一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，要解決的技術(shù)問題是抗菌肽生產(chǎn)成本高，效率低，本發(fā)明為解決上述問題，提供一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，節(jié)約了成本，提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明采用牛骨蛋白胨作為原料，牛骨蛋白胨每噸一萬多，大大降低了成本，并且培養(yǎng)周期短，提高了培養(yǎng)效率，發(fā)酵培養(yǎng)PH值范圍放寬了，便于操作控制。
【專利說明】一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，這類活性多肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點，抗菌肽對細(xì)菌有很強的殺傷作用，尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視。除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細(xì)胞等有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合過程，抗菌肽的廣泛的生物學(xué)活性顯示了其在醫(yī)學(xué)上良好的應(yīng)用前景，其應(yīng)用價值很大。
[0003]目前發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽一般利用植物蛋白胨作為培養(yǎng)基原料，植物蛋白胨價格比較貴,每噸4萬多，成本高，原來發(fā)酵溫度為36-37°C恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵周期需要32小時，生產(chǎn)效率低，并且PH范圍小，只能控制在5.4-5.6之間，不易操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對上述抗菌肽生產(chǎn)成本高，效率低的問題，提供一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，節(jié)約了成本，提高了生產(chǎn)效率。
[0005]本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
(1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制IL培養(yǎng)基，平均分裝與10個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1:80?120，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為180?220rpm/min，溫度30?34°C，培養(yǎng)時間8?12小時；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨8?12g 酵母提取物3?7g 食鹽3?7g
用蒸餾水定容至1L，高壓來菌制得枯草桿菌菌種；
(2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至30-34°C，采用枯草桿菌菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種與培養(yǎng)基比例為0.2:6?7，PH5.2?6.0，溫度30_34°C，攪拌速度為180?220rpm/min，整體發(fā)酵時間為16?20小時，在發(fā)酵過程中，每2小時取樣檢測，12小時后補加第一步培養(yǎng)基，加入量為第2步的枯草桿菌菌種和第2步培養(yǎng)基總體積量的10?20%,顯微鏡下檢測菌體數(shù)量較多，大小均勻，沒有其他雜菌生長，合格后得到含有抗菌肽的發(fā)酵物，培養(yǎng)基配方為:
玉米:2?4%
豆栢:I?3%
牛骨蛋白胨:0.5?1.5%
硫酸銨:0.5?1.5%
葡萄糖:0.1?0.5% 磷酸二氫鉀:0.2?0.4%
麥芽糖:0.5?1.5%
消泡劑:0.015 ?0.025%。
[0006]上述抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
(1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制IL培養(yǎng)基，平均分裝與10個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1:100，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為200rpm/min，溫度30_34°C，培養(yǎng)時間10小時；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨1g 酵母提取物5g 食鹽5g
用蒸餾水定容至1L，高壓來菌制得枯草桿菌菌種；
(2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至30-34°C，采用枯草桿菌菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種與培養(yǎng)基比例為0.2:7，PH5.2-6.0，溫度30_34°C，攪拌速度為200rpm/min,整體發(fā)酵時間為16-20小時，在發(fā)酵過程中，每2小時取樣檢測，12小時后補加第一步培養(yǎng)基，加入量為第2步的枯草桿菌菌種和第2步培養(yǎng)基總體積量的10-20%，顯微鏡下檢測菌體數(shù)量較多，大小均勻，沒有其他雜菌生長，合格后得到含有抗菌肽的發(fā)酵物，培養(yǎng)基配方為:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸銨:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氫鉀:0.3%
麥芽糖:1%
消泡劑:0.02%。
[0007]本發(fā)明采用牛骨蛋白胨作為原料，牛骨蛋白胨每噸一萬多，大大降低了成本，并且培養(yǎng)周期短，提高了培養(yǎng)效率，發(fā)酵培養(yǎng)PH值范圍放寬了，便于操作控制。

【具體實施方式】
[0008]實施例1
一次1L發(fā)酵罐的抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)
(1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制200mL培養(yǎng)基，平均分裝與3個500ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1:80，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為200rpm/min，30°C培養(yǎng)10小時；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨2g 酵母提取物Ig 食鹽Ig
用蒸餾水定容至200ml，高壓滅菌備用；
(2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至32°C，移種量1:35，PH5.2-6.0，溫度32°C，攪拌速度為200rpm/min，每2小時取樣檢測，接種后10時補料，整體發(fā)酵時間為16-24小時，顯微鏡檢測菌體數(shù)量多，大小均已，沒有其他雜菌生長，合格后放罐用，培養(yǎng)基配方為:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸銨:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氫鉀:0.3%
麥芽糖:1%
消泡劑:0.02%。
[0009]實施例2
一次Im3發(fā)酵罐的抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)
(1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制3L培養(yǎng)基，平均分裝與20個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量1:500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為200rpm/min，34°C培養(yǎng)10小時，檢測合格后得菌種，待用；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨30g 酵母提取物15g 食鹽15g
用蒸餾水定容至31，高壓滅菌備用；
(2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至33°C，移種量1:35，PH5.2-6.0，溫度33°C，攪拌速度為200rpm/min，每2小時取樣檢測，接種后10小時補料，整體發(fā)酵時間為16-24小時，顯微鏡檢測菌體數(shù)量多，大小均已，沒有其他雜菌生長，合格后放罐用，培養(yǎng)基配方為:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸銨:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氫鉀:0.3%
麥芽糖:1%
消泡劑:0.02%。
[0010]實施例3
一次30m3發(fā)酵罐的抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)
(I)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制1.5L培養(yǎng)基，平均分裝與20個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量1:500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為200rpm/min，32°C培養(yǎng)10小時，檢驗合格后的菌種，待用；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨15g 酵母提取物7.5g 食鹽7.5g
用蒸餾水定容至1.51，高壓滅菌備用；
(2)、種子罐培養(yǎng):按照配方配制300L培養(yǎng)基，高溫滅菌降至31°C，然后接種，接種量1:200, PH5.2-6.0，溫度31 °C，攪拌速度為35-40 rpm/min，每2小時取樣檢測一次，生長時間為12小時,顯微鏡檢測菌體數(shù)量多,大小均一,沒有其他雜菌生長,培養(yǎng)基配方為:玉米面:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸銨:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氫鉀:0.3%
消泡劑:0.02%。
[0011](3)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制20m3培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至31°C，移種量
I: 100，PH5.2-6.0，溫度31 °C，補料前通氣量0.6:1,補料后通氣量0.8:1,攪拌速度為80-90rpm/min，每2小時取樣檢測，接種后10小時補料，整體發(fā)酵時間為16-24小時，檢測合格后放罐，培養(yǎng)基配方為:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸銨:1%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氫鉀:0.3%
實施例4:一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
(1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制IL培養(yǎng)基，平均分裝與10個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1:80，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為180rpm/min，溫度30°C，培養(yǎng)時間8小時；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨8g 酵母提取物3g 食鹽3g
用蒸餾水定容至1L，高壓來菌制得枯草桿菌菌種；
(2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至30°C，采用枯草桿菌菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種與培養(yǎng)基比例為0.2:6，PH5.2，溫度30°C，攪拌速度為180rpm/min，整體發(fā)酵時間為16小時,在發(fā)酵過程中，每2小時取樣檢測，12小時后補加第一步培養(yǎng)基,加入量為第2步的枯草桿菌菌種和第2步培養(yǎng)基總體積量的10%，顯微鏡下檢測菌體數(shù)量較多，大小均勻，沒有其他雜菌生長，合格后得到含有抗菌肽的發(fā)酵物，培養(yǎng)基配方為:
玉米:2%
豆栢:1%
牛骨蛋白胨:0.5%
硫酸銨:0.5% 葡萄糖:0.1%
磷酸二氫鉀:0.2%
麥芽糖:0.5%
消泡劑:0.015%。
[0012]實施例5:—種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
(1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制IL培養(yǎng)基，平均分裝與10個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1:100，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為195rpm/min，溫度32°C，培養(yǎng)時間10小時；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨1g 酵母提取物5g 食鹽4.8g
用蒸餾水定容至1L，高壓來菌制得枯草桿菌菌種；
(2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至32°C，采用枯草桿菌菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種與培養(yǎng)基比例為0.2:6.5，PH5.5，溫度31°C，攪拌速度為195rpm/min，整體發(fā)酵時間為19小時，在發(fā)酵過程中，每2小時取樣檢測，12小時后補加第一步培養(yǎng)基，加入量為第2步的枯草桿菌菌種和第2步培養(yǎng)基總體積量的12%，顯微鏡下檢測菌體數(shù)量較多，大小均勻，沒有其他雜菌生長，合格后得到含有抗菌肽的發(fā)酵物，培養(yǎng)基配方為:
玉米:3%
豆栢:2%
牛骨蛋白胨:1%
硫酸銨:1.2%
葡萄糖:0.3%
磷酸二氫鉀:0.2%
麥芽糖:1%
消泡劑:0.02%。
[0013]實施例6:—種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
(1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制IL培養(yǎng)基，平均分裝與10個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1: 120，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為220rpm/min，溫度34°C，培養(yǎng)時間12小時；培養(yǎng)基配方:
牛骨蛋白胨12g 酵母提取物7g 食鹽7g
用蒸餾水定容至1L，高壓來菌制得枯草桿菌菌種；
(2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至34°C，采用枯草桿菌菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種與培養(yǎng)基比例為0.2: 7，PH6.0，溫度34°C，攪拌速度為220rpm/min，整體發(fā)酵時間為16?20小時,在發(fā)酵過程中，每2小時取樣檢測，12小時后補加第一步培養(yǎng)基,力口入量為第2步的枯草桿菌菌種和第2步培養(yǎng)基總體積量的20%，顯微鏡下檢測菌體數(shù)量較多，大小均勻，沒有其他雜菌生長，合格后得到含有抗菌肽的發(fā)酵物，培養(yǎng)基配方為:
玉米:4%豆栢:3%
牛骨蛋白胨:1.5%硫酸銨:1.5%葡萄糖:0.5%
磷酸二氫鉀:0.4%麥芽糖:1.5%消泡劑:0.025%。
【權(quán)利要求】
1.一種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制IL培養(yǎng)基，平均分裝與10個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1:80?120，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為180?220rpm/min，溫度30?34°C，培養(yǎng)時間8?12小時；培養(yǎng)基配方: 牛骨蛋白胨8?12g 酵母提取物3?7g 食鹽3?7g 用蒸餾水定容至1L，高壓來菌制得枯草桿菌菌種； (2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至30-34°C，采用枯草桿菌菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種與培養(yǎng)基比例為0.2:6?7，PH5.2?6.0，溫度30_34°C，攪拌速度為180?220rpm/min，整體發(fā)酵時間為16?20小時，在發(fā)酵過程中，每2小時取樣檢測，12小時后補加第一步培養(yǎng)基，加入量為第2步的枯草桿菌菌種和第2步培養(yǎng)基總體積量的10?20%,顯微鏡下檢測菌體數(shù)量較多，大小均勻，沒有其他雜菌生長，合格后得到含有抗菌肽的發(fā)酵物，培養(yǎng)基配方為: 玉米:2?4% 豆栢:I?3% 牛骨蛋白胨:0.5?1.5% 硫酸銨:0.5?1.5% 葡萄糖:0.1?0.5% 磷酸二氫鉀:0.2?0.4% 麥芽糖:0.5?1.5% 消泡劑:0.015 ?0.025%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:包括以下步驟: (I )、搖瓶培養(yǎng):按照配方配制IL培養(yǎng)基，平均分裝與10個100ml三角瓶中，高溫滅菌冷卻后，用枯草桿菌接種，接種量1:100，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為200rpm/min，溫度30_34°C，培養(yǎng)時間10小時；培養(yǎng)基配方: 牛骨蛋白胨1g 酵母提取物5g 食鹽5g 用蒸餾水定容至1L，高壓滅菌制得枯草桿菌菌種； (2)、發(fā)酵罐發(fā)酵:按照配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至30-34°C，采用枯草桿菌菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種與培養(yǎng)基比例為0.2:7，PH5.2-6.0，溫度30_34°C，攪拌速度為200rpm/min，整體發(fā)酵時間為16-20小時，在發(fā)酵過程中，每2小時取樣檢測，12小時后補加第一步培養(yǎng)基，加入量為第2步的枯草桿菌菌種和第2步培養(yǎng)基總體積量的10-20%，顯微鏡下檢測菌體數(shù)量較多，大小均勻，沒有其他雜菌生長，合格后得到含有抗菌肽的發(fā)酵物，培養(yǎng)基配方為: 玉米:3% 豆栢:2% 牛骨蛋白胨:1%硫酸銨:1%葡萄糖:0.3%磷酸二氫鉀:0.3%麥芽糖:1%消泡劑:0.02%。
【文檔編號】C12P21/00GK104513841SQ201310450697
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】胡國春, 郭文江, 趙福生 申請人:中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司