用于人間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新型的用于人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）的培養(yǎng)基。更具體地，本發(fā)明涉及其中hMSC細(xì)胞系能夠生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，包括在通常用于這類細(xì)胞的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的那些細(xì)胞系。所述用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基包括通常用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；人白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物（血沉棕黃層）；胰島素；亞硒酸鈉；乙醇胺；以及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）。
【專利說(shuō)明】用于人間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的新型培養(yǎng)基。更具體地，本發(fā)明涉及其中hMSC細(xì)胞系能夠生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，包括因?yàn)橐呀?jīng)適應(yīng)了特定培養(yǎng)基在通常用于這類細(xì)胞的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的那些細(xì)胞系。
【背景技術(shù)】
[0002]hMSC是多能細(xì)胞，根本特征在于它們能夠分化成多種間充質(zhì)組織，如骨、軟骨、腱、肌肉和脂肪組織等。hMSC可以從成人體內(nèi)的多種組織中分離，包括可以在骨髓、脂肪組織和臍帶血中發(fā)現(xiàn)的那些hMSC。
[0003]hMSC的抗增殖、免疫調(diào)節(jié)和消炎的作用已經(jīng)將注意力集中在這些細(xì)胞上，作為由免疫系統(tǒng)引起的疾病(包括移植物抗宿主病、實(shí)體器官移植后排斥和自身免疫疾病)的潛在治療劑。
[0004]眾所周知，對(duì)于hMSC的體外培養(yǎng)來(lái)說(shuō)需要保持其多能性，并且為此需要向普通培養(yǎng)基中加入外源因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF β -1)。然而，多數(shù)hMSC依賴于特定的培養(yǎng)基，并且不能在通常用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基上(如 適用于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCQ)的補(bǔ)充有胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服這些問(wèn)題，本發(fā)明涉及用于hMSC的新型培養(yǎng)基，在其上可以使在其他培養(yǎng)基配制物中不生長(zhǎng)的hMSC進(jìn)行生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基包括:
[0006]a)通常用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基
[0007]b)人白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物(血沉棕黃層；LBC)
[0008]c)胰島素
[0009]d)亞硒酸鈉
[0010]e)乙醇胺
[0011]f)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)
[0012]如在本文件中使用的，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”是指用于細(xì)胞培養(yǎng)、生長(zhǎng)或增殖的營(yíng)養(yǎng)溶液。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)”是指在人造的體外環(huán)境中維持、培養(yǎng)或生長(zhǎng)的細(xì)胞。
[0013]在本文件中使用的術(shù)語(yǔ)“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”是指其中當(dāng)補(bǔ)充有不同補(bǔ)充物時(shí)人間充質(zhì)細(xì)胞可以生長(zhǎng)的任何培養(yǎng)基，補(bǔ)充物可以包含血清或不包含血清?；A(chǔ)培養(yǎng)基提供標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)鹽如鋅、鐵、鎂、鈣和鉀，以及維生素、葡萄糖、緩沖體系和必需氨基酸。
[0014]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明通常用于培養(yǎng)基中間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM/F12+丙酮酸鹽(DMEM/F12培養(yǎng)基是相同份數(shù)的Dubelcco改良Eagle培養(yǎng)基(Dubelcco’ sModified Eagle Medium,DMEM)(其是由Harry Eagle開(kāi)發(fā)的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基的改進(jìn)物)和Ham’s F12 (其由Ham開(kāi)發(fā)用于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO )細(xì)胞的生長(zhǎng))培養(yǎng)基的混合物)、Ham’ s F10、Ham’ s F12、MCDB131 (由Knedler和Ham開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)基，作為具有減少的血清補(bǔ)充物用于人細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基)、或RPMI1640 (其名字來(lái)源于RoswellPark Memorial Institute的首字母,其中它由Moore及其同事開(kāi)發(fā),用于正常淋巴細(xì)胞和腫瘤性淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，盡管當(dāng)適量補(bǔ)充時(shí)它也可以使其他不同類型的細(xì)胞生長(zhǎng))。這些培養(yǎng)基的配制物和組合物廣為人知并且可以從任何生產(chǎn)商和供應(yīng)商處獲得，例如Gibc0(LifeTechnologies)。更優(yōu)選地，培養(yǎng)基是DMEM/F12+丙酮酸鹽。
[0015]根據(jù)本發(fā)明用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基的一種成分是白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物。白細(xì)胞/血小板層，也稱為“血沉棕黃層”，是全血離心或沉降后在血漿和紅細(xì)胞之間觀察到的層。它基本上包括白細(xì)胞和血小板。白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物(血沉棕黃層)以5%至20% (v/v)、更優(yōu)選7%至15% (v/v)、并且最優(yōu)選10% (v/v)的量存在于根據(jù)本發(fā)明的培
養(yǎng)基中。
[0016]根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)基的另一種成分是胰島素。胰島素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的有益作用是已知的(Cartwright, T.y Shah, G.P Culture media.Basic cell culture, 2ndedition, Davis, J.M.ed.2002.0xford University Press, New York, USA)。膜島素優(yōu)選以2mg/L至20mg/L、更優(yōu)選5mg/L至15mg/L并且最優(yōu)選lOmg/L的量存在于根據(jù)本發(fā)明的培
養(yǎng)基中。 [0017]此外，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基的另一種成分是以亞硒酸鈉形式存在的硒。硒是痕量元素，通常由血清提供給培養(yǎng)基，并且對(duì)培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)是必需的。亞硒酸鈉以0.005至
1.730mg/L的量存在于培養(yǎng)基中。
[0018]進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基包括乙醇胺。眾所周知，乙醇胺促進(jìn)細(xì)胞膜的構(gòu)建。在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中的乙醇胺以lmg/L至8mg/L、優(yōu)選2mg/L至5mg/L的量存在。
[0019]最后，根據(jù)本發(fā)明用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基還包括bFGF。眾所周知，bFGF推薦用于培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞(Sato, J.et al.Specific cell types and their requirements.Basic cell culture, 2nd edition, Davis, J.M.ed.2002.0xford University Press, NewYork, USA)。bFGF以5ng/L至25ng/L的量存在于根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中。
[0020]出乎意料的是，通過(guò)在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中成分的組合，培養(yǎng)人間充質(zhì)細(xì)胞系是可能的，包括適應(yīng)通常可商購(gòu)的其他培養(yǎng)基的那些細(xì)胞系，它們不能在通常用于這類細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)，例如由Lonza或PromoCell提供的人間充質(zhì)細(xì)胞。
[0021]可選地，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基包括抗生素。可以使用通常用于培養(yǎng)這類細(xì)胞的任何抗生素。優(yōu)選地，該抗生素是慶大霉素/兩性霉素的混合物。需用于培養(yǎng)基的抗生素的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
[0022]對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，需要為根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基補(bǔ)充，例如胎牛血清(FBS)或源自人血漿的細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物(CCS)，例如依照美國(guó)專利US8，252，590B2中描述獲得的。如果使用FBS，則認(rèn)為10%至20% (v/v)的量是足夠的。另一方面，如果使用CCS來(lái)補(bǔ)充根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基，則認(rèn)為10%至40% (v/v)的量是足夠的。
[0023]根據(jù)本發(fā)明用于人間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是干燥形式或液體形式。對(duì)于以干燥形式使用來(lái)說(shuō)，它的成分可以在合適的液體中溶解，用于培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，其中可以溶解根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基成分的液體類型是眾所周知的，例如滅菌蒸餾水。
[0024]以下通過(guò)參考多個(gè)【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步詳細(xì)地描述了本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例并不旨在限制本發(fā)明的范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例
[0026]實(shí)施例1
[0027]制備了根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基，包含作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的DMEM/F12+丙酮酸鹽、10%(v/v)的人白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物(血沉棕黃層)、10mg/L的胰島素、0.0067mg/L的亞硒酸鈉、2mg/L乙醇胺以及20ng/mL的bFGF。這種培養(yǎng)基稱為L(zhǎng)V2。培養(yǎng)基LV2單獨(dú)使用，或補(bǔ)充有10% (v/v)的適用于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCQ)的胎牛血清(FBS)或補(bǔ)充有15% (v/V)的源自人血衆(zhòng)的細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物(CCS)。培養(yǎng)了可以由Lonza (Basel, Switzerland)或PromoCell (Heidelberg, Germany)商購(gòu)的hMSC。使用由制造商推薦的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照。僅一種可商購(gòu)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示在表1中。
【權(quán)利要求】
1.一種用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于它包括: a)通常用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基； b)人白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物(血沉棕黃層); c)胰島素； d)亞硒酸鈉； e)乙醇胺；以及 f)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基是 DMEM/F12+丙酮酸鹽、Ham’ s F10、Ham’ s F12、MCDB131 或 RPMI1640。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述人白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物(血沉棕黃層)以5%至20% (v/v)的量存在于所述培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述人白細(xì)胞/血小板層溶解產(chǎn)物(血沉棕黃層)以7%至15% (v/v)的量存在于所述培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述胰島素以2mg/L至20mg/L的量存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述胰島素以5mg/L至15mg/L的量存在。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述亞硒酸鈉以0.005mg/L至1.730mg/L的量存在。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述乙醇胺以lmg/L至8mg/L的量存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述乙醇胺以2mg/L至5mg/L的量存在。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述bFGF以5ng/L至25ng/L的量存在。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于它進(jìn)一步包括抗生素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述抗生素是慶大霉素/兩性霉素的混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基以10%至20% (v/v)的量補(bǔ)充有胎牛血清(FBS)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的用于人間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基以10%至40% (v/v)的量補(bǔ)充有源自人血漿的細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物(CCS)。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK103805561SQ201310553617
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月13日
【發(fā)明者】喬斯·瑪麗亞·迭斯塞萬(wàn)提斯, 羅德里戈·加哈爾多羅德里格斯 申請(qǐng)人:基立福有限公司