組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法中，卵母細(xì)胞的處理時期為生發(fā)泡期至第一次減數(shù)分裂后末期；所述處理時間為18小時；所述組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚頋舛葹?.5-10ng/mL。本發(fā)明通過使用TSA短期處理體外成熟培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞增加了體細(xì)胞核在卵母細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性，使克隆胚胎激活前的組蛋白修飾與正常卵母細(xì)胞類似，并且顯著的提高了牛體細(xì)胞克隆胚胎的體外發(fā)育率及胚胎質(zhì)量。
【專利說明】組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，人們已在不同物種中利用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)出了克隆動物。但是，克隆動物出生率低，后代發(fā)育異常制約著該項技術(shù)的廣泛應(yīng)用。隨著研究的不斷深入，體細(xì)胞核在受體胞質(zhì)中的不完全重編程或重編程異常是導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育異常的重要原因。正常受精及胚胎發(fā)育過程中，DNA修飾經(jīng)歷甲基化的去除和重建，組蛋白的修飾也經(jīng)歷動態(tài)變化。然而，在克隆胚胎的早期發(fā)育過程中則存在異常高DNA水平，以及異常的組蛋白修飾。
[0003]組蛋白氨基酸殘基的修飾包括磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化、蘇素化、ADP核糖基化、脯氨酸異構(gòu)化等，這些修飾導(dǎo)致染色體構(gòu)象的改變，從而調(diào)控基因的表達(dá)、沉默。組蛋白賴氨酸乙?；?、甲基化在基因表達(dá)調(diào)控及染色體構(gòu)象變化中起重要作用。組蛋白乙?；揎検芤阴；D(zhuǎn)移酶、去乙?；?HDAC)的調(diào)節(jié)，去乙?；富钚缘囊种疲瑢?dǎo)致細(xì)胞組蛋白乙?；黠@增加，激活沉默的基因表達(dá)。
[0004]TSA是一種可逆的組蛋白去乙?；敢种苿?。TSA處理牛供體細(xì)胞可顯著增加體細(xì)胞的組蛋白乙?；剑菦]有促進(jìn)克隆胚胎的發(fā)育和重編程。當(dāng)使用該藥物處理早期克隆胚胎時，明顯改善了?？寺∨咛サ捏w外發(fā)育。但是，是否促進(jìn)了正常重編程的發(fā)生還不清楚。然而，目前還未見到相關(guān)該藥物處理牛卵母細(xì)胞對牛克隆胚胎和重編程影響的報道。
[0005]卵母細(xì)胞成熟過程需要多種酶的周期調(diào)控，并且進(jìn)入卵母細(xì)胞中的體細(xì)胞核也同樣受到卵母細(xì)胞內(nèi)酶類的調(diào)控。因此，卵母細(xì)胞的胞質(zhì)環(huán)境在調(diào)控體細(xì)胞核表觀遺傳重編程方面起著更為關(guān)鍵的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法及其應(yīng)用；通過使用TSA短期處理體外成熟培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞增加了體細(xì)胞核在卵母細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性，使克隆胚胎激活前的組蛋白修飾與正常卵母細(xì)胞類似，并且顯著的提高了牛體細(xì)胞克隆胚胎的體外發(fā)育率及胚胎質(zhì)量。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0008]一種組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砼囵B(yǎng)卵母細(xì)胞的方法，其特征是，所述卵母細(xì)胞的處理時期為生發(fā)泡期至第一次減數(shù)分裂后末期；所述處理時間為18小時；所述組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚頋舛葹?.5-10ng/mL。
[0009]優(yōu)選的，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑的處理濃度為Ing/mL。
[0010]優(yōu)選的，其特征是，所述組蛋白去乙?；敢种苿門SA，其中，TSA為Trichostatin A0[0011]本發(fā)明還提供了組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砼囵B(yǎng)卵母細(xì)胞的方法在改善牛體細(xì)胞克隆胚胎制備技術(shù)中的應(yīng)用。
[0012]采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明通過使用TSA短期處理體外成熟培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞增加了體細(xì)胞核在卵母細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性，使克隆胚胎激活前的組蛋白修飾與正常卵母細(xì)胞類似，并且顯著的提高了牛體細(xì)胞克隆胚胎的體外發(fā)育率及胚胎質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]附圖1不同來源重構(gòu)胚融合2hr后不同組蛋白乙?；揎椢稽c的免疫細(xì)胞化學(xué)染色的動態(tài)變化研究；
[0014]附圖2體外成熟牛卵母細(xì)胞MII期不同組蛋白乙?；揎椢稽c的免疫細(xì)胞化學(xué)染色；
[0015]附圖3TSA處理卵母細(xì)胞對激活前重構(gòu)胚染色質(zhì)穩(wěn)定性的影響；
[0016]附圖4TSA處理卵母細(xì)胞激活前重構(gòu)胚正常核型率統(tǒng)計。
[0017]其中，附圖1 中，A、A’ -G, Gf:未處理重構(gòu)胚融合 2hr 后 H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色:卵母細(xì)胞處理組后的重構(gòu)胚融合2hr后H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色。標(biāo)尺所示為50 μ m。
[0018]附圖2 中，A、A，、A”_D、D’、D”:體外成熟牛卵母細(xì)胞 MII 期 H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色。
[0019]附圖3中，A、A ’，B、B’為未處理組供體細(xì)胞染色體。A、A’:融合2hr(F2h) ;B、B，:融合 4hr(F4h)。C、C，，D、D，為 Ing/mL TSA 處理組。C、C，:融合 2hr(F2h) ;D、D，:融合4hr (F4h) ;A、B、C、D:DNA ;A’、B’、C，、D’:DNA+Tubulin。標(biāo)尺所示為 50 μ m。
[0020]附圖4中，字母不同表示組間存在顯著性差異(P < 0.01)。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0022]如附圖1-4所示，
[0023]1、TSA處理卵母細(xì)胞及其核型檢測
[0024]用帶18#針頭的IOmL注射器吸取卵巢表面直徑為2_8mm的卵泡，在體視顯微鏡下收集卵泡液中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在成熟培養(yǎng)液(M199+25mmol/L Hepes+0.38mmol/L 丙麗酸納+10 μ g/mL FSH+1 μ g/mL17_ β 雌二醇+50 μ g/mL 青霉素+100 μ g/mL鏈霉素+10% FBS)中清洗3_4遍，將80-100個COCs置于預(yù)平衡，且覆蓋礦物油的含有 0.5ng/mL、lng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL 和 10ng/mL TSA 藥物的 ImL 成熟培養(yǎng)液中，在38.5°C、5% CO2和飽和濕度條件下，成熟培養(yǎng)18小時后，去除藥物繼續(xù)培養(yǎng)至24小時進(jìn)行孤雌激活處理，或藥物處理后直接進(jìn)行克隆胚胎的制備。
[0025]經(jīng)TSA處理的卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定處理后組蛋白乙?；胶头治雎涯讣?xì)胞核型顯示，從Ing/mL開始即顯著影響了卵母細(xì)胞組蛋白的修飾。然而，隨著TSA濃度的增加，卵母細(xì)胞成熟率明顯下降，當(dāng)TSA濃度大于2.5ng/mL時，成熟率與其他各組出現(xiàn)顯著性差異，較低濃度TSA沒有影響卵母細(xì)胞的成熟。但是經(jīng)高濃度藥物處理后，減數(shù)分裂明顯被抑制于MI期。
[0026]將處理18小時的卵母細(xì)胞繼續(xù)在無藥物培養(yǎng)液中培養(yǎng)至24小時后，進(jìn)行孤雌激活發(fā)育，見下表1。Ing/mL TSA處理組明顯促進(jìn)了孤雌囊胚的發(fā)育，而隨著藥物濃度的不斷增加，孤雌胚胎的發(fā)育率逐漸下降。因此，Ing/mLTSA效果較好。
[0027]表1TSA處理牛卵母細(xì)胞對成熟及孤雌胚胎發(fā)育的影響
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理卵母細(xì)胞的方法，其特征是，所述卵母細(xì)胞的處理時期為生發(fā)泡期至第一次減數(shù)分裂后末期；所述處理時間為18小時；所述組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚頋舛葹?.5-10ng/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法，其特征是，所述組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚頋舛葹镮ng/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法，其特征是，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為TSA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砺涯讣?xì)胞的方法在改善牛體細(xì)胞克隆胚胎制備 技術(shù)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/877GK103468639SQ201310404283
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月31日
【發(fā)明者】吳俠, 于海泉 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)