一種豬肌肉特異性表達(dá)Follistatin-317的表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬肌肉特異性表達(dá)Follistatin-317的表達(dá)載體和應(yīng)用，所述表達(dá)載體的表達(dá)盒是豬內(nèi)源性的skeletal-α-actin基因座與FST317編碼cDNA融合而成，所述豬內(nèi)源性的skeletal-α-actin基因調(diào)控區(qū)驅(qū)動(dòng)FST317的表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)載體可以應(yīng)用體細(xì)胞克隆制備轉(zhuǎn)基因豬，在轉(zhuǎn)基因豬的肌肉組織特異性的表達(dá)FST317。
【專利說(shuō)明】—種豬肌肉特異性表達(dá)Fol I istatin-31 7的表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，涉及一種豬肌肉特異性表達(dá)Follistatin-317的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬肉是我國(guó)人民主要的動(dòng)物蛋白來(lái)源，對(duì)于人民的生活水平提高起到關(guān)鍵性作用。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，中國(guó)人豬肉需求量也越來(lái)越大，據(jù)統(tǒng)計(jì)中國(guó)每年消費(fèi)的豬肉量占全世界總量的一半以上。市場(chǎng)的需求擴(kuò)大，促進(jìn)了我國(guó)現(xiàn)代化規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。但是同時(shí)也提出嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。在我國(guó)，主要畜牧類品種嚴(yán)重依賴于進(jìn)口，豬品種依賴程度接近90%。這意味著生豬養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)的源頭——種畜完全被歐美市場(chǎng)控制，嚴(yán)重的威脅到我國(guó)的食品安全。培育自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的豬新品種是現(xiàn)階段我國(guó)迫切需要解決的農(nóng)業(yè)問(wèn)題。傳統(tǒng)的遺傳選育方法周期長(zhǎng)見(jiàn)效慢，難以在短期內(nèi)培育出具有高生產(chǎn)性能豬新品種。自從1997年哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)出現(xiàn)以后，家畜的基因工程育種得到迅速發(fā)展，它可以針對(duì)單一性狀在短期內(nèi)迅速的提高家畜的生產(chǎn)性能。
[0003]卵泡抑素(follistatin，F(xiàn)ST)—條多肽鏈組成的糖蛋白。FST具有多種生物學(xué)功能，能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的多個(gè)成員結(jié)合。在哺乳動(dòng)物中FST轉(zhuǎn)錄后有兩種不同的剪接形式，一種剪接mRNA編碼344個(gè)氨基酸殘基的蛋白(FST-344)，另一種剪接體編碼317個(gè)氨基酸殘基的蛋白(FST-317)。FST-344和FST317翻譯后修飾分別形成兩種成熟蛋白——315個(gè)氨基酸殘基FST315和288個(gè)氨基酸殘基的FST288。FST288的C末端少了 17個(gè)氨基酸殘基，其與細(xì)胞表面的肝素有很強(qiáng)的結(jié)合能力，F(xiàn)ST288很難從表達(dá)部位擴(kuò)散到血液中；FST315的C端17個(gè)氨基酸殘基減弱了其與肝素的結(jié)合能力，F(xiàn)ST315容易表達(dá)組織擴(kuò)散到血液中。FST288被認(rèn)為是組織特異性的卵泡抑素蛋白，而FST315被認(rèn)為是分泌型的卵泡抑素蛋白。雖然是肌肉特性的表達(dá)FST315，過(guò)量FST315能夠從肌肉中擴(kuò)散到血液，隨著血液循環(huán)影響其他的組織和器官。血液中高濃度的FST315蛋白可能會(huì)導(dǎo)致生殖障礙，對(duì)轉(zhuǎn)基因豬產(chǎn)生安全隱患。實(shí)際上肌肉特異性表達(dá)FST288的才能真正做到肌肉特異性。構(gòu)建一種豬肌肉特異性表達(dá)FST288表達(dá)載體，用它制備轉(zhuǎn)基因豬既能提高豬瘦肉率又能保證豬的安全。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，增加了轉(zhuǎn)基因豬的安全性。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0006]—種豬肌肉特異性表達(dá)Follistatin-317的表達(dá)載體,所述表達(dá)載體的表達(dá)盒是豬內(nèi)源性的skeletal-a -actin基因座與FST317編碼cDNA融合而成，所述豬內(nèi)源性的skeletal- a -actin基因調(diào)控區(qū)驅(qū)動(dòng)FST317的表達(dá)。[0007]進(jìn)一步的,所述表達(dá)載體包括，
[0008]skeletal-a-actin 基因 5，側(cè)翼序列，優(yōu)選為 skeletal-a-actin 基因 5，側(cè)翼12kb的序列；
[0009]FST288編碼DNA，優(yōu)選的FST288是以人FST344cDNA載體為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的；
[0010]skeletal- a -actin 基因 3’側(cè)翼的序列,優(yōu)選為 skeletal- a -actin 基因 3’側(cè)翼
7.8kb的序列；
[0011]新霉素抗性基因(neo)，在新霉素抗性基因上下游插入同向1xp可用于新霉素抗性基因的刪除。
[0012]進(jìn)一步的，所述的表達(dá)載體序列如序列表SEQ:1D N0:1所不。
[0013]本發(fā)明的另一目的為提供一種上述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其技術(shù)方案如下: [0014]一種表達(dá)載體的構(gòu)建方法，利用Red/ET介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，包括如下步驟:
[0015]I)將含有豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白的21kb基因座抓捕到抓捕載體上，優(yōu)選的抓捕載體是通過(guò)PCR分別擴(kuò)增左右同源臂后插入到pBR322-loxp-neo-loxp骨架載體構(gòu)建而成；
[0016]2)將FST317基因加上抗性基因定點(diǎn)敲入到骨骼肌肌動(dòng)蛋白的編碼區(qū)，優(yōu)選的抗性基因?yàn)閦eocin抗性基因；
[0017]3)通過(guò)Flpase介導(dǎo)的位點(diǎn)專一性重組將抗性基因刪除，表達(dá)載體構(gòu)建完成。
[0018]本發(fā)明還提供了含有上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0019]本發(fā)明還提供了一種上述表達(dá)載體制備轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的表達(dá)載體可以應(yīng)用體細(xì)胞克隆制備轉(zhuǎn)基因豬，在轉(zhuǎn)基因豬的肌肉組織特異性的表達(dá)FST317，從而增加了轉(zhuǎn)基因豬的安全性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1表達(dá)載體構(gòu)建路線圖；
[0022]圖2酶切鑒定抓捕載體；
[0023]圖3菌體直接裂解電泳檢測(cè)重組克??；
[0024]圖4抓捕酶切鑒定-重組克隆XbaI酶切；
[0025]圖5抓捕酶切鑒定-重組克隆HindIII酶切；
[0026]圖6PCR鑒定hFST基因敲入；
[0027]圖7PCR鑒定zeocin抗性基因刪除；
[0028]圖8表達(dá)載體酶切鑒定；
[0029]圖9豬肌肉特異性表達(dá)Follistatin-317的表達(dá)載體圖譜；
[0030]圖10轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)不意圖；
[0031]圖1lPCR擴(kuò)增檢測(cè)外源基因的整合；
[0032]圖12southern雜交驗(yàn)證外源基因的整合；
[0033]圖13RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】[0034]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0035]實(shí)施例1載體構(gòu)建
[0036]參見(jiàn)圖1，利用Red/ET介導(dǎo)的同源重組，第一步將含有豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白的21kb基因座抓捕到抓捕載體上；第二步將FST317基因加上抗性基因定點(diǎn)敲入到骨骼肌肌動(dòng)蛋白的編碼區(qū)；第三步通過(guò)Flpase介導(dǎo)的位點(diǎn)專一性重組將抗性基因刪除，載體構(gòu)建完成。
[0037]1.1、抓捕載體構(gòu)建
[0038]PCR分別擴(kuò)增左右同源臂后插入到pBR322-loxp-neo-loxp骨架載體，構(gòu)建成抓捕載體。
[0039]以含有豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白的BAC為模板，分別以:
[0040]TYBlF:5/ -CGTaagcttAAATCACTGGCTGTGTGCTG-3 ; ’
[0041]TYBlR:5/ -CTGCAGGCTGAATTCTTTCC-3’ ；
[0042]TYB2F:5/ -TCGgaattcCTGAAA-ATTCCCCAAGACGA_3’ ；
[0043]TYB2R:5/ -CAGtctagaGAATGGTGGAGGCGAATAGA-3’ ；
[0044]為引物擴(kuò)增左側(cè)430bp,右側(cè)417bp同源臂。在pBR322-loxp-neo_loxp骨架載體的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入由引物TYBlF和TYBlR擴(kuò)增得到的430bp抓捕載體上游同源臂；再將構(gòu)建好的載體用EcoRI和XbaI雙酶切，插入由引物TYB2F和TYB2R擴(kuò)增出的417bp抓捕載體下游同源臂，由此獲得抓捕載體。
[0045]構(gòu)建好pBR322-loxp-neo_loxp`抓捕載體,用HindIII和XbaI雙酶切，如圖2所示，切出8.1kb和814bp的兩條帶,證明第一步抓捕載體構(gòu)建成功。
[0046]EcoR I線性化抓捕載體用于下一步抓捕實(shí)驗(yàn)。
[0047]1.2敲入片段拼接
[0048]以人FST344cDNA為模板，F(xiàn)STF和FSTR為引物，
[0049]FSTF:
[0050]5' -AATgctagcGCTCGGACCAGTGAGGCTTCCTGCCTGACACGCTGCGCATCTCCACGGCCTTGCTGATCTTGCAGAAACCCGACGCCATTCATATGATGGTCCGCGCGAGGC-3，；
[0051]FSTR:
[0052]5' -AATgctagcTGCCGCTTGGTGGCTCGAGGTCAGCCACTGCACTTGAGCAGATTCGTCGTCCTGAGGAGAAGTCGCAGCTGTTGGAATGGGGTGAATTCAAAGGCTATGTCAACACTGAACACT-3,；
[0053]擴(kuò)增出兩端帶有同源臂的FST317基因片段，連接入T載體，測(cè)序T-FST質(zhì)粒。以pEpBudce4質(zhì)粒為模板，以FZF和FZR為引物，
[0054]FZF:
[0055]5 ' -GaattcGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCAGACATGATAAGATACATTGATG-3/ ；
[0056]FZR:
[0057]5' -GaattcGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCAGGAGGAGGCTTTTTTGG-3’ ；
[0058]擴(kuò)增出兩端帶有FRT的zeocin基因片段。將測(cè)序正確的T-FST質(zhì)粒和FRT-Zeor-FRT片段分別用EcoRI酶切，將兩個(gè)片段膠回收后用T4連接酶進(jìn)行連接，zeocin篩選連接產(chǎn)物陽(yáng)性克隆。
[0059]Nhe I酶切后，回收hFST-FRT-ZecZ-FRT片段，用于下一步基因敲入。[0060]1.3、基因抓捕
[0061]將線性化的pBR322-l0Xp-ne0-l0Xp抓捕載體電轉(zhuǎn)到含有豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的BACSW102重組感受態(tài)中，zeocin抗性的LB固體培養(yǎng)基上，32°C過(guò)夜培養(yǎng)。從zeocin抗性的克隆中隨機(jī)挑選20候選克隆劃線培養(yǎng)，再挑取少量菌體裂解后直接電泳，如圖3所示，初步判斷20個(gè)克隆中有9個(gè)基因抓捕成功，其中16號(hào)克隆疑似為雙克隆。
[0062]選擇前7個(gè)克隆提取質(zhì)粒后，分別用XbaI和HindIII酶切鑒定，參見(jiàn)圖4，用XbaI能切出791bp、978bp、7812bp、9789bp、10214bp五條帶；參見(jiàn)圖5，用HindIII能切出大小分別為 436bp、752bp、1128bp、2108bp、2197bp、3326bp、3946bp、5265bp、10426bp 的條帶，這些條帶均與酶切分析結(jié)果一致，證明成功獲得了約29.5kb的重組克隆，陽(yáng)性率達(dá)到40%。
[0063]I.4、FST317 基因敲入
[0064]將步驟1.3中抓捕成功的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后制備成重組感受態(tài)，再將步驟1.2中拼接成功的線性DNA片段hFST-FRT-ZecZ-FRT電轉(zhuǎn)到重組感受細(xì)胞，取100 μ I涂布含有zeocin的LB固體培養(yǎng)皿，32°C培養(yǎng)17h。挑取其中3個(gè)候選克隆，以P1+P2為引物進(jìn)行PCR
鑒定，
[0065]Pl:5/ -GCTCCTTCTTTGGTCAGCAC-3'；
[0066]P2:5/ -TCCTTGCTCAGTTCGGTCTT-3 ；
[0067]如圖6所示，都能夠擴(kuò)增出1187bp的條帶。然后對(duì)其中一個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明FST317基因定點(diǎn)敲入到了豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白的編碼區(qū)，已將豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白PSA基因替換。
[0068]1.5、抗性基因刪除`
[0069]將步驟1.4中構(gòu)建好的基因敲入質(zhì)粒和表達(dá)Flpase重組酶的707_FLPe質(zhì)粒一起導(dǎo)入到大腸桿菌中，37°C誘導(dǎo)位點(diǎn)專一性重組，刪除zeocin抗性基因。隨機(jī)選取兩個(gè)候選克隆，
[0070]P3:5/ -GACTGTGGACCTGGGAAAAA-3'；
[0071]P4:5/ -TGTGAAAAGTGACGCTGAGG-3'；
[0072]以P3+P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定刪除結(jié)果，如圖7所示，擴(kuò)增條帶比對(duì)照條帶少SOObp左右，說(shuō)明抗性基因刪除成功。挑選一個(gè)克隆提取質(zhì)粒，用HindIII進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，如圖 8 所示，切出條帶大小有 436bp、752bp、1128bp、1587bp、2108bp、2197bp、3326bp、3946bp、7109bp、10426bp，該結(jié)果與酶切分析一致。
[0073]測(cè)序分析進(jìn)一步證明，zeocin基因已經(jīng)刪除，只留下一個(gè)FRT位點(diǎn)；FST317編碼序列替代豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白編碼區(qū)，形成一個(gè)雜合的表達(dá)盒；由豬的骨骼肌肌動(dòng)蛋白的上下游調(diào)控序列啟動(dòng)重組FST317表達(dá)。
[0074]實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞獲得
[0075]2.1杜洛克豬胎兒成纖維細(xì)胞建立
[0076]2.1.1、取妊娠30d的長(zhǎng)白豬，取輸卵管子宮，包扎出口，2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從子宮內(nèi)取出胎兒，用含抗生素的DPBS清洗胎兒，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi)，用眼科剪去除胎兒頭部、四肢、內(nèi)臟，用DPBS沖洗；
[0077]2.1.2、在直徑IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)用眼科剪將剩余部分盡量剪碎；
[0078]2.1.3、加入少許血清，將Iml槍頭尖端用剪刀剪斷，留下直徑約為40mm以上部分，接上Iml槍，將組織塊轉(zhuǎn)移到3個(gè)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底壁，用彎頭吸管將組織塊均勻鋪開(kāi)；
[0079]2.1.4、將鋪有組織塊的一面向上，各加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱，39°C，5%C02,100%濕度培養(yǎng)；
[0080]2.1.5、待 培養(yǎng)6_8h后，將鋪有組織塊的一面翻轉(zhuǎn)，使細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒(méi)組織塊；
[0081]2.1.6、培養(yǎng)5天左右觀察組織塊周?chē)欠裼屑?xì)胞爬出；
[0082]2.1.7、待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或進(jìn)行冷凍保存。
[0083]2.2將實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)Follistatin-317的線性化表達(dá)載體轉(zhuǎn)染豬的胎兒成纖維細(xì)胞；
[0084]2.3G418藥物篩選細(xì)胞克??；
[0085]2.4PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞克?。?br> [0086]實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因豬的制備
[0087]3.1豬卵母細(xì)胞體外成熟
[0088]從屠宰場(chǎng)取卵巢，放入28 0C -35 °C、含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用配有18號(hào)針頭的20mL注射器抽吸卵巢上3_6mm的卵泡。將抽取液放于50mL離心管中，7 °C水浴靜置15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重懸沉淀，再靜置15min，重復(fù)一次，將重懸液放入直徑60mm的塑料培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下，用口吸管挑選卵丘包裹2層以上、致密、而且胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-Oocyte-complexes, COCs),用成熟培養(yǎng)液洗漆3遍,轉(zhuǎn)入在培養(yǎng)箱中至少已經(jīng)平衡4h的培養(yǎng)液滴內(nèi)(每100 μ L液滴放25枚)。每一直徑35mm的塑料培養(yǎng)皿中做4個(gè)液滴，用胚胎級(jí)礦物油覆蓋。
[0089]將COCs先在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)20±2h，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)hCG以及eCG的成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)20±2h。
[0090]3.2體細(xì)胞準(zhǔn)備
[0091]利用血清饑餓法，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，進(jìn)行血清饑餓處理，即把培養(yǎng)液中的FBS (Gibco, Life Technologies)濃度從20%降至0.5%繼續(xù)培養(yǎng)2_5d，按常規(guī)方法消化，離心洗漆，最后加ImL顯微操作液重懸細(xì)胞沉淀備用。
[0092]3.3受體卵母細(xì)胞去核及供體細(xì)胞核移植
[0093]利用盲吸法進(jìn)行成熟卵母細(xì)胞去核，即成熟40_44h豬卵母細(xì)胞，脫卵丘后選擇胞質(zhì)均勻，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母細(xì)胞放入無(wú)Ca2+、Mg2+的HEPES緩沖液NCSU-23備用，然后轉(zhuǎn)移到顯微操作液滴內(nèi):核移植前Ih做好，直徑60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿蓋中央(液滴50-80 μ l,2-3mm寬，8_10mm長(zhǎng)，石蠟油覆蓋)，作用15_30min，把供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)入其中于391:、5%0)2、100%濕度平衡15min，安裝顯微固定管以及去核/注射針，調(diào)節(jié)好操作系統(tǒng)位置，在裝配有顯微操作儀及恒溫臺(tái)的倒置顯微鏡下(40X)，用固定管(內(nèi)徑25-35 μ m,外徑100-120 μ m)吸持卵母細(xì)胞用內(nèi)徑15-25 μ m的去核/注射針撥動(dòng)卵母細(xì)胞，使第一極體處于鐘表1點(diǎn)鐘位置下，從鐘表3點(diǎn)處將去核/注射針刺過(guò)透明帶，吸出第一極體及其附近少許細(xì)胞質(zhì)，退出去核/注射針，將第一極體以及少許胞質(zhì)吐出。挑選直徑15-20 μ m、折光性強(qiáng)、圓形、光滑的體細(xì)胞，用去核/注射針吸取一個(gè)供體細(xì)胞，從去核進(jìn)針處將體細(xì)胞注射到透明帶下的卵周隙內(nèi)用注射針點(diǎn)壓透明帶，使供體細(xì)胞與受體卵胞質(zhì)的細(xì)胞膜彼此緊密接觸。每批25-30個(gè)卵母細(xì)胞，構(gòu)建完成后，將供體細(xì)胞-卵胞質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞對(duì)(重構(gòu)卵)轉(zhuǎn)移到NCSU-23+4mg/ml BSA中，39°C、5%C02、100%濕度培養(yǎng)箱中修復(fù) 1-2h0
[0094]3.4融合與激活
[0095]將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡3min，用融合/激活液洗滌3遍后，每批5個(gè)放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，用拉制的且尖端很細(xì)的實(shí)心玻璃針撥動(dòng)重組卵，使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行用ECM2001融合儀施加一個(gè)30 μ S，，2.0kv/cm的直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時(shí)激活，用NCSU-23%+4mg/ml BSA洗滌5遍，立即轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中，39°C、5%C02、100%濕度培養(yǎng)0.5h~Ih后取出，在體視顯微鏡下判定融合。
[0096]3.5胚胎培養(yǎng)
[0097]在開(kāi)始顯微操作前至少4h預(yù)先做好培養(yǎng)液滴，在超凈臺(tái)內(nèi)取35_細(xì)胞培養(yǎng)皿，做6-8個(gè)體積為30 μ L的液滴，小心加入2.5-3ml礦物油覆蓋，做好標(biāo)記后放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡。將上述融合的重構(gòu)胚用胚胎培養(yǎng)液洗滌5遍后轉(zhuǎn)入液滴，每個(gè)30 μ L的液滴培養(yǎng)8-10個(gè)重構(gòu)胚，培養(yǎng)48h和168h時(shí)記錄卵裂和囊胚形成結(jié)果。
[0098]3.6胚胎移植
[0099]用公豬試情或者觀察壓背反應(yīng)，挑選自然發(fā)情母豬，一般在構(gòu)建克隆胚的當(dāng)天，將在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-30h的1-2細(xì)胞克隆胚取出，裝入2.5ml細(xì)管內(nèi)。用滅菌的錫箔紙包裝好，做好標(biāo)記，放到恒溫運(yùn)輸箱中運(yùn)到豬移植地點(diǎn)，用40-60ml (lmg/100kg體重)生理鹽水溶解1-1.5mg硫噴妥鈉和地西泮，耳靜脈注射20ml，待受體豬初步麻醉后，將其抬到手術(shù)架上仰臥(青年后備母豬)或者側(cè)臥(經(jīng)產(chǎn)母豬)保定對(duì)后備母豬:在腹部下面第I對(duì)和第2對(duì)乳頭之間，腹中線局部15X IOcm2面積內(nèi)清潔刮毛后先碘酒消毒，后酒精棉脫碘(對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬:在腹部肷窩部15 X IOcm2的范圍內(nèi)清潔，刮毛碘酒消毒后酒精脫碘)在準(zhǔn)備動(dòng)刀切開(kāi)腹中線之前，把前面余下的麻醉藥再酌情注射20-30ml，沿腹中線切開(kāi)一個(gè)長(zhǎng)約8-lOcm的口，打開(kāi)腹腔，探進(jìn)去一只手，取出卵巢后用潤(rùn)濕的滅菌脫脂紗布蓋上(而對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬:沿側(cè)腹部做一個(gè)與腹中線面垂直的長(zhǎng)約IOcm的切口)在手術(shù)人員即將取出卵巢，調(diào)整好輸卵管傘之際，將裝在吸管內(nèi)的胚胎取出放在熱臺(tái)上，體視顯微鏡下將胚胎裝入移植管內(nèi)，手術(shù)人員和胚胎移植人員相互協(xié)調(diào)，將移植管從輸卵管傘部探入輸卵管至少5cm大致到了壺腹-峽部結(jié)合處，一邊推動(dòng)注射器，以便外撤移植管移植后體視鏡下觀察胚胎是否仍滯留在移植管內(nèi)，確認(rèn)沒(méi)有后，開(kāi)始卵巢回位，術(shù)口縫合。胚胎移植后第IOd肌肉注射800IU hCG，13d 注射 500IU PMSG0
[0100]實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因豬的分子鑒定和表達(dá)檢測(cè)
[0101]提取克隆豬基因組，PCR擴(kuò)增檢測(cè)外源基因的整合。參見(jiàn)圖10，上下游引物設(shè)計(jì)分別為:P1位于表達(dá)載體5’調(diào)控區(qū)；P2位于rhFST344的編碼區(qū)，這種的引物組合避免了內(nèi)源基因的干擾，在只有整合表達(dá)載體的克隆豬基因組中才能擴(kuò)增到1187bp目的條帶。擴(kuò)增的結(jié)果如圖11所示，八頭克隆豬都都能擴(kuò)增到和陽(yáng)性對(duì)照大小一致的特異性條帶，我們可以初步判斷八頭克隆豬都是整合了表達(dá)載體。
[0102]通過(guò)southern雜交我們進(jìn)一步驗(yàn)證外源基因在克隆豬基因組中整合情況。分別取IOug的基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I消化后，經(jīng)低壓電泳分離后轉(zhuǎn)到膜上，用P9(F:5/ -CCCAGGTGGAGAAATTCTGA-3')和 PO (R:5/ -GAGCTGCCTGGACAGAAAAC-3)為引物以表達(dá)載體為模板PCR擴(kuò)增合成DIG標(biāo)記的探針進(jìn)行southern blot雜交試驗(yàn)。以EcoR I酶切的表達(dá)載體為陽(yáng)性對(duì)照，雜交后陽(yáng)性顯示一條約4.1kb的條帶，表明表達(dá)載體確實(shí)整合到克隆豬的基因組中。如圖12所示，southern雜交與PCR鑒定的結(jié)果一致。
[0103]提取豬心、肝、脾、肺、腎、肝、舌、胃、腦、骨骼肌、睪丸、垂體以及小腸總RNA，RT-PCR檢測(cè)外源Follistatin基因表達(dá)，圖13結(jié)果顯示只有在心肌，舌肌以及骨骼肌中轉(zhuǎn)基因大量表達(dá)，由此可知表達(dá)載體具有很強(qiáng)`的肌肉特異性表達(dá)能力。
【權(quán)利要求】
1.一種豬肌肉特異性表達(dá)Follistatin-317的表達(dá)載體,其特征在于,所述表達(dá)載體的表達(dá)盒是豬內(nèi)源性的skeletal- a -actin基因座與FST317編碼cDNA融合而成，所述豬內(nèi)源性的skeletal-a -actin基因調(diào)控區(qū)驅(qū)動(dòng)FST317的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包括，skeletal- a -actin 基因 5，側(cè)翼序列、FST288 編碼 DNA 和 skeletal- a -actin 基因 3，側(cè)翼的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體,其特征在于,其序列如序列表SEQ:1D N0:1所示。
4.一種表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將含有豬骨骼肌肌動(dòng)蛋白的基因座抓捕到抓捕載體上； 2)將FST317基因加上抗性基因定點(diǎn)敲入到骨骼肌肌動(dòng)蛋白的編碼區(qū)； 3)通過(guò)Flpase介導(dǎo)的位點(diǎn)專一性重組將抗性基因刪除，表達(dá)載體構(gòu)建完成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟I中的抓捕載體是通過(guò)PCR分別擴(kuò)增左右同源臂后插入到骨架載體構(gòu)建而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述骨架載體為pBR322-loxp-neo-loxp,其中neo為新霉素抗性基因，在新霉素抗性基因上下游插入同向1xp可用于新霉素抗性基因的刪除。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟2中的抗性基因?yàn)閦eocin抗性基因。
8.含有權(quán)利要求1-3任一所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任 一所述的表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103725711SQ201310728847
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】方銳, 暢飛, 李寧, 張磊, 湯波, 王建武 申請(qǐng)人:北京濟(jì)福霖生物技術(shù)有限公司