動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法。多重Taqman-MGB探針實時熒光PCR方法可對流產(chǎn)嗜衣原體（Ch.abortus）、家畜嗜衣原體(Ch.pecorum)、鸚鵡熱嗜衣原體（Ch.psittaci）進行快速檢測。本檢測方法以三種衣原體靶序列MOMP的保守區(qū)域為基礎(chǔ)，設(shè)計3對引物和3條Taqman-MGB探針。本發(fā)明只需要兩步法擴增法及簡單的反應(yīng)條件就可以快速、高效、特異性、高靈敏度地檢測目的靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，對操作人員沒有技術(shù)上的要求，檢測成本低，檢測時間短?？杀苊庖蜻M行瓊脂糖電泳而可能造成的交叉污染，從而提高檢測的準確率和可信度。
【專利說明】動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物分子生物學(xué)檢驗方法及檢驗試劑領(lǐng)域，具體涉及一種動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動物衣原體病ipilamydiosis)是由各類衣原體{Chlamydia)感染哺乳動物、禽類等動物所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行，常造成很大危害及經(jīng)濟損失。衣原體科的最新分類研究表明，衣原體科分為衣原體屬{Chlamydia )和嗜衣原體屬iChlamydophila)，包括沙眼衣原本{ChlamydiatracAoffiaiis)、豬源衣原體{Chlamydia Swi1S)、鼠沙眼衣原體OiuridarumsKH產(chǎn)嗜衣原體 iChlamydophila aAoriws)、貓嗜衣原體{Chlamydophilafelis~)、家畜靖灰盾、體 ipilamydophila pecorum)、肺炎衣原體{Chlamydophila pneumoniae)和鶴踏熱衣原體{Chlamydophila psittaci)。動物衣原體病中嬰I踏熱衣原體病和流產(chǎn)衣原體病被國際動物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties, 0IE)列為 B 類疾病,
我國農(nóng)業(yè)部動物疫病分類方法(1999-02-12)將衣原體病歸為三類動物病原微生物。根據(jù)OIE《陸生動物手冊》相關(guān)規(guī)定:進出口來自于衣原體疫區(qū)或國家的相關(guān)動物及其產(chǎn)品須獸醫(yī)主管部門出具相關(guān)證明，嚴格限制，這極大的影響畜牧業(yè)和國際貿(mào)易的發(fā)展。同時由于部分衣原體病屬于人獸共患傳染病，在公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域尤其畜牧從業(yè)人員、醫(yī)護人員等影響較大，為此對衣原體的檢測，顯得十分必要。為了方便對進出口的肉質(zhì)產(chǎn)品進行檢驗，減小人類和動物感染衣原體的可能性，對衣原體的檢測顯得尤為重要。
[0003]TaqMan探針是一種募核昔酸探針，突光基團鏈接在探針的5’末端,洋滅基團則在3，端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就會伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷的積累。因此TaqMan探針檢測的是積累熒光。目前，水解探針已被用于基因檢測、病毒定量、癌細胞基因微突變檢測、細胞因子基因定量等，其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性。
[0004]TaqMan — MGB探針是近年來的一種新型探針，它的淬滅基團是一種非熒光的淬滅基團，本身不會發(fā)生熒光，這樣就降低了 PCR反應(yīng)熒光本底信號的強度，進一步提高了其敏感性。
[0005]中國發(fā)明專利(申請?zhí)枮?200910103457.4、200910094278、200480005196.8、201310009019.8、20 1 1800 I 5 187.7、20 11 10143186.2、20 1 1 10279330.5、200910200396.3,200910200393.X ,200910094272.1,200910094279.3 等)分別公開了采
用熒光定量PCR擴增技術(shù)檢測病菌和動物疫病的方法。但是，目前尚無利用TaqMan — MGB探針熒光定量PCR擴增技術(shù)檢測三種衣原體分型的試劑盒及檢測方法的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的是提供一種三種衣原體(流產(chǎn)嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體)TaqMan — MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物，第二個目的是提供使用該引物的試劑盒，第三個目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒對進出口的肉質(zhì)產(chǎn)品進行檢驗的檢測方法。
[0007]為了實現(xiàn)上述第一目的本發(fā)明米用的技術(shù)方案是:一種動物衣原體Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物，包括流產(chǎn)嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ IDN0.1 ;流產(chǎn)嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ;流產(chǎn)嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為 SEQ ID N0.3。
[0008]家畜嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.4 ;家畜嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.5 ;家畜嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.6。
[0009]鸚鵡熱衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.7 ;鸚鵡熱衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.8 ;鸚鵡熱衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.9。
[0010]為了實現(xiàn)本發(fā)明的第二目的采用的技術(shù)方案是:動物衣原體Taqman — MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，它包括擴增反應(yīng)液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中:
所述擴增反應(yīng)液管，管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:
DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的流產(chǎn)嗜衣原體上游引物0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的流產(chǎn)嗜衣原體下游引物0.4 μ L ;` DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的流產(chǎn)嗜衣原體MGB探針0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.4的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.5的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.6的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體MGB探針0.1 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.7的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.8的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.9的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體MGB探針0.2 μ L ;
2X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ;
滅菌去離子水3.9μ L ;
合計17 μ L,為單次反應(yīng)的用量；
所述陽性對照管，管內(nèi)為所述流產(chǎn)嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體三種衣原體的陽性重組質(zhì)粒的混合DNA，體積為20 μ L ;
所述陰性對照管，管內(nèi)為無所述三種衣原體感染的上皮組織基因組DNA，體積為20 μ L ；
所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
[0011]上述三種探針，流產(chǎn)嗜衣原體MGB探針、家畜嗜衣原體MGB探針和鸚鵡熱衣原體MGB探針的5’端分別標記有報告基團NED、FAM和VIC，它們的3’端標記有非淬滅基團。
[0012]為了實現(xiàn)上述第三目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法，包括如下步驟:I)制備待檢模板DNA:選用市售化的細胞培養(yǎng)液DNA提取試劑盒，提取待檢樣品中DNA，獲得待檢模板
DNA ；
2)擴增反應(yīng)體系為:17μ L擴增反應(yīng)液；3 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L;
3)三種衣原體熒光定量PCR擴增:將配制好的步驟2)中的擴增反應(yīng)體系進行PCR管反應(yīng)，條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 58 °C 30s~34s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環(huán)；在58°C 30s進行熒光信號的采集；
4)結(jié)果判定:將擴增反應(yīng)在35個循環(huán)以內(nèi)及擴增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0013]本發(fā)明的原理是:針對三種衣原體1000bp左右的靶序列上MOMP保守區(qū)域分別設(shè)計3對引物和3條MGB探針，利用探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合的位點在兩條引物之間。三條探針的5’端標記有報告基團分別為FAM、VIC、NED，3’端標記有非淬滅基團，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本低信號的強度。同時探針上還連接有MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，可以將MGB探針設(shè)計的更短，既降低了合成車成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。這種實驗方法所使用的儀器比較簡單，同時克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本等缺點、此外，該檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實際操作極為簡單，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。
[0014]TaqMan—MGB探針熒光定量PCR擴增技術(shù)是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增方法。將此基因擴增技術(shù)與普通PCR或普通的TaqMan探針技術(shù)進行比較，可發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上優(yōu)于上面的技術(shù)，且不依賴于任何專門的儀器設(shè)備即可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。現(xiàn)有的豬衣原體的檢測周期較長，約I天，操作繁瑣，而本發(fā)明的試劑盒僅需50min左右。`
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點是(I)、不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)、高特異性:應(yīng)用MOMP的保守區(qū)段，3對引物及3條MGB探針，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標物質(zhì)的存在與否，陽性率可達于99.2%，假陽性率小于0.2% ; (3)、快速、高效擴增:檢測時間50min左右；(4)、靈敏度高--最低檢測極限達分別達到2.02X10拷貝/ μ L，3.08拷貝/ μ L，1.6X 10拷貝/ μ L。標本的檢出率達到98.8%; (5)、鑒定簡便:通過最后的擴增曲線就可以進行結(jié)果的精確的，無需電泳等其他任何分析步驟；(6)、用途:可用于三種衣原體及其相關(guān)產(chǎn)品的快速檢測及分型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為特異性試驗結(jié)果；
圖2為流產(chǎn)嗜衣原體的靈敏度試驗結(jié)果；
圖3為家畜嗜衣原體的靈敏度試驗結(jié)果；
圖4為鸚鵡熱衣原體的靈敏度試驗結(jié)果；
圖5為穩(wěn)定性試驗結(jié)果；
圖6為家畜嗜衣原體標準曲線；
圖7為流產(chǎn)嗜衣原體標準曲線；
圖8為鸚鵡熱衣原體標準曲線；圖9為三種衣原體同時擴增的標準曲線；
圖1中:分別采用了家畜嗜衣原體菌株VR-1575，肺炎衣原體菌株53592，流產(chǎn)嗜衣原體菌株VR-656，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對照。
【具體實施方式】
[0017]實施例1，引物的設(shè)計及篩選 三種衣原體(包括流產(chǎn)嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體)熒光定量PCR擴增引物及探針，其設(shè)計是根據(jù)GenBank公布的三種衣原體MOMP基因的參考序列，用MEGA5進行比對，分析序列并在其保守區(qū)域進行引物與探針的設(shè)計。采用探針設(shè)計軟件PrimerExpress 3.0，設(shè)計12套熒光定量引物，由英駿(上海)有限公司合成，利用ABI 7500 FASTPCR儀對反應(yīng)進程中的擴增情況進行實時監(jiān)控，對不同引物組及探針擴增的起始時間、進入最大擴增速率的時間、最大擴增速率及達到平臺期所需時間等參數(shù)進行分析，篩選出擴增速率最高、特異性好的三組熒光定量PCR擴增引物與探針，分別標記為SEQ ID N0.1~SEQID N0.9，其中引物與探針的的濃度均為10 ymol/L。同時，利用PCR引物軟件設(shè)計陽性重組質(zhì)粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分別為:PCR上游引物:SEQ ID N0.10 ;PCR下游引物:SEQ ID N0.11 ;它們的體積比為1:1。
[0018]SEQ ID N0.1 代表的序列為:5’ -GCATGGGTGCAGTTCCTACA-3’
SEQ ID N0.2 代表的序列為:5’ -TGGGTCTATCCGTAGGAGTTTTG-3’
SEQ ID N0.3 代表的序列為:5’ NED-ACCGCAGCAGCTAA-MGB3’
SEQ ID N0.4 代表的序列為:5’ -GCAGAGCCAAGTTTATTAATTG-3’。
[0019]SEQ ID N0.5 代表的序列為:5’ -TAGCGCAAGGATCACATG-3’
SEQ ID N0.6 代表的序列為:5’ FAM-ACCGCAGCAGCTAA-MGB3’
SEQ ID N0.7 代表的序列為:5’ -GCAACTCCTACGCAGGCTACA-3’
SEQ ID N0.8 代表的序列為:5’ -TCGGTCTGCCATTTGCTTCT-3’
SEQ ID N0.9 代表的序列為:5’ VIC-AACGCAAGTAATACTAATCA-MGB3’
SEQ ID N0.10 代表的序列為:5’ -CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’。
[0020]SEQ ID N0.11 代表的序列為:5’ -GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’
實施例2，陽性對照品的制備
用試劑盒提取流產(chǎn)嗜衣原體細胞培養(yǎng)物的核酸，將其核酸進行PCR及電泳鑒定，采用PCR上游引物SEQ ID N0.10和PCR下游引物SEQ ID N0.11按照常規(guī)PCR擴增方法進行擴增，并使用膠回收試劑盒回收擴增的條帶。按照1:10的比例和PMD19T載體進行連接反應(yīng)，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5 α菌，經(jīng)抗性選擇和PCR鑒定陽性后，再測序驗證，利用分光光度計測定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8^2.0之間。獲得流產(chǎn)嗜衣原體陽性重組質(zhì)粒DNA。按照上述方法制備家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體陽性重組質(zhì)粒DNA。將三種陽性重組質(zhì)粒按照1:1:1的體積比例混合。
[0021 ] 實施例3，陰性對照品的制備
用試劑盒提取無上述三種衣原體的上皮組織的DNA，進行PCR及電泳鑒定。
[0022]實施例4，三種衣原體熒光定量PCR擴增快速檢測方法:包括如下步驟:O制備待檢模板DNA:選用商品化的DNA提取試劑盒，提取樣品中的DNA，獲得待檢模
板 DNA ；
2)擴增反應(yīng)體系為:17μ L擴增反應(yīng)液；3 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L;
3)三種衣原體熒光定量PCR擴增:將配制好的步驟2)的擴增反應(yīng)體系進行PCR管反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環(huán)；在58°C 30s進行熒光信號的采集。
[0023]4)結(jié)果判定:將擴增反應(yīng)在35個循環(huán)以內(nèi)及擴增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0024]實施例5，三種衣原體熒光定量PCR擴增的特異性試驗
采用實施例4的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行特異性的試驗，所采用的模板分別是家畜嗜衣原體菌株VR-1575，肺炎衣原體菌株53592，流產(chǎn)嗜衣原體菌株VR-656，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123,貓衣原體，陰性對照。本方法為多重PCR方法，可以同時擴增出三種不同的衣原體，參見圖1的結(jié)果顯示，圖中三條曲線分別表示家畜嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、鸚鵡熱衣原體。
[0025]實施例6，三種衣原體熒光定量PCR擴增的靈敏度試驗
將所建立的三種陽性重組質(zhì)粒標準品分別進行10倍倍比稀釋，采用實施例4的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行靈敏度試驗，結(jié)果顯示出，建立的該方法最低能夠檢測出分別為:流產(chǎn)嗜衣原體為2.02X10拷貝/ μ L，家畜嗜衣原體為3.08拷貝/ μ L，鸚鵡熱衣原體1.6 X 10拷貝/ UL的DNA樣品。`
[0026]結(jié)果如圖2、3、4所示:圖2表示中從左到右表示的濃度分別是:2.02Χ106拷貝/ μ L、2.02Χ105 拷貝 / μ L、2.02X 104 拷貝 / μ L、2.02X IO3 拷貝 / yL、2.02X 102 拷貝/ yLd.C^XlO1拷貝/ 1^、2.02父10°拷貝/ μ L ;圖3表示家畜嗜衣原體的靈敏度，從左到右表示的濃度分別是:3.08 X IO6拷貝/ μ L、3.08 X IO5拷貝/ μ L、3.08 X IO4拷貝/ μ L、3.08X 103 拷貝 / μ L、3.08X 102 拷貝 / μ L、3.08X IO1 拷貝 / μ L、3.08X 10?？截? μ L ;圖4表示鸚鵡熱衣原體的靈敏度，從左到右表示的濃度分別是:1.6XIO6拷貝/ μ L、1.6 X IO5 拷貝 / μ L、1.6 X IO4 拷貝 / μ L、1.6 X IO3 拷貝 / μ L、1.6 X IO2 拷貝 / μ L、1.6 XlOlfW/ μ L、1.6Χ10° 拷貝 / μ L。
[0027]實施例7，三種衣原體熒光定量PCR擴增的重復(fù)性試驗
以重組質(zhì)粒標準品(三種衣原體的混合重組質(zhì)粒)1.7 X IO6拷貝/ μ L與1.7 X IO7拷貝/μ L為模板，采用實施例4的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行重復(fù)性試驗，組內(nèi)與組間重復(fù)試驗變異系數(shù)為0.595%~1.642%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。參見圖5的結(jié)果顯示。
[0028]實施例8，三種衣原體熒光定量PCR擴增的標準曲線的建立
把三種衣原體的混合重組質(zhì)粒標準品進行五個倍比稀釋，進行標準曲線的制作，以熒光強度的對數(shù)值為橫坐標，循環(huán)數(shù)為縱坐標作圖，得到標準曲線，相關(guān)系數(shù)都為R2=0.999，擴增效率分別達到:家畜嗜衣原體CL pecorum 99.5 % ;鸚鵡熱衣原體CL Psi ttaci103.2% ;流產(chǎn)嗜衣原體CA abortus 103.2% ;其擴增方程分別為:家畜嗜衣原體(CApecorum) Y= - 3.34x+38.80,嬰I踏熱衣原體{Ch.psittaci) Y= - 3.25x+40.36,流產(chǎn)嗜衣原體(^?.abortus) Y= - 3.24x+38.51。由此可見本實驗所建立的標準曲線的擴增效率是較好，其熒光曲線與所檢測的靶基因濃度之間的相關(guān)性較好，準確度較高。參見圖6、7、8、9的結(jié)果顯示。
【權(quán)利要求】
1.一種動物衣原體Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物，其特征在于:包括流產(chǎn)嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1 ； 流產(chǎn)嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ； 流產(chǎn)嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.3 ； 家畜嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.4 ； 家畜嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.5 ； 家畜嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.6 ； 鸚鵡熱衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.7 ； 鸚鵡熱衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.8 ； 鸚鵡熱衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.9。
2.動物衣原體Taqman— MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:它包括擴增反應(yīng)液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中: 所述擴增反應(yīng)液管，管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成: DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的流產(chǎn)嗜衣原體上游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的流產(chǎn)嗜衣原體下游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的流產(chǎn)嗜衣原體MGB探針0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.4的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.5的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.6的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體MGB探針0.1 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.7的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.8的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.9的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體MGB探針0.2 μ L ;
2 X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ; 滅菌去離子水3.9μ L ; 合計17 μ L,為單次反應(yīng)的用量； 所述陽性對照管，管內(nèi)為所述流產(chǎn)嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體三種衣原體的陽性重組質(zhì)粒的混合DNA，體積為20 μ L ; 所述陰性對照管，管內(nèi)為無所述三種衣原體感染的上皮組織基因組DNA，體積為20 μ L ； 所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述動物衣原體Taqman— MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:所述流產(chǎn)嗜衣原體MGB探針、家畜嗜衣原體MGB探針和鸚鵡熱衣原體MGB探針的5’端分別標記有報告基團NED、FAM和VIC，它們的3’端標記有非淬滅基團。
4.利用權(quán)利要求2所述試劑盒進行動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法，包括如下步驟:其中所述動物衣原體包括流產(chǎn)嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體； 1)制備待檢模板DNA:選用市 售化的細胞培養(yǎng)液DNA提取試劑盒，提取待檢樣品中DNA，獲得待檢模板DNA ； 2)擴增反應(yīng)體系為:17μ L擴增反應(yīng)液；3 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L; 3)三種衣原體熒光定量PCR擴增:將配制好的步驟2)中的擴增反應(yīng)體系進行PCR管反應(yīng)，條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s~34s 40個循環(huán)；在58°C 30s進行熒光信號的采集； 4)結(jié)果判定:將擴增反應(yīng)在35個循環(huán)以內(nèi)及擴增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
【文檔編號】C12Q1/04GK103555842SQ201310540233
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】聶福平, 王昱, 李應(yīng)國, 楊俊 , 肖進文, 袁曾壯, 王國民, 李賢良 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心