雞cct6a基因5′調控區(qū)兩個突變位點的分子標記方法及其在雞育種中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子遺傳學領域，具體涉及了一種雞CCT6A基因5′調控區(qū)突變位點的分子標記方法及其在育種中的應用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雞CCT6A5′調控區(qū)-2198和-1932位點均有C>T突變，并進行了單個位點標記分析，結果發(fā)現(xiàn)兩位點均與產(chǎn)蛋性狀相關，CTCT基因型產(chǎn)蛋量顯著高于CCTT和TTCC基因型，但與開產(chǎn)日齡沒有很大的相關性。選取CCTT、CTCT和TTCC三種基因型的雞取其卵泡，提RNA后，熒光定量PCR檢測CCT6A的mRNA表達情況，結果表明CTCT基因型CCT6A的表達顯著高于CCTT型和TTCC型，這與CTCT基因型產(chǎn)蛋量高的結果一致?？梢姍z測這兩個與產(chǎn)蛋性狀相關聯(lián)的分子標記，不僅方法簡便快速，并且有助于選育高產(chǎn)蛋的雞種，為標記輔助育種工作提供有利的幫助。
【專利說明】雞CCT6A基因5'調控區(qū)兩個突變位點的分子標記方法及其在雞育種中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學領域，具體涉及了一種雞CCT6A基因5'調控區(qū)的兩個突變位點的分子標記方法及其育種中的應用。
【背景技術】
[0002]CCT即含有16個亞基的雙環(huán)復合物，是一種廣泛存在于細胞漿中的異型寡聚蛋
白，屬II型伴侶素。也是迄今為止真核細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)的唯--個伴侶素，在肌動蛋白、
微管蛋白的組裝和折疊中發(fā)揮著重要的作用。先前研究采用雙向凝膠電泳技術以子宮內(nèi)膜癌細胞為材料，鑒定了 CCT6A為孕酮效應基因?？蝶惖?2012)研究商品蛋雞和濟寧百日雞開產(chǎn)前后差異mRNA時，發(fā)現(xiàn)在開產(chǎn)后的雞卵巢中CCT6A的mRNA表達量顯著升高，揭示了其在雞卵巢功能中的重要性。Wei等(2013 )研究發(fā)現(xiàn)，CCT6A在雞各組織中只有一個轉錄本，而且在卵巢中F5卵泡中表達量最高，并且在雞卵巢顆粒細胞中，孕激素可顯著上調CCT6A基因的mRNA表達，表明CCT6A基因在雞卵泡發(fā)育過程中起到重要的作用。
[0003]標記輔助育種(MAS)不受環(huán)境、性別、生長發(fā)育的限制，可進行早期選種，從而縮短世代間隔，提高選擇強度、選種效率和準確度。基因表達是DNA上的遺傳信息轉錄和翻譯的過程，轉錄受基因5'端序列的調控，堿基突變通常`會影響基因轉錄調控，因此5'端的序列結構變異直接關系到基因的表達。因此，研究CCT6A基因的5'啟動子區(qū)SNPs，有助于找出有意義的分子標記，為標記輔助育種提供有利的理論依據(jù)，方便快速地選育出早產(chǎn)、高產(chǎn)的品種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]根據(jù)現(xiàn)有技術，發(fā)明人進行了進一步的研究和實驗，具體涉及了一種雞CCT6A基因5'調控區(qū)突變位點的分子標記方法及其育種中的應用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雞CCT6A5'調控區(qū)-2198和-1932位點均有C>T突變，并進行了單個位點標記分析，結果發(fā)現(xiàn)兩位點均與產(chǎn)蛋性狀相關，并對CCTT、CTCT和TTCC三種基因型的雞取其卵泡，熒光定量PCR檢測CCT6A的mRNA表達情況，結果表明CTCT型CCT6A的表達顯著高于CCTT型和TTCC型，這與CTCT基因型產(chǎn)蛋量高的結果一致?？梢姍z測這兩個與產(chǎn)蛋性狀相關聯(lián)的分子標記，不僅方法簡便快速，并且有助于選育高產(chǎn)蛋的雞種，為育種工作提供有利的幫助。
[0005]本發(fā)明的具體標記方法是:
[0006]采用標記引物P-CCT6A，包括
[0007]P-CCT6A-F，其序列如 Seq ID No:l 所示；
[0008]P-CCT6A-R，其序列如 Seq ID No:2 所示；
[0009]擴增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并回收，經(jīng)測序得到的序列如Seq ID No:3所示，結果發(fā)現(xiàn)_2198bp和-1932位點分別檢測到CC、CT和TT三種
基因型。[0010]分別選育出CCTT和TTCC基因型的個體組建配套系，交配得到的后代為產(chǎn)蛋量高的CTCT雜合基因型，可以提高產(chǎn)蛋數(shù)。
[0011]通過這種標記方法得到的CTCT基因型種雞能兼顧開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋數(shù)，在產(chǎn)蛋性能低的地方品種中有意增加CTCT的頻率對提高產(chǎn)蛋量是一個有效措施，而對于開產(chǎn)較晚的群體，這樣的措施會使其開產(chǎn)適當提前，從而實現(xiàn)早期選種。
[0012](四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為P-CCT6A-F/R弓丨物PCR擴增的片段電泳圖；
[0014]圖2為雞CCT6A5'調控區(qū)-2198位點的多態(tài)性測序圖；
[0015]圖3為三種基因型CCT6A mRNA在新楊褐F1、F5、P0F1卵泡中的表達，統(tǒng)計學顯示含不同字母間差異顯著(P < 0.05)。
[0016](五)【具體實施方式】
[0017]實施例1雞CCT6A5'調控區(qū)序列的克隆測序、序列比對及突變位點分析
[0018]1.試驗材料
[0019]新楊褐基因組(上海家禽育種有限公司，國家家禽工程技術研究中心)，文昌雞基因組(海南省文昌雞育種公司)。
[0020]2.試驗方法
[0021]2.1引物設計
[0022]根據(jù)已發(fā)表紅色原雞序列(GenBank Accession NC_006106.3)設計引物P-CCT6A(其序列如Seq ID No:l和Seq ID No:2所示)，此引物是為研究雞CCT6A5'調控區(qū)的突變而根據(jù)數(shù)據(jù)庫中登錄的紅色原雞的序列特意設計的。
[0023]2.2PCR 擴增
[0024]隨機選取新楊褐和文昌雞各30個個體的基因組混池作為模版，用引物P-CCT6A進行PCR擴增。引物見表1，反應體系20yL，其中包括lyL基因組DNA (50-100ng),2μ L10X Ex-buffer, 1.6μ L dNTPs (2.5mM each，TaKaRa)，上下游引物各 0.4μ L (ΙΟμΜ)，
0.1 μ L Εχ-Taq DNA polymerase (5U/ μ L, TaKaRa), ddH20 補足至 20 μ L。擴增程序:94°C預變性4min ;94°C變性30sec，退火30sec(退火溫度如表3)，72°C延伸45sec，進行35個循環(huán)；循環(huán)結束72°C孵育5min。
[0025]2.3克隆測序
[0026]PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳分離后切取目的帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(AxyPr印 DNA Gel Extraction Kit，AXYGEN)純化 PCR 產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物連接到 pJETl.2載體(Fermentas)，并轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，包含目的片段的重組質粒純化后測序。
[0027]表1引物的序列、位置和退火溫度
[0028]
【權利要求】
1.雞CCT6A基因5'調控區(qū)兩個突變位點的分子標記方法，具體標記方法是:采用標記引物P-CCT6A，包括P-CCT6A-F,5/ -GCAGGTGTAGGATGGAAGAT-3'，其序列如 Seq ID No: 1 所示；P-CCT6A-R, 5; -CCACAAGTTTGGAGCCTTT-3'，其序列如 Seq ID No: 2 所示； 擴增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并回收，經(jīng)測序得到的序列如Seq ID No:3所示，結果在-2198和-1932位點分別檢測到CC、CT和TT三種基因型。
2.如權利要求1所述標記方法，其在雞育種中的應用方法是:選育出CCTT和TTCC兩種基因型純合個體組建配套系，交配得到的后代為產(chǎn)蛋量高的CTCT雜合基因型，可以提高產(chǎn)蛋數(shù)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627791SQ201310415983
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】姜運良, 康麗, 楊春紅, 魏晴晴, 張立蘭, 牛桂玉, 崔新星, 陳玉霞 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學