多方面的重要問題。物種來源不明的食品有可能因?yàn)楹羞^敏原成分和有毒成分而帶給消費(fèi)者巨大的食品安全風(fēng)險。另外，由于不同魚種的價值差異，用廉價魚種非法替代重要經(jīng)濟(jì)價值魚種的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。一些不法商販頻頻通過錯誤標(biāo)簽、以次充好和虛假標(biāo)注等手段牟取暴利，損害消費(fèi)者的利益和健康，使得魚類食品的質(zhì)量安全問題逐漸凸現(xiàn)。歐洲委員會第104/2000條例和我國《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》都要求產(chǎn)品標(biāo)識真實(shí)屬性的專用名稱，F(xiàn)DA “水產(chǎn)品危害及控制指南”第四版(2011)要求水產(chǎn)品標(biāo)簽必須使用FDA可接受銷售魚種名錄中的名稱。因此，準(zhǔn)確、快速地鑒別魚類物種顯得尤為重要。
[0003]魚類的物種鑒定，已從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法發(fā)展到目前廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法局限性多，對于加工過的魚片、魚糜產(chǎn)品并不適用。分子生物學(xué)技術(shù)以其簡便、快速的特點(diǎn)，發(fā)展迅速。其中，實(shí)時熒光PCR技術(shù)由于具有特異性高、不需要PCR產(chǎn)物后處理、有效解決了 PCR污染問題、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為國內(nèi)外基因研究的熱點(diǎn)。
[0004]豹紋觸棘S盧{Plectropomus又稱東星斑,屬于福鰭魚綱S盧形目S盧亞目鯧科，分布于西太平洋區(qū)，包括日本南部、臺灣、澳大利亞、斐濟(jì)等海域，是名貴的海洋經(jīng)濟(jì)魚類，在中國和世界的市場需求量很大，價格昂貴。近年來隨著人們生活水平的提高和需求的不斷變化，東星斑的消費(fèi)發(fā)展極為迅猛，時有用低廉魚類冒充東星斑的現(xiàn)象發(fā)生，擾亂了東星斑的貿(mào)易市場。但是，國內(nèi)外學(xué)者對豹紋鰓棘鱸進(jìn)行物種DNA鑒定的研究很少，國內(nèi)外尚未見報道能夠快速鑒別豹紋鰓棘鱸的方法。
[0005]因此，本領(lǐng)域急需一種快速、簡單、特異地鑒別豹紋鰓棘鱸的方法來增強(qiáng)名貴石斑魚市場的技術(shù)監(jiān)管，保障水產(chǎn)品市場的規(guī)范秩序。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠快速、準(zhǔn)確且靈敏地進(jìn)行豹紋鰓棘鱸鑒別的實(shí)時熒光PCR檢測試劑盒和檢測方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于實(shí)時熒光PCR方法鑒別豹紋鰓棘鱸的引物對和探針，其特征在于，所述引物對F289和R380，其序列分別為SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所不的序列，所述探針P309的序列為SEQ ID No:3所不的序列，在探針序列的5’端連接有一個熒光報告基團(tuán)FAM，3’端連接有一個熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
[0008]一種用于實(shí)時熒光PCR方法鑒別豹紋鰓棘鱸的試劑盒，其特征在于:含有權(quán)利要求I所述引物對和探針的試劑盒。
[0009]所述引物對和探針、所述試劑盒用于鑒別豹紋鰓棘鱸的用途。
[0010]用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中所述實(shí)時熒光PCR方法為Taqman熒光探針法，其特征在于:包括用權(quán)利要求1的引物對和探針，或者權(quán)利要求2試劑盒中的引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增的步驟。
[0011]所述引物對和探針用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征在于: 從樣品中提取DNA為I旲板；
利用權(quán)利要求1的引物對和探針，或者權(quán)利要求2試劑盒中的引物對和探針，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增；
對擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，并作出判斷。
[0012]所述的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入
12.5 μ L 2XPCR Taqman 實(shí)時熒光PCR預(yù)混液，I μ L 10 μ mol/L 的上游引物F289，I μ L10 μ mol/L的下游引物R380，I μ L 10 μ mol/L的探針Ρ309，5 μ L樣品基因組DNA，4.5μ L雙蒸水。
[0013]所述的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 V 10 min ；95 V 15 s，64 V 35 s，共35個循環(huán)。
[0014]所述的結(jié)果分析并作出判斷是樣品出現(xiàn)典型的特異性擴(kuò)增曲線且Ct值小于35即判斷為檢出豹紋鰓棘鱸 。
[0015]本發(fā)明引物對和探針是通過分析已報道的豹紋鰓棘鱸線粒體細(xì)胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I，C0I)基因序列設(shè)計。
[0016]本發(fā)明的引物對和探針根據(jù)豹紋鰓棘鱸COI基因序列(Genbank序列號JF750763)和其他石斑魚 COI 序列(Genbank 序列號 JF750758、JF750759、JF750760、JF750761、JF750762、JF750764、JF750765)設(shè)計得到。
[0017]使用本發(fā)明的引物對和探針，利用實(shí)時熒光PCR方法能夠特異、靈敏地檢測出豹紋觸棘鱸。
[0018]使用本發(fā)明的引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測，實(shí)施例顯示，只有豹紋鰓棘鱸有特異性擴(kuò)增曲線，其他50種其他魚類(赤點(diǎn)石斑、云紋石斑、棕點(diǎn)石斑、點(diǎn)帶石斑、青石斑、玳瑁石斑、寬額鱸、斑鰓棘鱸、駝背鱸、二長棘鯛、黑鰭髭鯛、條石鯛、黃鰭鯛、黑鯛、橫帶髭鯛、真鯛、花尾胡椒鯛、長尾大眼鯛、圓頭平鯛、摩拉吧笛鯛、花鱸、大西洋紅鱸、大黃魚、小黃魚、黃姑魚、曲紋唇魚、多寶魚、竹莢魚、褐鯧鈾、長印魚、四指馬鲅、緣金線魚、長棘銀鱸、齒頜眶棘鱸、三線磯鱸、條紋鰈、棕斑藍(lán)子魚、短棘鯧、銀鯧、金鯧、烏鯧、棘鯧、日本單鰭電鰩、孔鰩、尖嘴魟、條紋斑竹鯊、三文魚、大口黑鱸、烏鱧、錦鯉)均無特異性擴(kuò)增。結(jié)果表明建立的實(shí)時熒光PCR方法具有良好的特異性，可用于豹紋鰓棘鱸的檢測。
[0019]使用本發(fā)明的引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測，可從豹紋鰓棘鱸含量為0.05%的樣品中成功檢測出豹紋鰓棘鱸。具有較高的靈敏度，符合日常檢測的要求。
[0020]使用本發(fā)明的引物對和探針進(jìn)行檢測，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)；本發(fā)明的實(shí)時熒光PCR檢測方法，具有高效、快速和敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。
[0021]使用本發(fā)明的引物對進(jìn)行檢測，其快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確和簡便的特點(diǎn)適合用于國內(nèi)外市場上豹紋鰓棘鱸的真?zhèn)舞b別和樣品中豹紋鰓棘鱸成分的檢測等。【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明豹紋鰓棘鱸實(shí)時熒光PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；
圖2為本發(fā)明豹紋鰓棘鱸實(shí)時熒光PCR檢測方法的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0024]實(shí)施例1:引物、探針和試劑盒的制備
1.引物對和探針的設(shè)計:根據(jù)豹紋鰓棘鱸COI基因序列(Genbank序列號JF750763)和其他石斑魚COI序列設(shè)計并合成。具體引物對序列如下:
SEQ ID No:1:5’ - GCTTCTACCTCCTTCTTTCCTC -3，
SEQ ID No:2:5， - CTGCTAGAGGAGGGTAAACTG -3，
探針序列如下:
SEQ ID No:3:5’ - TCCTCCTTCTAGCCTCATCAGGCGTT -3’ ；
在探針的5’端連接有一個熒光報告基團(tuán)FAM，3’端連接有一個熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ；
2.引物對和探針的合成和試 劑盒的制備:
根據(jù)上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物對和探針。
[0025]將上述合成好的引物對和探針分別配制成濃度為10 Mfflol/L的溶液作為試劑盒，備用。
[0026]以下實(shí)施例所述的上游引物F289即為SEQ ID No:1，下游引物R380即為SEQ IDNo:2，探針P309的序列即為SEQ ID No:3。
[0027]實(shí)施例2:實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增檢測
1.樣品基因組DNA的提取(按照QIAGEN DNeasy血液和組織DNA提取試劑盒制備樣品的基因組DNA溶液):
1)取魚的肌肉組織剪碎后，用液氮充分研磨混勻。從中取約25mg置于滅菌的1.5 mL離心管中；
2)加入180μ? ATL緩沖液和20 PL蛋白酶K，漩渦混勻，56 °C水浴約I h，并不斷搖動，直至組織完全消化；
3)加入200μ? AL緩沖液，漩渦混勻。再加入200 μ?無水乙醇，再次混勻；
4)將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至置于2mL收集管中的DNeasy Mini spin column柱中，12000 rpm離心I min，棄去收集管和管中的離心液體；
5)將spincolumn柱套在新的2 mL收集管中，加入500 ? AWl緩沖液(試劑盒所帶)，12 000 rpm離心I min，棄去收集管和管中的離心液體；
6)將spincolumn柱套在新的2 mL收集管中，加入500 ? AW2緩沖液(試劑盒所帶)，12 000 rpm離心3 min，棄去收集管和管中的離心液體；7)將spincolumn柱置于新的1.5 mL離心管中，加入100 ? 65 °C預(yù)熱的AE緩沖液(試劑盒所帶)溶解DNA，室溫靜置2 min ；
8)12 000 rpm離心2 min。離心管中的液體即為提取的樣品基因組DNA溶液。檢測DNA濃度及質(zhì)量，-20 1:保存?zhèn)溆茫?br> 2.實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增:
O實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件
以步驟I提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)；
實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入12.5 μ L 2XPCRTaqman實(shí)時突光PCR預(yù)混液[Taqman 2Χ Fast Start Universal Probe Master Mix (Rox)(Roch Applied Science) ], I μ L 10 μ mol/L 的上游引物F289,1 μ L 10 μ mol/L 的下游引物 R380，l μ L 10 ymol/L 的探針 Ρ309，5 yL 樣品基因組 DNA (5-50 ng/μ? , 4.5 μ L雙蒸水；
將樣品管放入Stratagene Μχ3005Ρ實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Agilent公司)，設(shè)置反應(yīng)條件為:95 V 10 min ；95 V 15 S，64 V 35 S，共 35 個循環(huán)；
2)實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果分析和判斷
如果樣品Ct值小于35且有典型的特異性擴(kuò)增曲線則為陽性，即樣品檢出豹紋鰓棘
魚盧;
3)用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實(shí)時熒光PCR方法的特異性確定
實(shí)驗(yàn)中所有魚樣品均來自水產(chǎn)品批發(fā)市場。取豹紋鰓棘鱸和50種其他魚類(赤點(diǎn)石斑、云紋石斑、棕點(diǎn)石斑、點(diǎn)帶石斑、青石斑、玳瑁石斑、寬額鱸、斑鰓棘鱸、駝背鱸、二長棘鯛、黑鰭髭鯛、條石鯛、黃鰭鯛、黑鯛、橫帶髭鯛、真鯛、花尾胡椒鯛、長尾大眼鯛、圓頭平鯛、摩拉吧笛鯛、花鱸、大西洋紅鱸、大黃魚、小黃魚、黃姑魚、曲紋唇魚、多寶魚、竹莢魚、褐鯧鈾、長印魚、四指馬鲅、緣金線魚、長棘銀鱸、齒頜眶棘鱸、三線磯鱸、條紋鰈、棕斑藍(lán)子魚、短棘鯧、銀鯧、金鯧、烏鯧、棘鯧、日本單鰭電鰩、孔鰩、尖嘴魟、條紋斑竹鯊、三文魚、大口黑鱸、烏鱧、錦鯉)，按上述方法分別提取基因組DNA，并進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖1所示，只有豹紋鰓棘鱸出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值為17，其他50種魚和空白對照(ddH20)均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。充分說明本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時熒光PCR方法對豹紋鰓棘鱸表現(xiàn)出較好的特異性；
4)用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實(shí)時熒光PCR方法的靈敏度確定
將豹紋鰓棘鱸的魚肉組織與花鱸的魚肉組織混合，配制成豹紋鰓棘鱸相對百分含量(w/w)為10 %、5%、1 %、0.5%、0.1 %、0.05%、0.01 %和0%的魚類組織樣品，按上述方法分別提取基因組DNA，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增。檢測結(jié)果如圖2所示。圖2中編號I一9熒光曲線對應(yīng)的樣品依次為豹紋鰓棘鱸相對百分含量100%、10 %、5%、1 %、0.5%、0.1 %、0.05%、
0.01%、0%的魚肉樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:豹紋鰓棘鱸含量分別為100%、10 %、5%、1 %、0.5%、
0.1 %、0.05%的魚肉樣品Ct值小于30，有特異性擴(kuò)增曲線，而豹紋鰓棘鱸含量為0.01%的魚肉樣品，超過34個循環(huán)才有微弱擴(kuò)增，可以忽略不計。結(jié)果表明建立的實(shí)時熒光PCR方法可從豹紋鰓棘鱸含量為0.05 %的魚肉樣品中成功檢測出豹紋鰓棘鱸。具有較高的靈敏度，符合日常檢測的要求。
[0028]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種用于實(shí)時熒光PCR方法鑒別豹紋鰓棘鱸的引物對和探針，其特征在于，所述引物對F289和R380，其序列分別為SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的序列，所述探針P309的序列為SEQ ID No:3所示的序列，在探針序列的5’端連接有一個熒光報告基團(tuán)FAM，3’端連接有一個熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
2.一種用于實(shí)時熒光PCR方法鑒別豹紋鰓棘鱸的試劑盒，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述引物對和探針的試劑盒。
3.權(quán)利要求1的引物對和探針、權(quán)利要求2的試劑盒用于鑒別豹紋鰓棘鱸的用途。
4.用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中所述實(shí)時熒光PCR方法為Taqman熒光探針法，其特征在于:包括用權(quán)利要求1的引物對和探針，或者權(quán)利要求2試劑盒中的引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增的步驟。
5.權(quán)利要求4所述的用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征在于: 從樣品中提取DNA為I旲板； 利用權(quán)利要求1的引物對和探針，或者權(quán)利要求2試劑盒中的引物對和探針，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增； 對擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，并作出判斷。
6.權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于:所述的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入12.5 μ L 2 X PCR Taqman實(shí)時熒光PCR預(yù)混液，IUL 10 ymol/L 的上游引物 F289，l μ L 10 μ mol/L 的下游引物 R380，I μ L 10 μ mol/L的探針Ρ309，5 μ L樣品基因組DNA，4.5 μ L雙蒸水。
7.權(quán)利 要求4或5所述方法，其特征在于:所述的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:950C 10 min ；95 °C 15 s，64 °C 35 s，共 35 個循環(huán)。
8.權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于:所述的結(jié)果分析并作出判斷是樣品出現(xiàn)典型的特異性擴(kuò)增曲線且Ct值小于35即判斷為檢出豹紋鰓棘鱸。
【文檔編號】C12N15/11GK103589802SQ201310585155
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】陳雙雅, 張永祥, 李宏, 王嘉鶴, 陳偉玲, 周昱 申請人:陳雙雅