專利名稱：調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的PgPDR1基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及改良植物性狀，具體是促人參皂苷生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的相關(guān)基因及其蛋白和應(yīng)用。本發(fā)明在提高人參等植物中人參皂苷含量方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
人參(P. ginseng C. A. Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,是名貴中藥材。人參中含有多種藥用成分，其中人參皂苷是人參最主要的活性成分。目前已從人參根中分離出50余種人參皂苷，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明各皂苷單體具有重要的藥用價(jià)值，且已廣泛應(yīng)用于臨床。但是其中一些具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)免疫力等活性強(qiáng)的皂苷含量極低。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)利用人參細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)生產(chǎn)人參皂苷進(jìn)行了廣泛和深入的研究，但其含量仍較低，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求。在植物次生代謝調(diào)控中，可以通過(guò)導(dǎo)入關(guān)鍵酶等基因調(diào)控合成途徑中的多步限速反應(yīng)，并促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成；或通過(guò)誘導(dǎo)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將合成的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外或細(xì)胞器中得以積累，利用轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)使合成代謝向積累方向轉(zhuǎn)變，從而提高次生代謝產(chǎn)物含量。通過(guò)人參皂苷的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)人參皂苷合成與積累，有望成為人參皂苷高產(chǎn)調(diào)控的新策略。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是目前已知最大，功能最廣泛的蛋白家族，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬跨膜運(yùn)輸?shù)鞍祝盟釧TP釋放的能量轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)酸、生物堿、細(xì)胞代謝產(chǎn)物和藥物等。參與細(xì)菌耐藥性、次生代謝產(chǎn)物積累、脅迫反應(yīng)和腫瘤抗藥性等。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族包括多向耐藥性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多藥耐藥性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亞族,是植物和真菌中特有的一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但目前對(duì)植物PDR基因相關(guān)研究甚少，離體細(xì)胞培養(yǎng)中，香紫蘇醇可誘導(dǎo)NpTORl基因上調(diào)表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)NpTORl蛋白累積增強(qiáng)了細(xì)胞向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)香紫蘇醇以及其類似物的能力。擬南芥(A. thaliana)細(xì)胞內(nèi)香紫蘇醇的累積亦能誘導(dǎo)AtH)R12基因上調(diào)表達(dá)，同時(shí)在細(xì)胞外檢測(cè)到AtH)R12蛋白向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)的香紫蘇醇，推測(cè)萜類物質(zhì)可能是AtH)R12基因表達(dá)的上游調(diào)控物質(zhì)。因此，PDR蛋白可能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性抗真菌二萜類物質(zhì)參與植物防御反應(yīng)。此外，尚無(wú)植物PDR蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)更復(fù)雜萜類分子的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能夠調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累相關(guān)的基因、由該基因編碼的蛋白及其應(yīng)用，為今后開(kāi)發(fā)基因工程產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為本發(fā)明提供了一種調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的PgPDRl基因，其基因序列如SEQ IDNO. I所示。
本發(fā)明還提供了一種用于擴(kuò)增PgPDRl基因的簡(jiǎn)并引物對(duì)，所述引物對(duì)如SEQ IDNO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。本發(fā)明還提供了含有PgPDRl基因重組載體，具體包括植物表達(dá)載體pCAMBIA1301，S卩，將PgPDRl基因克隆到空載體pCAMBIA1301中，獲得重組載體pCAMBIA1301-PgPDRl ;原核表達(dá)載體pET28a，即，將PgPDRl基因克隆到空載體pET28a中，獲得重組載體pET28a-PgPDRl。PgPDRl基因亦可克隆到其他空載體中，或制備成轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及重組菌。本發(fā)明還提供了 PgPDRl基因在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累中的應(yīng)用；PgPDRl基因在人參育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種由SEQ ID NO. I所不PgPDRl基因編碼的蛋白，該蛋白的序列如 SEQ ID NO. 2 所示。本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO. 2所示蛋白在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累中的應(yīng)用，以·及該蛋白在人參育種中的應(yīng)用。本發(fā)明利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，利用植物PDR基因同源性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用簡(jiǎn)并引物PCR技術(shù)和RACE等方法分離與鑒定人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累相關(guān)的基因序列，并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)過(guò)異源表達(dá)鑒定證明PgPDRl基因?qū)θ藚⒃碥盏霓D(zhuǎn)運(yùn)功能。本發(fā)明人參ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PgPDRl序列如SEQ ID NO. I所示，其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。研究發(fā)現(xiàn)PgPDRl基因表達(dá)具有組織特異性且與人參皂苷的積累有關(guān)。初步表明所述PgPDRl基因具有促進(jìn)人參皂苷合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累方面的功能。可以通過(guò)該基因或其衍生物篩選或改良人參甚至其它植物，獲得人參皂苷含量高的優(yōu)良植物品種。亦可以采用人參組織培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)Rb、Re和Rg等人參皂苷單體。


圖I是本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的人參PDR基因片段圖示；圖中，I表示簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M表示Marker ；圖2是本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的人參TOR基因片段推測(cè)氨基酸序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域圖；圖3是本發(fā)明的PCR擴(kuò)增PgPDRl基因圖示；圖中，I表示PCR擴(kuò)增PgPDRl全長(zhǎng)序列產(chǎn)物，M表Marker ；圖4是本發(fā)明的PgPDRl蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖；圖5是本發(fā)明的PgPDRl基因編碼氨基酸序列及其與其它植物PDR基因同源性比較圖；圖6是本發(fā)明的PgPDRl基因編碼氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析圖；圖7是本發(fā)明的PgPDRl基因在人參不同組織中的表達(dá)水平圖；圖8是本發(fā)明的PgPDRl基因在100 μ M MeJA誘導(dǎo)下的人參細(xì)胞中表達(dá)水平圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例IPgPDRl基因的獲得I、人參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)
(I)取吉林長(zhǎng)白山人參產(chǎn)區(qū)四年生人參根，自來(lái)水浸泡45min后沖洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒(sec)，無(wú)菌水沖洗2次，無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上用O. l%HgC12消毒，不斷攪動(dòng)，無(wú)菌蒸餾水沖洗4-5次。(2)在無(wú)菌條件下，將消毒過(guò)的外植體接種到含有2，4-D (2. Omg/L)和KT (O. 5mg/L)的MS培養(yǎng)基中。經(jīng)3次繼代培養(yǎng)后外植體完全脫分化，待完全形成愈傷組織后，每IOOml三角瓶接種6個(gè)外植體，培養(yǎng)條件如前述，培養(yǎng)45天(d)后將愈傷組織行繼代培養(yǎng)，以補(bǔ)充培養(yǎng)物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和其它要求。接種30d后進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)，以后每3-4周繼代一次。(3)當(dāng)?shù)玫接鷤M織后，將其轉(zhuǎn)入到MS液體培養(yǎng)基中。愈傷組織塊直徑應(yīng)小于3mm。若組織塊較大可用無(wú)菌解剖刀將其分割成小塊。液體培養(yǎng)基分裝在50ml的錐形瓶?jī)?nèi)，每IOml液體培養(yǎng)基接種I. 5-2. Og愈傷組織，接種后震蕩培養(yǎng)，120rpm, 24°C，暗培養(yǎng)。每隔 4-7d繼代一次。2、細(xì)胞處理及其RNA提取(I)細(xì)胞處理I)取460 μ L茉莉酸甲酯(MeJA)溶于4540 μ L乙醇，加5ml雙蒸水至10ml，配成IOml 200mM的MeJA母液,用O. 22 μ m的濾器過(guò)濾除菌。2)在懸浮細(xì)胞繼代的48h后，IOml液體培養(yǎng)基加入IOyL母液至終濃度為200 μ M，120rpm, 24°C，振蕩暗培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后提取人參細(xì)胞的總RNA。(2)人參懸浮細(xì)胞總RNA提?、?000 Xg離心5min收集的懸浮細(xì)胞,在研缽內(nèi)用液氮充分研磨成粉末。每40mg研磨的粉末置于1.5ml離心管中，加入Iml TRIzoI試劑，40 μ L β-巰基乙醇，用移液器吸頭重懸細(xì)胞沉淀，室溫孵育5-10min。②加入O. 2ml氯仿，振搖15sec,室溫孵育10_15min。③4°C、12000Xg離心15min，收集上層無(wú)色水相于I. 5ml離心管中，勿吸動(dòng)中間
層，棄沉淀。④加入0.4ml 3mol/L醋酸銨(pH 5· 2)，O. 6ml異丙醇，輕柔振蕩混勻，室溫孵育
5-10min(RNA 沉淀)。4°C、12000 X g 離心 IOmin,棄上清。⑤加入Iml 75%乙醇并振蕩；4°C,7500Xg離心5min,棄上清,重復(fù)該步驟。⑥空氣中干燥lOmin，加入20 μ L DEPC水溶解RNA。⑦RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳在O. 5XTBE中進(jìn)行，瓊脂糖濃度為1%(每IOOml凝膠中加入2. 5 μ L的10mg/ml EB), 4 μ L上樣量，8v/cm恒壓40min,然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察所提取RNA的完整性。3、cDNA 合成純化mRNA后，以oligo (dT)為引物，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄總mRNA。(I)反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的PgPDRl基因，其特征在于，所述PgPDRl基因序列如SEQ ID NO. I 所示。
2.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求I所述PgPDRl基因的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)如SEQID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
3.—種重組載體，由空載體和插入該空載體的目的基因組成，其特征在于，所述目的基因?yàn)闄?quán)利要求I所述的PgPDRl基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述空載體為pET28a或PCAMBIA1301。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述PgPDRl基因在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述PgPDRl基因在人參育種中的應(yīng)用。
7.—種調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的蛋白，其特征在于，所述蛋白由SEQ ID NO. I所示的基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述蛋白在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述蛋白在人參育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種促進(jìn)人參皂苷轉(zhuǎn)運(yùn)與積累相關(guān)基因PgPDR1及其編碼蛋白和應(yīng)用。該人參ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PgPDR1序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究發(fā)現(xiàn)PgPDR1基因表達(dá)具有組織特異性且與人參皂苷的積累有關(guān)。初步表明所述PgPDR1基因具有促進(jìn)人參皂苷合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累方面的功能?？梢酝ㄟ^(guò)該基因或其衍生物篩選或改良人參及其它植物，獲得人參皂苷含量高的優(yōu)良植物品種。亦可以采用人參轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物生產(chǎn)原人參二醇、Rb、Re、Rh2、Rg2和Rg3等人參皂苷單體。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102925460SQ20121046444
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者羅志勇, 張儒, 祝捷, 黃景嘉, 陳湘暉, 羅俊 申請(qǐng)人:中南大學(xué)