一類新穎的以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的治療用分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了預防和治療病原感染的新的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供的化合物具有將此化合物錨定到靶細胞表面的錨定域和能在細胞外作用以防止病原體(例如病毒)對靶細胞的感染的治療域。本發(fā)明也包括具有唾液酸酶活性的治療組合物，此組合物含具有唾液酸酶催化域的基于蛋白的化合物。本發(fā)明化合物可用于治療或者預防病原體感染，并且可用于治療和減少過敏及發(fā)炎反應。本發(fā)明也提供了用于提高重組病毒向靶細胞轉(zhuǎn)導的組合物和方法。這些組合物和方法可在基因治療中得以運用。
【專利說明】一類新穎的以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的治療用分子
[0001]本申請是申請日為2005年7月21日，申請?zhí)枮椤?00580037226.8”，發(fā)明名稱為“一類新穎的以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的治療用分子”的申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
[0003]本申請要求美國專利申請序列號為10/939,262的專利的優(yōu)先權(quán)，該專利 申請日期:為2004年9月10日，名稱為“一類新穎的治療用蛋白質(zhì)分子(Novel Class ofTherapeutic Protein Based Molecules) ”,且已通過引用整體結(jié)合到本文中。
[0004]以下專利申請也通過引用整體結(jié)合到了本申請中: 申請日期:為2003年11月21日的第10/718,986號美國專利申請，名稱為“一種廣譜抗病毒治療方法和預防方法(Broadsoectrum ant1-viral therapeutics and prophylaxis)，，； 申請日期:為 2002 年 11 月 22 日的第60/428，535號美國臨時專利申請，名稱為“一種廣譜抗病毒治療方法和預防方法(Broadsoectrum ant1-viral therapeutics and prophylaxis)，，； 申請日期:為 2003 年 4 月 19 日的第60/464,217號美國臨時專利申請，名稱為“一類廣譜抗病毒蛋白(Class of broadspectrum ant1-viral protein) ”; 申請日期:為 2004 年 4 月 13 H 的第 60/561, 749 號美國臨時專利申請，名稱為“一種抗微生物治療方法和預防方法(Ant1-microbial therapeuticsand prophylaxis)”； 申請日期:為2004年6月16日的第60/580，084號美國臨時專利申請，名稱為“一類廣譜抗微生物劑(Class of broad spectrum ant1-microbial agents) ”。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及可用于預防和治療病原體對人類和動物患者的治療用組合物，特別涉及可用于預防和治療病毒或病菌感染的基于蛋白的治療用組合物。本發(fā)明也涉及用于預防或者改善過敏及發(fā)炎反應的基于蛋白的治療用組合物。本發(fā)明也涉及用于提高重組病毒轉(zhuǎn)導效率的基于蛋白的組合物，如用于基因治療的重組病毒。
[0006]發(fā)明背景
[0007]流行性感冒自從遠古時期就在人類中傳播，是一個具高度傳染力的急性呼吸道疾病。其特性是分年度周期性發(fā)生，并定期發(fā)生世界性大流行。因流感具有高發(fā)病率和死亡率，它對社會經(jīng)濟直接或者間接的影響很巨大。每年僅在美國的流行就導致幾乎有300，000人住院治療和25，000人死亡。在上一世紀發(fā)生的4次大流行總共導致了數(shù)億人死亡?；谠缙诹餍袣v史的數(shù)學模型估計，下次大流行時可能將有89，000-207，000人死亡，出現(xiàn)
I,800-4，200 萬個就診病人和另外 2，000-4，700 個病人(Meltzer, MI, Cox, NJ 和 Fukuda,K.(1999)Emerg Infect Dis5:659-671)。
[0008]流感主要是由兩種類型的病毒感染導致:流感病毒A和流感病毒B (第三種類型流感病毒C僅能導致輕微的類似普通感冒的癥狀)。他們屬于RNA病毒的正粘病毒科。A和B兩種類型的病毒均具有8個分節(jié)負鏈RNA基因組，包被在源自宿主細胞的脂質(zhì)膜中。此病毒包膜上覆蓋著由三種類型的蛋白質(zhì)組成的刺突:負責將病毒附著到宿主細胞受體和介導病毒和細胞膜融合的血凝素(HA)、負責從寄主細胞釋放新病毒的唾液酸苷酶(NA)和數(shù)量不多的作為離子通道的M2蛋白質(zhì)。[0009]流感A和B類型病毒的感染一般開始于上呼吸道粘膜的表面。病毒的復制主要限于上呼吸道，但可擴展到下呼吸道并導致支氣管肺炎，這可能致死。
[0010]流感病毒蛋白血凝素(HA)是主要的病毒包膜蛋白。它在病毒感染過程中起著重要的作用。HA的重要性已被它是宿主免疫反應產(chǎn)生的保護性的中和抗體的主要作用目標的事實證實(Hayden, FG.(1996) In Antiviral drug resistance (ed.D.D.Richma), 59-77頁.Chichester, UK John ffilev&Sons Ltd.)?，F(xiàn)在較清楚的是HA對病毒感染具有兩個不同的功能。第一，HA負責將病毒附著到唾液酸細胞的受體上；第二，HA介導病毒進入靶細胞，引發(fā)病毒包膜和細胞膜的融合。
[0011]HA作為前體蛋白HAO合成 ，HAO以三聚體分子形式從細胞器高爾基體轉(zhuǎn)移到細胞表面，然后被剪切成C端HAl (ΗΑ0的第328個殘基)和N端HA2。一般認為此剪切發(fā)生在細胞表面或在已釋放的病毒上。HAO被剪切成HA1/HA2對于HA結(jié)合到唾液酸受體上不是必需的。然而，一般認為這對于病毒的感染性來說是必要的(Klenk，HD和Rott，R.(1998)Adv Vir Res.34:247-281 ；Kido, H, Niwa, Y, Beppu, Y 和 Towatari, T.(1996) Advan EnzymeRegul36:325-347 ；Skehel, JJ 和 Wiley，DC.(2000) Annu Rev Biochem69:531-569 ；Zambo,M.(2001)Rev MedVirolll:227-241.)。
[0012]目前，流感通過流感疫苗和抗病毒化合物控制。滅活的流感疫苗目前用于全世界，特別是用在高危人群中。這些疫苗病毒在受精雞蛋中生長，通過化學手段滅活并純化。這些疫苗通常為三價的，包括典型的流感A病毒(H1N1和H3N2)和流感B病毒株。這些疫苗株需要經(jīng)常更新以保持功效，世界健康組織(WHO)在協(xié)調(diào)這一工作。在流感流行期間，更新流感疫苗并供給市場通常需要8個月時間(Wood，J.(2000) Phi I Trans R Soc Lond B356:1953-1960)。然而，歷史上流行流感曾在6個月內(nèi)傳播到大多數(shù)大洲，并且預期未來流感會由于國際旅行增加而傳播更快(Gust, ID, Hampson, A ff.,和Lavanchy, D.(2001) Rev MedVirolll:59-70)。所以，在未來的流感大流行的第一波中，不能得到一種有效的疫苗或者其很短缺的情況是不可避免的。
[0013]抗病毒化合物已成為治療兩次流感暴發(fā)之間的病癥的首選藥物。目前，它們也是人們在疫苗不可用之前的控制流感的最初的時期內(nèi)的僅有選擇。市場上目前有兩類抗病毒化合物:M2抑制劑，如金剛烷胺和金剛烷乙胺；NA抑制劑，包括奧斯他韋(達菲)和扎那米韋(樂瑞沙)。兩種分子均被證實在預防和治療流感上有效。然而，將它們廣泛用于化學預防時仍需顧慮的兩個因素是其副作用和產(chǎn)生抗藥病毒的風險(Hayden，F(xiàn)G.(1996)In Antiviral drug resistance (ed.D.D.Richman),59-77 頁.Chichester, UK:Johnffiley&Sons Ltd)。最重要的是，未來自然進化的或者在生物戰(zhàn)爭中通過基因工程人工創(chuàng)造的流感病毒株可能對所有可用的抗病毒化合物有抗性，并且這將導致全球性的破壞。
[0014]總之，目前可用的疫苗和抗病毒化合物受限于一些其本質(zhì)上的缺陷。將來的流感大流行需要使用新穎的治療和預防的藥物形式。
[0015]呼吸道感染(RTI)是易傳染疾病的最常見且最有潛在危險的典型癥狀。臨床上RTI包括竇炎、耳炎、咽喉炎、支氣管炎和肺炎。根據(jù)病因?qū)W和流行病學研究，現(xiàn)已較明白，雖然許多微生物可能導致RTI，但在大多數(shù)情況下，僅有少數(shù)的病原體是RTI發(fā)生的病因。這些病原體包括肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他摩拉菌、流感病毒A及B和副流感病毒。除了導致CAP和AECB外，許多細菌病原體，如肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌，也通常引起急性竇炎和中耳炎并導致膿毒癥、腦膜炎等侵襲性感染。因此這些微生物在臨床上最具重要性。
[0016]所有的呼吸道病原細菌的普遍特征之一是在上部氣管粘膜表面建立共生群，這些集群在感染前形成并且是感染發(fā)生的先決條件。細菌群在嬰兒出生后不久就出現(xiàn)了。人的一生中，在上部氣管，特別是鼻咽和口咽中，維持一個動態(tài)的微生物生態(tài)保留地，它獲得細菌，消滅細菌，繼而又重新獲得細菌。在大多數(shù)情況下，咽內(nèi)細菌群落是無害的。然而，當寄主的情況發(fā)生變化時，一些微生物可能侵犯相鄰的組織或者血流而導致疾病。鼻咽除了作為細菌和病毒進入粘膜及侵襲性感染的港口外，也是個體間病原微生物傳播的主要源頭，并也是具抗生素抗性的細菌被選擇的地方(Garcia-Rodriguez和Martinez, J AntimicrobChemother, (2002)50 (Suppl S2) ,59-73 ；Soriano 和 Rodriguez-Cerrato, J AntimicrobChemother, (2002) 50Suppl S2，51-58)。臨床上很確信，易感RTI的個體易成為病原細菌的持續(xù)的和循環(huán)的攜帶者(Garcia-Rodriguez 和 Martinez, J Antimicrob Chemother,(2002) 50 (Suppl S2)，59-73 ；Mbaki 等，Tohku J Exp.Med.，(1987) 153 (2)，111-121)。
[0017]幽門螺桿菌是導致胃炎和胃潰瘍的人類病原體。此細菌寄生于人胃并附著在胃竇的上皮細胞。已被證實此細菌的粘附是以幽門螺桿菌連接素I和II為媒介而結(jié)合到上皮表面的唾液酸上。
[0018]Siglecs(唾液 酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素)是結(jié)合于唾液酸上的免疫球蛋白(Ig)超家族，主要在造血系統(tǒng)細胞中表達。已發(fā)現(xiàn)至少有11種Siglecs，且它們似乎作為配基專門識別細胞表面的唾液酸。人們相信Siglecs結(jié)合到唾液酸介導細胞-細胞粘附和相互作用(Crocker 和 Varki, Trends Immunol., (2001) 22 (6), 337-342 ;Angata和 Brinkman-Van der Linden, Biochim.Biophys.Acta, (2002) 1572(2-3),294-316)。Siglec-8(SAF-2)是一種粘附分子，嚴格限于嗜曙紅細胞、嗜堿細胞、肥大細胞表面，這些細胞是過敏癥狀，包括過敏性鼻炎、哮喘和濕疹的主要效應細胞。人們認為Siglec-8負責介導將三種類型過敏細胞補充到氣管、肺和其它過敏位點。Siglec-1(唾液酸糖蛋白)和Siglec-2 (CD22)是巨噬細胞和B細胞上的粘附分子，兩種細胞類型在免疫反應中起中心作用，導致發(fā)炎。
[0019]重組病毒，尤其是腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV),可用于轉(zhuǎn)移野生型囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子(CFTR)基因到上皮細胞，以糾正導致囊腫性纖維化的基因缺陷(Flotte 和 Carter, Methods Enzymo1.，(1998)292,717-732)。臨床上用 AAV 載體試驗，已顯示其能夠?qū)FTR基因有效地轉(zhuǎn)移到上皮細胞上并安全釋放，伴隨有低水平的基因轉(zhuǎn)移(Wagner 等，Lancet，(1998) 351 (9117)，1702-1703)。與腺病毒載體相比，AAV 使基因表達更穩(wěn)定并降低了細胞免疫性。然而，體內(nèi)AAV在肺中的轉(zhuǎn)導效率相當?shù)?Wagner等，Lancet, (1998) 351 (9117)，1702-1703)。需要一種可以提高體內(nèi)AAV轉(zhuǎn)導效率的方法，以在囊腫纖維化的治療方面充分挖掘基因療法的治療潛力。已證實帶負電荷的碳水化合物，例如唾液酸，抑制AAV載體向高度分化的氣管上皮細胞的轉(zhuǎn)導效率，并且通過用糖苷酶，包括一種唾液酸苷酶和內(nèi)糖苷酶H，處理氣管上皮細胞，增強了此AAV載體的轉(zhuǎn)導效率(Bals等，J Virol.，(1999)73(7)，6085-6088)。
[0020]發(fā)明概述
[0021]本發(fā)明認識到目前的預防和治療病原體感染的療法常常很難及時供利用，可能帶來不需要的副作用，并可能產(chǎn)生抗藥病原菌株。本發(fā)明也認識到目前治療過敏和發(fā)炎的方式效果有局限，并且具有副作用。此外，本發(fā)明也認識到目前重組病毒的方法所具有的轉(zhuǎn)導效率低和基因治療的效果不令人滿意。
[0022]本發(fā)明提供預防和治療病原感染的新的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供可以在細胞外活動的化合物以預防病原對細胞的感染。本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案為治療用化合物，其具有將自身錨定到靶細胞的表面的錨定域，并且具有可在細胞外活動以防止病毒和細菌等病原感染靶細胞的治療域。
[0023]一方面，本發(fā)明提供一種基于蛋白的組合物，用于預防或者治療病原感染。此組合物由一種化合物組成，此化合物含有至少一個治療域和至少一個可附著到或者接近靶細胞的細胞膜的錨定域，其中治療域含有至少一種能防止病原感染靶細胞的具有細胞外活性的肽或蛋白質(zhì)。
[0024]本發(fā)明在此方面的實施方案中，此至少一治療域具有預防或者阻止病原對靶細胞的感染的抑制活性。在一優(yōu)選的實施方案中，此活性可抑制一種蛋白酶的活性，這種蛋白酶可加工感染靶細胞必需的病毒蛋白。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，此化合物包括一個治療域，其可以抑制流感病毒的HA蛋白的加工，并且此錨定域可將此化合物附著到呼吸上皮細胞的表面。
[0025]在本發(fā)明的一些實施方案中，至少一個治療域具催化活性。在一個優(yōu)選實施方案中，此催化活性移走感染靶細胞所必需的靶細胞表面的一部分。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，此治療域是唾液酸酶，其可在上皮靶細胞的表面消化唾液酸成分，并且此錨定域是人類蛋白的GAG結(jié)合 域，它可在上皮細胞的表面結(jié)合肝素或者硫酸乙酰肝素成分。
[0026]在另一方面，本發(fā)明包括治療或者防止病原在生物體內(nèi)的感染的藥物組合物。藥物組合物包括本發(fā)明中的一種化合物，該化合物包括至少一個治療域和至少一個錨定域。此藥物組合物也可包括溶液、穩(wěn)定劑、填充物和類似物。在某些優(yōu)選的實施方案中，此藥物組合物以吸入劑的形式配成。在一些優(yōu)選的實施方案中，此藥物組合物配成鼻噴霧劑。
[0027]本發(fā)明的另一個方面是此藥物組合物含至少一種唾液酸酶。此唾液酸酶可為從任何來源中分離出的蛋白，舉例說來，如一種細菌或者哺乳動物源的，或可以是與一種自然中存在的唾液酸基本同源的重組蛋白。含唾液酸酶的藥物組合物可調(diào)制成鼻、氣管、支氣管、口腔或者局部用藥，或者可配成可注射的溶液或者滴眼液。含唾液酸酶的藥物組合物可用于治療或防止病原感染，用于治療或者預防過敏或發(fā)炎反應，或用于增強基因治療時重組病毒的轉(zhuǎn)導效率。
[0028]本發(fā)明的另一個方面是一種唾液酸催化域蛋白。在這一方面，此蛋白質(zhì)所含的唾液酸酶催化域并非整個唾液酸酶，其來源于被認為是唾液酸酶催化域的蛋白質(zhì)。唾液酸酶催化域蛋白可包括其他蛋白質(zhì)序列，例如(但不局限于)源于其他蛋白的功能域。含這種唾液酸酶的藥用組合物可被調(diào)制成鼻子、氣管、支氣管、口腔或者局部用藥，或者可配成可注射的溶液或者滴眼液。含這種唾液酸酶的藥物化合物可用于治療或預防病原感染，用于治療或者預防過敏或發(fā)炎反應，或用于增強基因治療時重組病毒的轉(zhuǎn)導效率。
[0029]本發(fā)明的第I方面提供了一種唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO: 12)的第270到290氨基酸的任一氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第665到901氨基酸的任一氨基酸結(jié)束；其中，所述唾液酸酶催化域蛋白缺少從第I個到第269氨基酸的序列組成的粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列，并且其中所述唾液酸酶催化域蛋白具唾液酸酶活性。
[0030]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其包括編碼本發(fā)明第I方面所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
[0031 ] 在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體內(nèi)。
[0032]在某些實施方式中，所述唾液酸酶催化域蛋白可包括SEQ ID NO:14。
[0033]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其包括編碼以上描述的包括SEQ ID NO:14的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
[0034]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。
[0035]在某些實施方式中，本發(fā)明第I方面所述的唾液酸酶催化域蛋白可包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)第270到290氨基酸的任一氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)第665到681氨基酸的任
一氨基酸殘基結(jié)束。
[0036]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其包括編碼包括上述氨基酸序列的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
[0037]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。
[0038]在某些實施方式中，所述唾液酸酶催化域蛋白可包括SEQ ID NO:16。
[0039]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其包括編碼上述包括SEQ ID NO:16的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
[0040]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。
[0041]在某些實施方式中，所述唾液酸酶催化域蛋白可包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ IDNO:12)的第274氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第681氨基酸殘基結(jié)束。
[0042]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其包括編碼包括上述氨基酸序列的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
[0043]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。
[0044]在某些實施方式中，所述唾液酸酶催化域蛋白可包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ IDNO:12)的第290氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第666氨基酸殘基結(jié)束。
[0045]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其包括編碼包括上述氨基酸序列的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
[0046]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。
[0047]在某些實施方式中，所述唾液酸酶催化域蛋白可包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ IDNO:12)的第290氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第681氨基酸殘基結(jié)束。
[0048]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其包括編碼包括上述氨基酸序列的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
[0049]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。[0050]本發(fā)明的第2方面提供了一種融合蛋白，其包括:
[0051]至少一個唾液酸酶的催化域；和
[0052]純化域、蛋白質(zhì)標簽、蛋白質(zhì)穩(wěn)定域、溶解度域、蛋白質(zhì)大小增加域、蛋白質(zhì)折疊域、蛋白質(zhì)定位域、錨定域、N-末端結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域、催化活性域、結(jié)合域或催化活性增強域。
[0053]在某些實施方式中，所述融合蛋白還可包括至少一個肽連接子。
[0054]在某些實施方式中，所述融合蛋白的所述催化域可以是與產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶的催化域基本同源的，與粘性放線菌唾液酸酶基本同源的、與產(chǎn)尿素節(jié)桿菌唾液酸酶基本同源的、與生綠小單孢菌唾液酸酶基本同源的、與人Neu2唾液酸酶基本同源的或者與人Neu4唾液酸酶基本同源的。
[0055]所述催化域可以是與粘性放線菌唾液酸酶的催化域基本同源的。優(yōu)選地，所述催化域可包括SEQ ID NO:16o優(yōu)選地，所述融合蛋白可包括至少一個蛋白質(zhì)純化域。所述至少一個蛋白質(zhì)純化域可為組氨酸標簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合域、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)合域、內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)域或者幾丁質(zhì)結(jié)合域。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)純化域可為組氨酸標簽。更優(yōu)選地，所述的融合蛋白可包括SEQ ID NO:18。
[0056]所述融合蛋白可包括至少一個錨定域。所述錨定域可為GAG結(jié)合域。優(yōu)選地，所述的錨定域可以是與人血小板因子4(SEQ ID NO:2)的GAG結(jié)合域基本同源的，與人白細胞介素8 (SEQ ID NO:3) 的GAG結(jié)合域基本同源的，與人抗凝血酶III (SEQ ID NO:4)的GAG結(jié)合域基本同源的，與人載脂蛋白E(SEQ IDNO:5)的GAG結(jié)合域基本同源的，與人脈管關(guān)聯(lián)遷移蛋白(SEQ ID NO:6)的GAG結(jié)合域基本同源的，或與人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO:7)的GAG結(jié)合域基本同源的。更優(yōu)選地，所述的錨定域可以是與人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO: 7)的GAG結(jié)合域基本同源的。更優(yōu)選地，所述的錨定域包括人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO:7)的GAG結(jié)合域。更優(yōu)選地，所述的唾液酸酶的催化域包括SEQ ID NO:16。更優(yōu)選地，所述融合蛋白包括SEQ IDNO:20o
[0057]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其編碼本發(fā)明第2方面所述的融合蛋白。
[0058]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。
[0059]在某些實施方式中，所述核酸分子可包括SEQ ID NO:19。優(yōu)選地，所述核酸分子可在表達載體中。
[0060]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 25。
[0061]本發(fā)明的又一方面提供了一種核酸分子，其編碼包括SEQ ID NO:25的融合蛋白。
[0062]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。優(yōu)選地，所述核酸分子可包括SEQ IDNO:24ο
[0063]在某些實施方式中，所述核酸分子可在表達載體中。
[0064]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 38。
[0065]在某些實施方式中，所述融合蛋白還可包括連接所述人雙調(diào)蛋白GAG結(jié)合域到所述唾液酸酶的催化域的肽連接子。優(yōu)選地，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO:35。
[0066]本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，其編碼上述包括SEQ ID NO:35的融合蛋白。[0067]在某些實施方式中，所述核酸分子可包括SEQ ID NO:34。
[0068]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述包括SEQ ID NO:34的核酸分子。
[0069]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 37。
[0070]本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，其編碼上述包括SEQ ID NO:37的融合蛋白。
[0071]在某些實施方式中，所述核酸分子可包括SEQ ID NO:36。
[0072]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述包括SEQ ID NO:36的核酸分子。
[0073]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 39。
[0074]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 27。
[0075]本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，其編碼上述包括SEQ ID NO ,21的融合蛋白。
[0076]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述編碼包括SEQ ID NO:27的融合蛋白的核酸分子。
[0077]在某些實施方式中，所述核酸分子可包括SEQ ID NO:26。
[0078]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述包括SEQ ID NO:26的核酸分子。
[0079]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 29。
[0080]本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，其編碼上述包括SEQ ID NO:29的融合蛋白。
[0081]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述編碼包括SEQ ID NO:29的融合蛋白的核酸分子。
[0082]在某些實施方式中，所述核酸分子可包括SEQ ID NO: 28。
[0083]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述所述包括SEQ ID NO:28的核酸分子。
[0084]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 31。
[0085]本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，其編碼上述包括SEQ ID NO:31的融合蛋白。
[0086]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述編碼包括SEQ ID NO:31的融合蛋白的核酸分子。
[0087]在某些實施方式中，所述核酸分子可包括SEQ ID NO:30。
[0088]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述包括SEQ ID NO:30的核酸分子。
[0089]在某些實施方式中，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO: 33。
[0090]本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，其編碼上述包括SEQ ID NO:33的融合蛋白。
[0091]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述編碼包括SEQ ID NO:33的融合蛋白的核酸分子。[0092]在某些實施方式中，所述核酸分子可包括SEQ ID NO:32。
[0093]本發(fā)明的另一方面提供了一種表達載體，其包括上述包括SEQ ID NO:32的核酸分子。
[0094]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括唾液酸酶。
[0095]在某些實施方式中，所述唾液酸酶可以是與產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶至少一部分基本同源的，與粘性放線菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與產(chǎn)尿素節(jié)桿菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與生綠小單孢菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與人Neu2唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與人Neu4唾液酸酶的至少一部分基本同源的。
[0096]優(yōu)選地，所述唾液酸酶可以是與粘性放線菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的。
[0097]更優(yōu)選地，所述唾液酸酶可包括SEQ ID NO:12.[0098]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括本發(fā)明第I方面所述的唾液酸酶催化域蛋白。
[0099]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括本發(fā)明第I方面所述的唾液酸酶催化域蛋白，所述唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)第270到290氨基酸的任一氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)第665到681氨基酸的任一氨基酸殘基結(jié)束。
[0100]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括本發(fā)明第2方面所述的融合蛋白。
[0101]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括本發(fā)明第2方面所述的融合蛋白，所述融合蛋白的唾液酸酶的催化結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO:16o
[0102]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括上述包括SEQ ID NO:25的融合蛋白。
[0103]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括上述包括SEQ ID NO:27的融合蛋白。
[0104]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成噴霧劑。
[0105]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成吸入劑。
[0106]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成注射用溶液。
[0107]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成滴眼液。
[0108]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成霜、藥膏、凝膠或軟膏。
[0109]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成可口服給藥的藥丸、藥片、錠劑、懸浮液或溶液。
[0110]本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或者預防由流感、副流感病毒或者呼吸道合胞病毒引起的病毒感染的方法，其包括:
[0111]將以上描述本發(fā)明的藥物制劑的治療有效量應用于受治療者的上皮細胞。
[0112]在某些實施方式中，所述應用可以是通過用鼻噴霧劑。
[0113]在某些實施方式中，所述應用可以是通過用吸入劑。
[0114]在某些實施方式中，所述應用可以是以一天一到四次。
[0115]本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或者預防細菌病原體感染的方法，其包括:將以上描述本發(fā)明的藥物制劑的治療有效量給藥于受治療者。[0116]在某些實施方式中，所述病原體可為肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌或幽門螺桿菌。
[0117]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用鼻噴霧劑。
[0118]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用吸入劑。
[0119]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用局部給藥。
[0120]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用口服給藥。
[0121 ] 在某些實施方式中，所述給藥可以是以一天一到四次。
[0122]本發(fā)明的另一方面提供了一種治療和預防過敏或發(fā)炎的方法，其包括:用以上描述本發(fā)明的藥物制劑的治療有效量向受治療者給藥。
[0123]在某些實施方式中，所 述發(fā)炎可與哮喘、過敏性鼻炎、濕疹、牛皮蘚、接觸植物或動物毒素或者自體免疫疾患有關(guān)。
[0124]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用鼻噴霧劑。
[0125]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用吸入劑。
[0126]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用滴眼液。
[0127]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用局部使用。
[0128]在某些實施方式中，所述給藥可以是局部使用或者靜脈內(nèi)注射。
[0129]在某些實施方式中，所述給藥可以是以一天一到四次。
[0130]本發(fā)明的另一方面提供了一種由重組病毒載體增強基因遞送的方法，其包括:在給藥所述的重組病毒載體之前或者同時將以上描述本發(fā)明的藥物制劑的治療有效量給藥到受治療者的上皮細胞。
[0131]在某些實施方式中，所述重組病毒載體可為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體、腺病毒載體或者腺相關(guān)病毒載體。
[0132]在某些實施方式中，所述重組病毒載體可為重組的腺相關(guān)病毒載體。
[0133]在某些實施方式中，所述重組腺相關(guān)病毒載體可包括編碼囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子(CFTR)的基因。
[0134]在某些實施方式中，所述給藥可以是通過用吸入劑。
[0135]在某些實施方式中，所述給藥可以是以一天一到四次。
[0136]本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物制劑，其包括上述包括SEQ ID NO:27的融合蛋白的組合物。
[0137]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成噴霧劑。
[0138]在某些實施方式中，所述藥物制劑可配制成吸入劑。
[0139]本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或者預防流感感染的方法，其包括:將上述包括SEQ ID NO:27的融合蛋白組合物的治療有效量應用到受治療者的上皮細胞。
[0140]在某些實施方式中，所述應用可以是通過用鼻噴霧劑。
[0141]在某些實施方式中，所述應用可以是通過用吸入劑。
[0142]在某些實施方式中，所述應用可以是以一天一到四次。
[0143]在另一方面，本發(fā)明包括治療或者預防病原感染的方法。在優(yōu)選的實施方案中，此方法包括賦予生物體唾液酸酶活性，例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白，包括唾液酸酶催化域融合蛋白，以便預防或者治療感染。病原體可以是病毒或者細菌。此方法包括應用本發(fā)明化合物的有效藥量到至少一種生物體靶細胞。優(yōu)選地，藥物組合物可通過噴霧劑、吸入劑或者局部用藥藥劑而得以應用。
[0144]本發(fā)明也提供新的治療過敏和發(fā)炎的組合物和方法。尤其是，本發(fā)明提供可以在細胞外活動以預防或阻止發(fā)炎細胞粘附和活動的化合物。一些優(yōu)選的實施方案中的用于治療過敏或發(fā)炎的化合物包括至少一個具有所述的細胞外活性的治療域和至少一個錨定此化合物到靶細胞表面的錨定域。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括賦予生物體唾液酸酶活性，例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白，包括唾液酸酶催化域融合蛋白，以便預防或者治療過敏或者發(fā)炎反應。過敏或者發(fā)炎反應可以是哮喘、過敏性鼻炎、皮膚情況如濕疹，或?qū)χ参锘騽游锒舅氐姆磻４朔椒ò☉帽景l(fā)明化合物的有效藥量到至少一個生物體的靶細胞。更優(yōu)選地，藥物組合物可通過噴霧劑、吸入劑或者局部用藥藥劑而得以應用。
[0145]本發(fā)明也提供在基因治療中提高通過重組的病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率的新的組合物和方法。特別是本發(fā)明提供可在細胞外活動的化合物以便減少物理或化學障礙對基因治療載體(如AAV載體)的轉(zhuǎn)導的阻礙。本發(fā)明的提高通過重組病毒載體的基因轉(zhuǎn)導效率的一些優(yōu)選的化合物包括至少一個具有細胞外活性的治療域和至少一個錨定此化合物到靶細胞表面的錨定域。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括賦予生物體唾液酸酶活性，例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白，包括唾液酸酶催化域融合蛋白，以通過重組的病毒載體促進向靶細胞的轉(zhuǎn)導。此方法包括應用本發(fā)明的化合物的有效量和可一種重組病毒載體到至少一種靶細胞。本發(fā)明的藥物組合物可通過噴霧劑、吸入劑或者局部用藥藥劑而得以應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0146]圖1是抑肽酶氨基酸一級結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0147]圖2顯示4個人類基因的GAG結(jié)合序列:PF4,人血小板因子4 ;IL8,人白細胞介素8 ;ATIII，人抗凝血酶III ;ΑροΕ，人載脂蛋白E ；AAMP-人脈管關(guān)聯(lián)遷移蛋白。
[0148]圖3是人唾液酸酶NEU2和NEU4序列比對。
[0149]圖4是比較細菌和真菌唾液酸酶底物特異性的表格。
[0150]圖5顯示編碼His6-Av⑶的構(gòu)建體#1的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的Nco I和HindIII位點以粗體顯示。
[0151]圖6顯示編碼AR-Av⑶的構(gòu)建體#2的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的Nco I和HindIII位點以粗體顯示。
[0152]圖7顯示ARG4S_AvCD的構(gòu)建體#3的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的Nco I和HindIII位點以粗體顯示。
[0153]圖8為一實驗數(shù)據(jù)圖，顯示AR-標簽促進α (2，6)-連接的唾液酸移出MDCK細胞。Y坐標為用各種重組的AvCD (構(gòu)建體#1)(菱形)或重組的AvCD (構(gòu)建體#2)(方形)的稀釋劑處理后MDCK細胞 表面上的α (2，6)_連接的唾液酸的百分率。
[0154]圖9是顯示用來自構(gòu)建體#2重組AR-Ac⑶蛋白或從產(chǎn)尿素節(jié)桿菌分離的唾液酸酶處理的MDCK細胞得到的對流感病毒的抗感染效果。供試病毒株有:A/WS/33 (HlNl) ；A/PR/8 (HlNl) ;A/日本/305/57 (H2N2) ;A/維多利亞/504/2000 (H3N3) ;A/香港/8/68 (H3N2)；B/Lee/40 ；7.B/ 馬里蘭 /1/59 和土耳其 /Wis/66 (H9N2)。
[0155]圖10為重組AR-Av⑶唾液酸酶和重組AR-G4S-Av⑶唾液酸酶對流感病毒擴增的抑制水平圖。供試病毒株有:A/PR/8 (HlNl) ；A/WS/33 (HlNl) ;A/日本/305/57 (H2N2) ;A/香港 /8/68 (H3N2) ；B/Lee/40 ；7.B/ 馬里蘭 /1/59 和土耳其 /Wis/66 (H9N2)。
[0156]圖11顯示重組AR-Av⑶唾液酸酶融合蛋白局部用藥減少了流感病毒A(HlNl)病毒感染的雪貂的發(fā)炎反應。(A)感染后在顯示的時間內(nèi)來自受感染的動物的鼻分泌物的發(fā)炎細胞總數(shù)。(B)測定了受感染的雪貂的無細胞鼻分泌物中的蛋白質(zhì)濃度。受感染的雪貂用配藥液處理(方塊)或者用來自構(gòu)建體#2的重組AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白(三角形)。未受感染的動物也用重組AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白處理(菱形)。統(tǒng)計學顯著值用*(p< 0.05)和 **(p < 0.01)標記。
[0157]圖12以表格顯示本發(fā)明中兩種唾液酸酶催化域融合蛋白對病毒復制的抑制，細胞保護EC50’ C值和選擇指數(shù)。所有的EC50值單位為mU/ml。
[0158]圖13以表格顯示用本發(fā)明中的唾液酸酶催化域融合蛋白處理的雪貂和用對照配藥液處理的雪貂呼吸道中病毒的復制情況。
[0159]發(fā)明詳述
[0160]定義
[0161]除有特別定義外，所有在此用到的技術(shù)和科學術(shù)語具有的含義和本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的一致。一般來說，在此用到的術(shù)語和產(chǎn)品或描述的實驗過程為大家熟知并且通常在所屬領(lǐng)域應用。這些流程用的是常規(guī)的方法，如在所屬領(lǐng)域各種一般的文獻中所提供。當一個術(shù)語以單數(shù)形式規(guī)定出來，
【發(fā)明者】也提出此屬于的復數(shù)形式。當和部分的參考文獻中用到的術(shù)語和定義意思有分歧時，本專利申請用到的此術(shù)語使用在此給出的定義意思。在公開過程中使用的下列術(shù)語，除非另有規(guī)定，可被理解為下面的含義:
[0162]“病原體”可為任何病毒或者微生物體，其可感染細胞、組織或者有機體。病原體可為病毒、細菌或者原生動物。
[0163]“靶細胞”可為任何可被病原體感染的細胞，或者可與發(fā)炎細胞作用的任何細胞，或者是通過重組病毒轉(zhuǎn)移外源基因的預計的宿主細胞。
[0164]“重組病毒”或者“重組病毒載體”，“基因治療病毒載體”或者“基因治療載體”的定義是遺傳工程化的病毒，其包括一個或更多的外源基因。當靶細胞被重組病毒轉(zhuǎn)導時，外源基因被轉(zhuǎn)移到靶細胞。轉(zhuǎn)移到靶細胞的基因可在細胞中表達以便提供預計的治療效果。目前，大多數(shù)普遍應用的基因治療病毒載體都基于4種病毒類型:逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)和單純皰疫I型病毒。
[0165]“發(fā)炎細胞”為那些執(zhí)行或者參與免疫系統(tǒng)發(fā)炎反應的細胞。發(fā)炎細胞包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、NK細胞和單核細胞。
[0166]“可預防病原體感染靶細胞的細胞外活性”是任何一種能通過作用靶細胞或者在靶細胞外表面附近阻礙或者阻止病原體感染靶細胞的活性?？深A防病原體感染靶細胞的細胞外活性可為一種活性如(但不限于)催化活性或者抑制活性。例如，催化活性可為一種酶活性，其可降解病原體、靶細胞或者在靶細胞附近的一個或者更多的實體(例如連接子、受體或者酶，但不限于此)，此實體對感染過程有貢獻。催化活性也可修飾病原體、靶細胞或者在靶細胞附近的一個或者更多的實體，導致此實體的促進感染能力被削弱。抑制活性可為這樣一種活性，其可結(jié)合到受體或者連接子，防止此受體或者連接子結(jié)合到某部位，在此部位結(jié)合對于促進感染過程是必需的。抑制活性也可是一種防止酶或者受體行使對于促進感染過程必需的功能的一種酶或者受體的抑制因子。靶細胞的外部包括靶細胞膜本身，也包括包圍靶細胞的細胞外環(huán)境，包括細胞外基質(zhì)、細胞間隙和魯米諾空間。對上皮細胞而言，靶細胞外部也包括形成魯米諾內(nèi)襯的細胞膜頂端或魯米諾表面，以及魯米諾表面的細胞外環(huán)境?！翱深A防病原體對靶細胞的感染的細胞外活性”可為任何化學實體，包括蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸和肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合體、脂質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物等和包括這成分的任意組合。優(yōu)選地，此活性由肽或者蛋白質(zhì)組成，或與肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
[0167]“可提高重組病毒的轉(zhuǎn)導效率或基因轉(zhuǎn)化效率的細胞外活性”可為任何一種可減少或消除重組病毒進入寄主細胞的物理或化學障礙的，作用于靶細胞或者靶細胞外表面附近的活性?？商岣咧亟M病毒的轉(zhuǎn)導效率或基因轉(zhuǎn)化效率的細胞外活性可為一種活性如(但不限于)催化活性或者抑制活性。例如，催化活性可為一種降解病原體上、靶細胞上或臨近靶細胞處一個或多個實體(如配體、受體或酶)的酶活性，此實體對感染過程有貢獻。催化活性也可修飾病原體、靶細胞或者在靶細胞附近的一個或者更多的實體，導致此實體的促進感染能力被削弱。抑制活性可為這樣一種活性，其可結(jié)合到受體或者連接子，防止此受體或者連接子結(jié)合到某部位，在此部位結(jié)合對于促進感染過程是必需的。抑制活性也可是一種防止酶或者受體行使對于促進感染過程必需的功能的酶或者受體的抑制因子。靶細胞的外部包括靶細胞膜本身，也包括包圍靶細胞的細胞外環(huán)境，包括細胞外基質(zhì)、細胞間隙和魯米諾空間。對上皮細胞而言，靶細胞外部也包括形成魯米諾內(nèi)襯的細胞膜頂端或魯米諾表面，以及魯米諾表面的細胞外環(huán)境?！翱深A防病原體對靶細胞的感染的細胞外活性”可為任何化學實體，包括蛋白質(zhì)、多 肽、肽、核酸和肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合體、脂質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物等和包括這成分的任意組合。特別是，此活性由肽或者蛋白質(zhì)組成，或與肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
[0168]“可阻止發(fā)炎細胞粘連或者發(fā)揮功能的細胞外活性”可為任何能預防發(fā)炎細胞接觸靶細胞和影響靶細胞的正常物理狀態(tài)的活性。
[0169]“能錨定所述至少一種治療域到靶細胞的細胞膜上的結(jié)構(gòu)域”，也稱為“細胞外錨定域”，簡單地說，“錨定域”指可穩(wěn)定結(jié)合在細胞表面或者位于細胞表面外部的或者非常接近細胞表面的一部分的化學實體。細胞外錨定域可逆或不可逆地的連接到一個或多個部位，例如，優(yōu)選地是可結(jié)合于一個或多個治療域，因此導致一個或多個被粘附的治療用部分居留在或非常接近真核細胞的外表面。優(yōu)選地，細胞外錨定域結(jié)合至少一個靶細胞表面的分子或者至少一個與靶細胞表面非常緊密聯(lián)系的分子。例如，細胞外錨定域可結(jié)合一個與靶細胞細胞膜共價或非共價聯(lián)系的分子，或者結(jié)合圍繞靶細胞的細胞外基質(zhì)中的分子。細胞外錨定域優(yōu)選是肽、多肽或者蛋白質(zhì)，也可包含任何化學實體的附加類型，包括一個或多個附加蛋白、多肽或肽，核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合物、脂質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物和任意這些成分的結(jié)合物。
[0170]此處用到的蛋白質(zhì)或者肽序列與引用序列“充分同源”是指其與參照序列一致或缺失一個或更多的氨基酸、多一個或更多氨基酸以及保守性替換一個或更多氨基酸，但保留了與參照序列相同的或者基本上相同的活性。保守性替換可定義為發(fā)生于下列五組情況下的置換:
[0171]I小的、脂肪族的、無極性或者極性很小的殘基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
[0172]II極性的，帶負電的殘基和其酰胺化合物:Asp、Asn、Glu、Gln
[0173]III極性的，帶正電的殘基:His、Arg、Lys
[0174]IV大的、脂肪族的非極性殘基:Met、Leu、Ile、Val、CyS
[0175]V大的芳香族的殘基:Phe、Try、Trp
[0176]在下列組中，下列替換被認為是“高度保守”的:Asp/Glu、His/Arg/Lys、Phe/Tyr/Trp和Met/Leu/Ile/Val。半保守替換定義為(I) - (IV)組內(nèi)其中兩組間的置換，其限于包括上述的(I)、(II)和(III)組的超組㈧的或者限于包括上述的(IV)和(V)組的超組⑶。此外，本專利申請中指定的疏水的氨基酸為Ala、Gly、Pro、Met、Leu、lie、Val、Cys, Phe和Trp,而親水的氨基酸為 Ser、Thr、Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Lys 和 Tyr。
[0177] “唾液酸酶”是能將唾液酸殘基從底物分子移出的酶。此唾液酸酶(N-酰基神經(jīng)氨甘油水解酶，EC3.2.1.18)是一組酶，其能將唾液酸殘基從唾液酸結(jié)合糖中移出。唾液酸是具有9-碳骨架的α酮酸，經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)粘附于糖蛋白和糖脂的寡糖鏈的突出端。唾液酸的一種主要類型是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，它是其他大多數(shù)類型唾液酸的生物合成前體。底物分子可為以下例子但不限于此:寡糖、多聚糖、糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂或者合成的分子。例如，唾液酸酶可剪切唾液酸殘基和底物分子的殘余物之間的，具有α (2，3)_半乳糖、α (2，6)_半乳糖或α (2，8)-半乳糖連接的鍵。唾液酸酶也可剪切唾液酸殘基和底物分子殘余物的任何連接。Neu5Ac和碳水化合物側(cè)鏈的倒數(shù)第二個半乳糖殘基的兩個主要連接，Neu5Ac α (2, 3)-半乳糖和Neu5Ac α (2,6)-半乳糖，已在自然界中發(fā)現(xiàn)。Neu5Ac α (2, 3)_半乳糖和Neu5Ac α (2，6)-半乳糖兩種分子均可被流感病毒作為受體而識別，雖然人類病毒似乎更易識別Neu5Ac α (2,6)-半乳糖,但是鳥和馬病毒主要是識別Neu5Ac α (2, 3)_半乳糖。唾液酸酶可為自然發(fā)生的酶、人工酶(如氨基酸序列基于自然發(fā)生的唾液酸酶的序列的酶，其包括與自然發(fā)生的唾液酸的序列基本同源的序列，但不限于此)。在此用到的“唾液酸酶”也可指自然發(fā)生的唾液酸酶的活性部分，或者包含基于自然發(fā)生的唾液酸酶的活性部分的肽或蛋白質(zhì)。
[0178]“融合蛋白”是包括來自至少兩種不同來源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。融合蛋白可包括來自自然產(chǎn)生的蛋白的或者與自然產(chǎn)生蛋白的全部或一部分基本同源的氨基酸序列，除此外可包括從一到非常多數(shù)目的來源不同的自然產(chǎn)生的蛋白的或者與其全部或者部分基本同源的氨基酸。另一選擇為，融合蛋白可包括來自自然產(chǎn)生的氨基酸序列或者是與自然產(chǎn)生的蛋白的全部或者部分基本同源的，或者此外可包含人工合成的一個到很多的氨基酸。
[0179]“唾液酸酶催化域蛋白”為含唾液酸酶催化域的蛋白，或者是包含與唾液酸酶催化域充分同源的氨基酸序列，但不包括此催化域來源的唾液酸酶的全部氨基酸序列，其中此唾液酸酶催化域蛋白具有與其來源唾液酸酶催化域相同的完整的活性。唾液酸酶催化域可包括全部來自于唾液酸酶的氨基酸序列，但不是必要的。唾液酸酶催化域蛋白可包括來自或者與一個或多個其它的已知蛋白的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，或者可包括一個或多個不來自或者與一個或多個其它的已知蛋白的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。
[0180]I預防或者治療病原體感染的組合物[0181]本發(fā)明包括基于肽或者蛋白的化合物，包括可錨定至少一個治療域到真核細胞的細胞膜的至少一個結(jié)構(gòu)域和至少一個具有可預防病原體感染細胞的細胞外活性的治療域?！盎陔幕蛘叩鞍住被衔镏复嘶衔锏膬蓚€主要的結(jié)構(gòu)域有通過肽鍵結(jié)合氨基酸的氨基酸框架?；陔幕蛘叩鞍椎幕衔镆部删哂衅渌瘜W混合物或者組群粘附到此氨基酸框架或者骨架，其包括對于此錨定域的錨定活性有貢獻的成分，或者對于此治療域的防感染活性有貢獻的成分。例如，本發(fā)明的基于蛋白的治療劑可包括如下化合物和分子，但不限于此:碳水化合物、脂肪酸、脂質(zhì)、類固醇、核苷酸、核苷酸類似物、核酸分子、核酸類似物、肽核酸分子、小的有機分子或甚至是聚合體。本發(fā)明的基于蛋白的治療劑也可包括修飾了的或者非自然產(chǎn)生的氨基酸。可能用于任何目的的此化合物的非氨基酸部分包括(但不限于此):保持此化合物純度，增強此化合物溶解度、分布(例如在治療制劑中)，連接此化合物的結(jié)構(gòu)域或化學成分于化合物，維持此化合物的二維或三維結(jié)構(gòu)，增加此化合物的總體積，增加化合物的穩(wěn)定性和對此化合物的錨定活性或治療活性有貢獻。
[0182]本發(fā)明的此基于肽或蛋白的化合物也可包括含錨定域和結(jié)構(gòu)域的那些以外的蛋白質(zhì)或者肽序列。此附加的蛋白質(zhì)序列可用作任何目的，包括但不受限于上述的任何目的(提純此化合物，增強此化合物的溶解或分布，連接此化合物的結(jié)構(gòu)域或者連接此化合物的化學成分，維持此化合物的二維或者三維的結(jié)構(gòu)，增加此化合物的總大小，增加此化合物的穩(wěn)定性，和提高此化合物的錨定活性和治療活性)。優(yōu)選地，任何附加的蛋白或者氨基酸序列是一個多肽或者蛋白質(zhì)鏈的一部分，其包括一個或多個此錨定域或者此治療域，但是任何可行的蛋白質(zhì)序列的排列是在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0183]此錨定域和治療域可以任何合適的方法排序，其允許此化合物結(jié)合到或者臨近靶細胞膜，這樣此治療域可顯示預防或者阻止病原體對靶細胞的感染的細胞外活性。此化合物優(yōu)選地具有至少一個基于蛋白質(zhì)或肽的錨定域和至少一個基于肽或者蛋白的治療域。在這種情況下，此結(jié)構(gòu)域可以任何順序線性排序。此錨定域可為此治療域的N末端，或者可是此治療域的C末端。一個或者多個治療域在每一末端接有至少一個錨定域是可能的。另一選擇是，一個或者多個錨定域可在每一末端接有至少一個治療域?；瘜W的或優(yōu)選地肽的連接子可任選地用于連接一些或者所有的此化合物的結(jié)構(gòu)域。
[0184]結(jié)構(gòu)域非線性的枝狀的排列也是可能的。例如，此治療域可粘附于氨基酸的衍生側(cè)鏈，其也包括或者連接到此錨定域的多肽鏈的一部分。
[0185]本發(fā)明的化合物可具有多于一個的錨定域。在化合物具有多于一個的錨定域的情況下，此錨定域可是相同的或者不同的。本發(fā)明的化合物可具有多于一個的治療域。在化合物具有多于一個的治療域的情況下，此治療域可是相同的或者不同的。當化合物包括多個錨定域時，此錨定域可被一前一后地排列(有或者沒有連接子)或者在其它結(jié)構(gòu)域，例如治療域的交替?zhèn)取．斠换衔锇ǘ鄠€治療域，此治療與可被一前一后地排列(有或者沒有連接子)或者在其它結(jié)構(gòu)域，例如但不限于錨定域的交替?zhèn)取?br> [0186]本發(fā)明的基于肽或蛋白的化合物可通過任何合適的方法制造，包括純化自然發(fā)生的蛋白，任選的水解剪切此蛋白以獲得想要的功能域，并將此功能域與其他功能域接合。肽也可化學合成，并且任選的化學接合到其他肽或者化學成分。然而，本發(fā)明的基于肽或者蛋白的化合物的制造優(yōu)選地是通過加工核酸構(gòu)建體以在一個連續(xù)的多肽中同時編碼至少一個錨定域和至少一個治療域(有或沒有核酸連接子)。此核酸構(gòu)建體，優(yōu)選地具有合適的表達序列，可被轉(zhuǎn)染到原核和真核細胞，并且此治療用的基于蛋白的化合物可在這些細胞中表達并純化。任何想要的化學成分在提純后可被任選地接合到基于肽或蛋白的化合物。在某些情況下，可選擇細胞株系以表達具備進行想要的翻譯后修飾(例如，但不受限于糖基化)的能力的基于蛋白的治療劑。
[0187]可設(shè)計多種構(gòu)建體并且可測試它們的基于蛋白的產(chǎn)物的想要的活性(例如，舉例來說，錨定域的結(jié)合活性，或者治療域的結(jié)合、催化或者抑制活性)?？蓽y試核酸構(gòu)建體的蛋白產(chǎn)物的防止或者阻止病原體對靶細胞的感染的效率。病原體在體外或體內(nèi)感染能力的測試已為所屬領(lǐng)域所熟知，例如在實施例中描述的流感病毒的感染能力那樣。
[0188]錨定域
[0189]在此用到的“細胞外錨定域”或者“錨定域”是可穩(wěn)定結(jié)合在處于靶細胞外表面或者與靶細胞外表面非常接近的實體的任何分子。錨定域的作用是將本發(fā)明的化合物保留在革巴細胞的外表面或者接近祀細胞。
[0190]細胞外錨定域優(yōu)選地結(jié)合I)在IE細胞表面表達的分子,或者成分、結(jié)構(gòu)域、或者在靶細胞表面表達的分子的表位，2)粘附于在靶細胞表面表達的分子的化學實體，或者3)圍繞靶細胞的細胞外基質(zhì)的分子。
[0191]優(yōu)選的錨定域是肽或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(包括修飾了的或者衍生的肽或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)，或者包括偶連肽或蛋白質(zhì)的成分。偶連肽或蛋白質(zhì)的成分可為任何分子類型，其可幫助錨定域結(jié)合到位于或接近靶細胞表面的任何實體，并且有機分子是優(yōu)選的，例如核酸，肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小有機分子、聚合物、脂質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物，或者任 何這些物質(zhì)的任何組成物。
[0192]通過錨定域結(jié)合的分子、復合物、結(jié)構(gòu)域、或表位對于靶細胞可能或者可能不會具有專一性。舉例來說，錨定域可結(jié)合位于分子上或者與靶細胞非常接近的表位，并且此結(jié)合也發(fā)生在不是在靶細胞的周圍的位點上。然而在許多情況下，本發(fā)明中的治療化合物的局部釋放會限制它主要在靶細胞表面出現(xiàn)。在其它情況下，被錨定域結(jié)合的分子、復合物、部分、結(jié)構(gòu)域、或表位可能對于靶組織或者靶細胞類型是專一的。
[0193]祀組織或者祀細胞類型包括病原體入侵或者擴增的動物或者人體的位點。舉例來說，靶細胞可為能被病原體感染的內(nèi)皮細胞。本發(fā)明的組合物可包括能結(jié)合到細胞表面表位的錨定域，舉例說來，對內(nèi)皮細胞類型專一的化合物。再舉一例，靶細胞可為內(nèi)皮細胞，本發(fā)明的組合物可結(jié)合位于許多內(nèi)皮細胞類型的細胞表面的，或者位于內(nèi)皮細胞不同類型的細胞外基質(zhì)的表位。在這種情況下組合物的局部釋放位點限制于作為病原體攻擊目標的內(nèi)皮細胞上。
[0194]預防或者治療病原體導致的感染的化合物可包括可結(jié)合在或者接近上皮細胞表面的錨定域。舉例來說，與肝素緊密相關(guān)的硫酸乙酰肝素是一種在細胞膜上(包括呼吸上皮細胞的表面)普遍存在的糖胺聚糖(GAG)。許多蛋白特異地結(jié)合到肝素/硫酸乙酰肝素，并且在這些蛋白質(zhì)中此G A G結(jié)合序列已被鑒定(Meyer, Fa, King, M和gelman, RA.(1975)Biochimica et Biophysica Acta392:223-232 ；Achauer, S.ed.，223 頁.Sialic AcidsChemistry, Metabolism and Function.Springer-Verlag, 1982)。舉例來說，人血小板因子4PF4 (SEQ ID NO:2)，人白細胞介素 8 (IL8) (SEQ ID NO:3)，人抗凝血酶 III (ATIII) (SEQ IDNO:4);人載脂蛋白E(ApoE) (SEQ ID NO:5);人脈管關(guān)聯(lián)遷移蛋白(AAMP) (SEQ ID NO:6);人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO:7)的G A G結(jié)合序列(圖2)已顯示對肝素具有非常高親和力(納摩爾級)(Lee，MK和Lander，AD(1991)Pro Natl Acad Sci USA88:2768-2772 ；Goger,B,Halden,Y, Rek, A, Mosl，R，Pye,D.Gallagher,J 和 Kungl，AJ.(2002)Biochem.41: 1640-1646 ；ffitt,DP 和 Lander AD(1994)Curr Bio4:394-400 ；ffeisgraber, KH, Rail, SC, Mahley, Rff, Milne,Rw 和 Marcel, Y.(1986) J Bio Chem261:2068-2076)。這些蛋白質(zhì)的 GAG 結(jié)合序列與它們的受體結(jié)合序列明顯不同，因此它們不能誘導與全長蛋白或者此受體結(jié)合域相關(guān)的生物活性。這些序列或者其它序列已被鑒定或者將來要被鑒定為肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合序列，或具有肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合活性的與已被鑒定為肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合序列同源的序列，在本發(fā)明的化合物中可用作上皮細胞錨定域，用于預防或者治療如呼吸道上皮細胞感染病毒，此類病毒包括但不局限于流感病毒。
[0195]錨定域可結(jié)合靶細胞中的實體，該實體可特異存在于一種物種的靶細胞中，也可在多個物種的靶細胞中均能發(fā)現(xiàn)。在錨定域可結(jié)合存在于多于一種靶細胞類型的表面的成分，并且病毒和病原體可感染多于一種的細胞類型的情況下，治療化合物可用于多于一種細胞類型(假定此治療域也對相關(guān)物種有效)。舉例來說，在治療用化合物可用于抗流感病毒的情況下，本發(fā)明的治療用化合物具有結(jié)合肝素/硫酸乙酰肝素的錨定域，此化合物就如用于鳥類一樣也可用于哺乳動物(包括人類)。 [0196]治療域
[0197]本發(fā)明的化合物包括至少一個治療域，其具有可防止或者阻止病原體感染的細胞外活性，可調(diào)節(jié)受體的免疫反應，或者可以提高重組病毒的轉(zhuǎn)導效率。此治療活性可以是，作為非限制性例子，結(jié)合活性、催化活性或者抑制活性。在本發(fā)明的一些實施方案中，此治療活性修飾或者抑制病原體的幫助病原體感染細胞的功能。在另外一些實施方案中，治療域可修飾或者抑制靶細胞或者靶生物體的功能。
[0198]舉例來說，此治療域可結(jié)合靶細胞上的受體，其對于病原體結(jié)合到靶細胞來說是必需的。在這個意義上，治療成分可阻礙病原體結(jié)合到靶細胞并預防感染?？晒┻x擇的是，治療域可結(jié)合病原體上的分子或者表位以阻止分子或者表位與靶細胞的相互作用，其對感染是必需的。治療域也可具有降解病原體或者寄主的分子或表位的催化活性，其允許或者提高寄主對靶細胞的感染。在其它的實施方案中，治療域可為對病原體感染靶細胞必需的活性的抑制物。受抑制的活性可為寄主生物體或者病原體的活性。
[0199]此治療域優(yōu)選地在細胞外作用，意為其感染的預防、發(fā)炎反應的調(diào)節(jié)或者增強轉(zhuǎn)導的活性發(fā)生在祀細胞表面或者在此祀細胞周圍的介質(zhì)中，包括細胞外基質(zhì)內(nèi)位點、細胞外空間或者組織的魯米諾空間。
[0200]肽或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(包括修飾了的或者衍生的肽或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)是優(yōu)選的治療域，或包括偶連肽或蛋白質(zhì)的分子。偶連肽或者蛋白質(zhì)的分子可為任何可預防或者阻止病原體對靶細胞的感染的分子，并且優(yōu)選地是有機分子，如，舉例來說，核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合物、脂質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物或任何這些物質(zhì)的組合物。
[0201]治療域可為合成肽或者多肽，或者可包括可被接合到肽或者多肽上的合成分子，可為自然發(fā)生的肽或者蛋白質(zhì)或者自然發(fā)生蛋白的結(jié)構(gòu)域。治療域也可為肽或蛋白質(zhì)，其基本上與自然發(fā)生的肽或者蛋白質(zhì)同源。[0202]治療域可用于一個特定物種，或者可預防或者阻止病原體對多于一種物種的感染。舉例來說，阻止病原體的功能的治療域可普遍用于一定范圍的物種，其可被宿主感染，然而通過宿主的特性干擾而打斷宿主病原體相互作用的治療域可或者不可為一種特定物種。在許多情況下，錨定域和治療域可在多于一個物種上有效，因而本發(fā)明的化合物在減少病毒在動物宿主中的繁殖和傳播時可用于提高人類和動物的健康。舉例說來，當治療域為唾液酸酶時，唾液酸酶可剪切多于一種類型的唾液酸殘基和基質(zhì)殘留物的連接，特別是，唾液酸酶可同時剪切α (2，6)_半乳糖 、α (2，3)-半乳糖聯(lián)接，可包括人類不受廣譜流感病毒感染，包括在不同物種如鳥、豬或者馬自然寄生的病毒。
[0203]連接子
[0204]本發(fā)明的化合物可任選的包括一個或者多個連接子，其可連接此化合物的結(jié)構(gòu)域。連接子可用于提供最佳的化合物結(jié)構(gòu)域間距或者折疊。連接子連接的化合物的結(jié)構(gòu)域可為治療域、錨定域或者此化合物的任何其他的結(jié)構(gòu)域或者成分，其提供附加的功能例如增強化合物穩(wěn)定性、有助于純化等。用于連接本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)域的連接子可為化學連接子或者氨基酸或肽連接子。在化合物包括多于一個連接子時，連接子可為相同的或者不同的。在化合物包括多于一個連接子時，連接子可為相同的或者不同的長度。
[0205]有機化學領(lǐng)域已熟知許多連接子的各種組成、極性、反應性、長度、柔性和可裂解性。本發(fā)明優(yōu)選的連接子包括氨基酸或者肽連接子。肽連接子為所屬領(lǐng)域所熟知。優(yōu)選的連接子長為I到100個氨基酸，且更優(yōu)選的是長為I到30個氨基酸，盡管長度不是本發(fā)明的化合物的連接子的限制因素。優(yōu)選的連接子包括不干擾本發(fā)明的單體編碼的肽或蛋白質(zhì)的形成和活性的氨基酸系列。本發(fā)明的一些優(yōu)選的連接子為包括氨基乙酸的類型。舉例來說，連接子含有下列序列:
[0206](GGGGS(SEQ ID NO:10))η，η為I到20間的整數(shù)，或者優(yōu)選地為I到12，可用于連接本發(fā)明的治療化合物的結(jié)構(gòu)域。
[0207]本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的基于蛋白的化合物的核酸分子，其包括至少一個治療域和至少一個錨定域。此核酸分子可有在特定細胞類型中如大腸桿菌或者人類細胞表達的優(yōu)化的密碼子。編碼本發(fā)明的基于蛋白的化合物的本發(fā)明的核酸分子包括至少一個治療域和至少一個錨定域，也可包括其它核苷酸序列，包括但不限于增強基因表達的序列。此核酸分子可為載體，例如但不限于表達載體。
[0208]包括至少一個錨定域和至少一個蛋白酶抑制劑的組合物
[0209]本發(fā)明的一些方面，具有細胞外活性的可阻止病原體對細胞的感染的治療域為蛋白酶抑制劑。此蛋白酶抑制劑可為任何類型的化學實體，如，舉例來說，碳水化合物或者聚合體，但是抑制酶活性的蛋白或肽優(yōu)選。優(yōu)選地，此蛋白酶抑制劑抑制至少部分地加工至少一個病原體或宿主細胞蛋白的酶的活性，病原體或者宿主細胞蛋白在其上的加工對于病原體感染是必需的。此加工對病原體的感染是必需的病毒蛋白的酶可為一種病原體酶或者來自宿主有機體的一種酶。優(yōu)選地，此加工酶在靶細胞表面或附近起作用，因此本發(fā)明的一種粘附在或者位于靶細胞表面的化合物可有效地阻止此酶的活性。
[0210]本發(fā)明的包括蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的化合物可用于抑制任何病原體的感染，在其生命周期需要蛋白酶的，在其中蛋白酶在或者位于宿主細胞表面附近是有活力的。此基于蛋白的組合物可包括，例如，一種下列的結(jié)構(gòu):[0211](錨定域)η-連接子-(蛋白酶抑制劑)η(η = I，2，3或者更多)
[0212]或
[0213](蛋白酶抑制劑)η-連接子-(錨定域)η(η = I，2，3或者更多)
[0214]此蛋白酶抑制劑可為肽或多肽的單體形式或可為相同多肽的多個拷貝，其直接地連接或者在其間有間隔序列。另一選擇是，當?shù)鞍酌敢种乒δ苡驎r，不同的基于多肽的蛋白酶抑制劑可相互連接，比如，舉例來說，與大豆蛋白酶抑制劑連接的抑蛋白酶肽。此多肽或者肽可直接地連接或者通過一個由肽連接序列組成的間隔子。此錨定域可為任何可結(jié)合到處于靶細胞表面附近的肽或者多肽。
[0215]此蛋白酶抑制劑可為自然發(fā)生的蛋白酶抑制劑(或者其活性部分)或者可為加工的蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明的化合物中用到的肽蛋白酶抑制劑可含有與自然發(fā)生的蛋白酶抑制劑基本上同源的序列，具有一個或多個刪除、附加或者替換，保持與自然發(fā)生的蛋白酶抑制劑的相同的或者基本相同的活性。
[0216]在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的治療化合物用于預防或者治療人類流感，且此治療域是可抑制絲氨酸蛋白酶的可剪切流感病毒血凝素前體蛋白HAO為HAl和ΗΑ2的蛋白或肽的蛋白酶抑制劑。
[0217]很多絲氨酸蛋白酶抑制劑已顯示可減少培養(yǎng)細胞、雞胚和受感染的小鼠肺中的HA的剪切或者流感病毒的 活化。這些抑制劑包括許多經(jīng)常應用的胰島素抑制劑，例如抑肽酶(Zhiron OP, Ikizler MR 和 Wright PF.(2002) J Virol76:8682-8689)，亮抑肽酶(ZhironOP, Ikizler MR 和 Wright PF.(2002) J Virol76:8682-8689 ;Tashiro M, Klenk HD 和 RottR.(1987) J Gen Virol68:2039-2043)，大豆蛋白酶抑制劑(Barbey-Morel CL, OeltmannTN, Edwards KM 和 Wright PF.(1987) J Infect Disl55:667-672)，6-氨基己酸(ZhironOP, Ovchartenko AV 和 Bukrinskaya AG.1982.Arch Virol73:263-272)和正對甲苯橫酸基-L-賴氨酸(TLCK) (Barbey-Morel CL, Oeltmann TN, Edwards KM 和 Wright PF.(1987) JInfect Disl55:667-672)。在這些當中，抑肽酶的霧化吸入和其在人類的表現(xiàn)一樣(Zhiron0P.(1983) Problems Virol.4:9-12 (以俄語出版))，已在小鼠上顯示確定的對流感和支氣管肺炎的治療效果(Zhiron OP, Ovchartenko AV 和 Bukrinskaya AG.(1984) J Gen Virol65:191-196 ;Zhiron 0P，Ovchartenko AV和 Bukrinskaya AG.(1985) J Gen Virol66: 1633-1638 ；Zhiron OP.(1987) J Med Virol65:161-167 ;0vchartenko AV和 Zhiron 0Ρ.(1994) AntiviarlRes23:107-118)。
[0218]抑肽酶(SEQ ID NO:1 ;圖1)是一個58氨基酸多肽抑制劑(也稱為特斯樂或牛胰抑肽酶(BBTI))。本發(fā)明的化合物可具有一個或多個抑肽酶結(jié)構(gòu)域；例如，本發(fā)明的治療域可具有I到6個抑肽酶多肽，更優(yōu)選地I到3個抑肽酶多肽。本發(fā)明的化合物可有包括與抑肽酶氨基酸序列基本同源的多肽或者肽的治療域。
[0219]預防或者治療流感的化合物包括抑肽酶,優(yōu)選地包括可結(jié)合在或者到上皮細胞表面附近的錨定域。在一些優(yōu)選地實施方案中，此上皮錨定域是來自人類蛋白的GAG-結(jié)合序列，例如，人血小板因子4 (PF4) (SEQ IDNO:2)、人白細胞介素8 (IL8) (SEQ IDNO:3)、人抗凝血酶III (ATIII) (SEQ ID NO:4)、人載脂蛋白E(ApoE) (SEQ ID NO:3)，人脈管關(guān)聯(lián)遷移蛋白(AAMP) (SEQ ID NO:6)或者人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO:7)(圖2)的GAG-結(jié)合序列。本發(fā)明的化合物也可具有包括多肽或者肽的錨定域，其基本與列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中的GAG-結(jié)合域的氨基酸序列同源。
[0220]臨床上，包括抑肽酶和上皮的錨定域的藥物通過霧化吸入給藥而覆蓋整個呼吸道以預防或者阻止由在其生命周期中需要絲氨酸蛋白酶的流感病毒或者其他病毒如副流感病毒導致的支氣管肺炎。另一選擇是，抑肽酶/上皮的錨定域融合蛋白可被用作鼻噴霧劑以治療未并發(fā)的早期流感病或者其他呼吸病毒的感染。此外，抑肽酶/上皮的錨定域融合蛋白可在感染發(fā)生前用作流感或者其他病毒感染的預防藥物。
[0221]包括至少一個錨定域和至少一個催化活性的組合物
[0222]在本發(fā)明的一些方面，具細胞外活性的治療域可阻止病原體對細胞的感染是催化活性。此酶活性可為移除、降低或者修飾對病原體感染有用的宿主分子或聯(lián)合體或者病原體分子或聯(lián)合體的催化活性。優(yōu)選地，被本發(fā)明的化合物的酶活性移出、降低或者修飾的此宿主分子或聯(lián)合體或者病原體分子或聯(lián)合體附于、向著或者靠近靶細胞的表面，以便錨定于靶細胞表面的本發(fā)明的化合物可有效地抑制宿主或者病原分子或聯(lián)合體。
[0223]舉例說來，治療域可有可消化病原體或靶細胞的分子或表位的催化活性，其是宿主-病原體結(jié)合，進而病原體進入到靶細胞所需要的。靶細胞上允許病毒進入細胞的受體可為本發(fā)明化合物酶活性的靶。
[0224]本發(fā)明包括催化域的化合物可用于阻止任何用受體來幫助其進入靶細胞的病原體的感染，只要此受體的移除 不削弱此有機體。這些基于蛋白的組合物可含有，例如，一種下列的結(jié)構(gòu):
[0225](錨定域)η-[連接子]-(酶活性)η(η = I，2，3或者更多)
[0226]或
[0227](酶活性)η(η = I，2，3或者更多)-[連接子]-(錨定域)η，在此連接子是任選的。
[0228]此酶活性可為肽或者多肽的單體形式或者可為相同多肽的多個拷貝，其或者直接地或者在其間以間隔序列連接。此多肽或肽可直接或者通過由肽連接子序列組成的間隔子連接。此錨定域可為任何可結(jié)合到或者接近靶細胞表面的肽或者多肽。
[0229]在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，治療域包括可除去或者大大的減少上皮細胞表面地唾液酸水平的唾液酸酶。唾液酸為流感病毒的受體。這樣，用唾液酸酶處理呼吸上皮細胞表面可阻止流感感染或者干擾早期感染。此治療域可包括完整的唾液酸酶蛋白但表或者其活性部分。唾液酸為流感病毒的受體，并且至少為至少一個下列病毒的受體:副流感病毒、一些冠狀病毒和輪狀病毒、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌和幽門螺桿菌。這樣，用唾液酸酶處理呼吸上皮細胞可預防流感或者其他病毒感染或者干擾早期感染，也預防或者減少如下細菌的繁殖:肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和銅綠假單胞菌。用唾液酸酶處理胃腸上皮細胞可預防或減少胃部幽門螺桿菌的定居。
[0230]唾液酸也介導細胞粘附和發(fā)炎細胞和靶細胞間的相互作用。因此，用唾液酸酶處理呼吸上皮細胞的表面可預防發(fā)炎細胞在氣管表面的增長，并且因此可治療包括哮喘和過敏性鼻炎的過敏反應。
[0231]唾液酸作為屏障可通過基因治療載體阻止細胞進入，用唾液酸酶處理靶細胞可增加轉(zhuǎn)導效率，且因此提高基因治療的效果。
[0232]優(yōu)選的唾液酸酶為大的細菌唾液酸酶,其可降解受體唾液酸Neu5AC α(2，6)_半乳糖和Neu5AC α (2，3)-半乳糖。舉例來說，來自產(chǎn)氣莢膜梭菌(GenBank注冊號X87369)、粘性放線菌、產(chǎn)尿素節(jié)桿菌或生綠小單孢菌(GenBank注冊號D01045)的細菌唾液酸酶可被應用。本發(fā)明化合物的治療域可包括大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列全部或部分，或者可包括與大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本同源的氨基酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，治療域包括由粘性放線菌編碼的唾液酸酶，例如SEQ ID NO:12中的或者例如與SEQ ID NO:12基本同源的唾液酸酶序列。在另一優(yōu)選實施方案中，治療域包括此粘性放線菌唾液酸酶的包括SEQ ID NO:12的274到666的氨基酸的催化域，或者基本同源的序列。
[0233]其他的優(yōu)選的唾液酸酶為人唾液酸酶，例如由基因NEU2 (SEQ ID NO:8 ；Genebank登記號 Y16535 ；Monti, E, Pret1.Rossi, E.，Ballabio, A 和 Borani G.(1999)Genomics57:137-143)編碼的那些和 NEU4(SEQ ID NO:9 ;Genebank 登記號 NM080741 ;Monti，E，Preti，A，Venerando,B 和 Borsani,G.(2002)Neurochem Res27:646-663)(圖 3)。本發(fā)明化合物的治療域可包括人唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分或者可包括與人唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本同源的氨基酸序列。優(yōu)選地，當治療域包括自然發(fā)生的唾液酸酶的氨基酸序列的一部分，或者與自然發(fā)生的氨基酸序列的一部分基本同源的序列，此部分具與人唾液酸酶基本相同的活性。
[0234]包括一個酶域的預防或治療流感的化合物優(yōu)選地包括可結(jié)合到或者接近上皮細胞表面的錨定域。在一些優(yōu)選地實施方案中，此上皮-錨定域是來自人蛋白的GAG-結(jié)合序列，如，舉例來說，人血小板因子4 (PF4) (SEQ IDNO:2)、人白細胞介素8 (IL8) (SEQ IDNO:3)、人抗凝血酶III (ATIII) (SEQ ID NO:4)、人載脂蛋白E (ApoE) (SEQ ID NO:3),人脈管關(guān)聯(lián)遷移蛋白(AAMP) (SEQ ID NO:6)或者人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO:7)(圖2)的GAG-結(jié)合序列。上皮錨定域也可基本同源于自然發(fā)生的GAG-結(jié)合序列，例如在圖2中列出的那些。
[0235]在例如但不受限于流感病毒、副粘病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和銅綠假單胞菌和細菌感染等病原體的感染的治療或預防和在治療和預防過敏和發(fā)炎反應時，用包括人唾液酸酶或者包括與唾液酸酶基本同源的沒有錨定域的化合物以便提高重組病毒的轉(zhuǎn)導效率也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0236]本發(fā)明認識到可通過例如但不受限于粘性放線菌唾液酸酶或者如NEU2和NEU4的人唾液酸酶等唾液酸酶的運用來預防或者消除這些感染。此唾液酸酶可任選地應用，通過基因或化學加工，或者通過制備藥劑，以便提高它們的半衰期或者其在呼吸上皮細胞的保留時間。
[0237]因為流感病毒主要是感染上呼吸道，局部地去除鼻孔和鼻咽部的受體唾液酸可預防感染或者干擾早期感染。此唾液酸酶可以鼻噴霧劑的形式到達上呼吸道，且其可在流感(或其它感染)早期以治療方式或者在感染發(fā)生前以預防方式應用。另一選擇是，其可以吸入劑形式到達下呼吸道以預防流感的并發(fā)癥，如支氣管肺炎。
[0238]II包括至少一個唾液酸酶活性的治療組合物
[0239]本發(fā)明包括含至少一個唾液酸酶活性的治療組合物。此唾液酸酶活性可為從任何來源分離的唾液酸酶，如，舉例來說，細菌或哺乳動物來源，或者可為與自然發(fā)生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重組蛋白。優(yōu)選的唾液酸酶為大的細菌唾液酸酶，其可降解受體唾液酸Neu5Aca (2，6)-半乳糖和Neu5Ac a (2，3)_半乳糖。例如，可應用來自產(chǎn)氣莢膜梭菌(GenBank注冊號X87369)、粘性放線菌(GenBank注冊號L06898)、產(chǎn)尿素節(jié)桿菌或生綠小單孢菌(GenBank注冊號DO1045)的細菌唾液酸酶或者基本同源的蛋白。
[0240]舉例來說,本發(fā)明的治療化合物可包括大的細菌唾液酸酶或者可包括具大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或者可包括與大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。本發(fā)明一優(yōu)選的治療組合物包括粘性放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO: 12)，或者包括與粘性放線菌唾液酸酶基本同源的蛋白質(zhì)。
[0241]其他的優(yōu)選的唾液酸酶為人唾液酸酶，例如為NEU2基因(SEQ ID NO:8 ；Genebank登記號 Y16535 ；Monti, E, Pret1.Rossi, E.，Ballabio, A 和 Borani G.(1999)Genomics57:137-143)編碼的那些和 NEU4(SEQ ID NO:9 ；Genebank 登記號 NM080741 ；Monti, E, Preti,A, Venerando, B 和 Borsani, G.(2002)Neurochem Res27:646-663)(圖 3)編碼的唾液酸酶。本發(fā)明的化合物的治療域可包括與人唾液酸酶的氨基酸序列基本同源的人唾液酸酶蛋白或者可包括與人唾液酸酶的氨基酸序列的全部和部分基本同源的氨基酸序列。優(yōu)選地，當治療域包括與自然發(fā)生唾液酸酶的氨基酸序列的一部分，或與自然發(fā)生唾液酸酶的氨基酸序列的一部分大致同源的序列，此部分具與人唾液酸酶基本相同的活性。
[0242]含唾液酸酶的藥用組合物可包括其它化合物，包括但不受限于也具治療活性的其它蛋白。由唾液酸酶組成的藥用組合物可包括可提高此組合物的穩(wěn)定性、溶解性、包裝、傳輸、堅固性、口感或者氣味的其它化合物。
[0243]含唾液酸酶的藥用組合物可配成鼻、氣管、支氣管、口腔或者局部用藥，或者可配成注射液或滴眼液。包括唾液酸酶的藥用組合物可用于治療或者預防病原體感染，用于治療或預防過敏和發(fā)炎反應，或用于增強基因治療中重組病毒的轉(zhuǎn)導效率。
[0244]III唾液酸酶催化 域蛋白
[0245]本發(fā)明也包括唾液酸酶催化域蛋白。在此用到的“唾液酸酶催化蛋白”包括唾液酸酶的催化域，但是不包括為此催化域來源的此唾液酸酶的整個氨基酸序列。唾液酸酶催化域蛋白具有唾液酸酶活性。優(yōu)選地，唾液酸酶催化域蛋白包括為催化域序列來源的此唾液酸酶的至少10%、至少20%、至少50%、至少70%的活性。更優(yōu)選地，唾液酸酶催化域蛋白包括催化域序列來源的此唾液酸酶的至少90%的活性。
[0246]唾液酸酶催化域蛋白可包括其它氨基酸序列，例如但不受限于另外的唾液酸酶序列、源自其它蛋白質(zhì)的序列或者不來自自然發(fā)生的蛋白質(zhì)的序列的序列。附加的氨基酸序列可執(zhí)行許多功能，包括對催化域蛋白的其它活性作貢獻，增強唾液酸酶催化域蛋白的表達、加工、折疊或者穩(wěn)定性，或者甚至提供蛋白質(zhì)需要的大小或者間隔。
[0247]一優(yōu)選的唾液酸酶催化域蛋白是包括粘性放線菌唾液酸酶的催化域的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，粘性放線菌唾液酸酶的催化域蛋白包括粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 12)的第270-666個氨基酸。優(yōu)選地，粘性放線菌唾液酸酶的催化域蛋白包括粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的從第270到290個氨基酸的任何氨基酸開始的，到所述粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的從第665到901個氨基酸的任何氨基酸結(jié)束的氨基酸序列，并且缺少任何粘性放線菌唾液酸酶蛋白質(zhì)序列的第I到269個氨基酸。(在此用到的“缺少任何粘性放線菌唾液酸酶蛋白質(zhì)序列的第I到269個氨基酸”指當它們出現(xiàn)在指定的蛋白質(zhì)或者氨基酸序列時缺少4到更多的連續(xù)氨基酸。)
[0248]在一些優(yōu)選實施方案中，粘性放線菌唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的第274-681個氨基酸并且缺少其它粘性放線菌唾液酸酶序列。在一些優(yōu)選實施方案中，唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的第274-666個氨基酸并缺其它任何粘性放線菌唾液酸酶序列。在一些優(yōu)選實施方案中，唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的第290-666個氨基酸并缺其它任何粘性放線菌唾液酸酶序列。在另一優(yōu)選實施方案中，唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQ IDNO:12)的第290-681個氨基酸并缺其它任何粘性放線菌唾液酸酶序列。
[0249]本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明基于蛋白的化合物的核苷酸序列，其包括唾液酸酶的催化域。此核酸分子可具有在特殊細胞類型表達的優(yōu)化的密碼子，如，舉例來說，大腸桿菌或者人類細胞。本發(fā)明的編碼基于蛋白的化合物的，包括唾液酸酶的至少一個催化域的此核酸分子或本發(fā)明也可包括其它的核酸分子，包括但不受限于增強基因表達的序列。此核酸分子可在載體中，例如但不受限于表達載體。
[0250]融合蛋白
[0251 ] 唾液酸酶催化域蛋白可為融合蛋白，其中此融合蛋白包括至少一個唾液酸催化域和至少一個其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括但不限于:純化域、蛋白質(zhì)標簽、蛋白質(zhì)穩(wěn)定域、溶解度域、蛋白質(zhì)大小增加域、蛋白質(zhì)折疊域、蛋白質(zhì)定位域、錨定域、N-末端結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域、催化活性域、結(jié)合域或者催化活性增強域。優(yōu)選地，此至少一個的其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來自其他來源，例如，但不受限于，來自其他蛋白質(zhì)的序列。此至少一個的其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域不需要基于任何已知的蛋白質(zhì) 序列，但是可被加工和根據(jù)經(jīng)驗測試以便在融合蛋白中執(zhí)行任何功能。
[0252]純化域可包括，作為非限制性例子，一個或多個組氨酸標簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合域、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)合域、內(nèi)含肽(intein)結(jié)構(gòu)域或者幾丁質(zhì)結(jié)合域。蛋白質(zhì)標簽可包括可用于蛋白質(zhì)抗體的探測的序列，如，舉例說來，myc標簽、血球凝集素標簽或者FLAG標簽。增強蛋白質(zhì)表達、修飾、折疊、穩(wěn)定性、大小或者定位的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可基于已知或者加工的蛋白質(zhì)的序列。其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可具有結(jié)合或催化活性，或可增強此唾液酸酶催化域的催化活性。
[0253]本發(fā)明的優(yōu)選的融合蛋白包括至少一個唾液酸酶催化域和至少一個錨定域。優(yōu)選的錨定域包括GAG-結(jié)合域如GAG-結(jié)合域或人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO:7)。
[0254]本發(fā)明的融合蛋白的唾液酸酶催化域和其他結(jié)構(gòu)域可任選地被連接子連接，如但不受限于肽連接子。多種肽連接子為所屬領(lǐng)域熟知。優(yōu)選的連接子是由氨基乙酸組成的肽連接子，如 G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 10)。
[0255]本發(fā)明也包括核酸分子和由唾液酸酶的催化域組成的本發(fā)明的融合蛋白。此核酸分子可具有在特別的細胞類中表達的優(yōu)化的密碼子，如，舉例來說，大腸桿菌和人類細胞。編碼本發(fā)明的融合蛋白的此核酸分子或者本發(fā)明也可包括其它核苷酸序列，包括但不受限于增強基因表達的序列。此核酸分子可為載體，如但不受限于表達載體。
[0256]IV藥用組合物
[0257]本發(fā)明包括配成藥用組合物的本發(fā)明的化合物。此藥用組合物包括用作藥用的可接受的載體而儲藏并且優(yōu)選地進而用藥，其在治療用的可接受的載體或者稀釋液中具有藥用的有效性。治療用的可接受的載體或者稀釋液為所屬藥用領(lǐng)域熟知、描述，例如在Remington’s Pharmaceutical art ( % 18 版 Mack 出版公司，Easton, PA, (1990))。防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至調(diào)味料可用于此藥用組合物。舉例來說，安息香酸鈉、山梨酸和對羥基丁酸酯可作為防腐劑加入。此外，也可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
[0258]依賴靶細胞，本發(fā)明的此化合物可被做成口服的藥片、膠囊或者酏劑，局部應用的藥膏或軟膏，直腸用的栓劑，消毒液、懸浮液或者用作吸入劑或者鼻噴霧劑的類似物來使用。注射劑也可以常規(guī)的形式制備或者是液體溶液或懸浮液，或者是適合在注射之前可制成液相溶液或懸浮液的固體形式，或者是乳劑。合適的賦形劑是，舉例來說，水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸鈉、半胱氨酸氫氯化物或其類似物。此外，如果想要，此注射用藥用組合物可包括少量的無毒的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑、PH緩沖劑和其類似物。
[0259]受試化合物的藥用有效劑量依賴于用藥的途徑、接受治療的動物或病人的類型和此特定的動物目前的身體狀況。此劑量可被制定以達到想要的效果，但是會依賴這些因素如體重、飲食、正在服用的藥物和其他因素，這些在所屬醫(yī)學領(lǐng)域的技術(shù)人員會加以考慮。在使用本發(fā)明的方法時，本藥用組合物也可單獨使用或者與其它的物質(zhì)組合，或者與其它治療或者診斷劑組合。這些產(chǎn)品可用在活的有機體內(nèi)，優(yōu)選地，用在哺乳動物病人，優(yōu)選地用在人類，或者用在體外。在體內(nèi)使用時，此藥用組合物可以以各種方式，包括于局部、注射用藥、靜脈、皮下、肌肉、結(jié)腸、直腸、鼻或腹膜內(nèi)等的各種藥劑形式用給病人。這些方法可用于測試受試化合物在有機體內(nèi)的活性。
[0260]在優(yōu)選地實施方案中，這些藥用組合物可以為口腔用藥的懸浮液、溶液、藥片或者錠劑，鼻噴霧劑，吸入劑，注射劑，局部噴霧劑，藥膏，粉末或者凝膠的形式。
[0261]當以懸浮液口腔用藥時，本發(fā)明的組合物根據(jù)所述藥劑制備領(lǐng)域所熟知的技術(shù)調(diào)制并且可能包括所述領(lǐng)域已知的微晶纖維素以適用于散裝，褐藻酸或者藻酸鈉作為懸浮劑，甲基纖維素作為增粘 劑，且調(diào)味用甜料/芳香劑。用作快速釋放的藥片時，這些組合物可能包括所屬領(lǐng)域已知的微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂和乳糖/或其他賦形劑、結(jié)合劑、混合劑、分解質(zhì)、稀釋液和潤滑劑。漱口劑或沖洗劑制劑的成分包括抗菌劑、表面活性劑、助表面活性劑、油、水和其他添加劑如本領(lǐng)域已知的甜味劑/香料。
[0262]當用作飲用溶液時，此組合物包括一個或多個本發(fā)明的化合物，溶解在水中，調(diào)節(jié)到合適的PH值，并且具備載體。此化合物可溶于蒸餾水、自來水、泉水和其類似物。此pH優(yōu)選地被調(diào)節(jié)到約3.5到約8.5之間?？商砑诱{(diào)節(jié)用甜料，例如，I % (w/v)的蔗糖。
[0263]錠劑可根據(jù)美國專利號3，439，089制備，在此因這些目的而被包含在參考文獻中。
[0264]當用作鼻噴霧劑或者吸入劑時，此藥用組合物根據(jù)所述藥劑制備領(lǐng)域所熟知的技術(shù)制備，并且可制備在所屬領(lǐng)域已知的鹽溶液、碳氟化合物和/或其他溶解或分散劑，用苯甲醇或其他合適的防腐劑、吸收促進劑以增加藥物利用率。見，舉例來說，Ansel，H.C.等Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems 第 6 版(1995)。優(yōu)選的這些組合物和藥劑用合適的無毒的藥物可接受的成分制備。這些成分的和一些可在Remingtong’sPharmaceutical Sciences (第 18 版,Mack 出版公司，Easton, PA (1990),此領(lǐng)域的權(quán)威參考書)中發(fā)現(xiàn)的鼻腔給藥劑型的這些物質(zhì)的制備為這些技術(shù)人員所知。選擇適合的載體高度依賴于想要的鼻腔給藥劑型的確切特性，例如溶液、懸浮液、藥膏或者凝膠。鼻腔給藥劑型一般包括除此活性成分外的大量的水。少量的其他成分如PH調(diào)節(jié)劑、乳化劑或分散劑、防腐劑、表面活性劑、膠凝劑或緩沖和其它穩(wěn)定和溶解劑也可能存在。優(yōu)選地，鼻腔給藥劑應與鼻分泌物是等濃度的。
[0265]鼻腔制劑可用滴劑、噴霧劑、吸入劑給藥或者用任何其他的鼻腔內(nèi)給藥形式用藥。任選地，傳遞系統(tǒng)可為單位劑量傳遞系統(tǒng)。每劑藥傳遞的溶液或懸浮液的體積可優(yōu)選地為任何從約5到約2000毫升，更優(yōu)選地從約10到1000毫升，并且再更加優(yōu)選地從約50到約500毫升。這些各種劑型的傳遞系統(tǒng)可為或者是以單位劑量或者是多單位劑量包裝的滴劑瓶、塑料擠壓瓶、噴霧瓶、霧化器或者藥物吸入劑。
[0266]本發(fā)明的藥物的配備可改變?yōu)榘ǎ?I)其它的酸或堿以調(diào)整pH(2)其它的張度賦予劑包括山梨醇、甘油和葡萄糖；(3)其它的抗微生物的防腐劑如其它的對羥基苯甲酸酯、山梨酸酯、安息香酸酯、丙酸酯、三氯丁醇、苯甲醇、殺藻胺和汞；(4)其它的粘度劑如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其它的樹脂；(5)合適的吸收增強劑；(6)穩(wěn)定劑如抗氧化劑，象重亞硫酸鹽和抗壞血酸鹽；金屬螯合劑如依地鈉；和藥物溶解增強劑如聚乙二醇。
[0267]V預防或者治療病原體感染的方法
[0268]本發(fā)明也包括預防或治療病原體感染的方法。在一方面，此方法包括:用本發(fā)明的藥用組合物處理被一病原體感染的或者有被一病原體感染的危險的受體，其包括含至少一個可錨定此化合物到或者接近靶細胞表面的錨定域和由具有至少一個可阻止病原體對靶細胞感染的胞外活性的肽或者蛋白的至少一個治療域的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的有效治療劑量到受體的上皮細胞。需處理的此受體可為動物或者人類。
[0269]在另一方面，此方法包括:用本發(fā)明的藥用組合物處理病原體感染了的或者有被病原體感染的危險的生物體，其包括具唾液酸酶活性的基于蛋白質(zhì)的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的治療有效劑量到一個生物體的上皮細胞。此唾液酸酶活性可為一個分離的自然發(fā)生的唾液酸酶蛋白，或者至少與自然發(fā)生的唾液酸酶的一部分基本同源的重組蛋白。一優(yōu)選藥用組合物包括與粘性放線菌唾液酸酶基本同源的唾液酸酶(SEQIDN0:12)。要處理的此生物體可為動物或者人類。
[0270]在另一方面，此方法包括:用本發(fā)明藥用組合物處理病原體感染了的或者有被病原體感染的危險的生物體，其包括含唾液酸酶催化域的基于蛋白質(zhì)的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的治療有效劑量到一個生物體的上皮細胞。此唾液酸酶催化域優(yōu)選地可與自然發(fā)生的唾液酸酶的催化域基本同源。一個優(yōu)選的藥用組合物包括一個與粘性放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)的第274-666個氨基酸基本同源的唾液酸酶催化域。
[0271]病原體可為病毒、細菌或者原生細菌。在一些實施方案中，此病原體為下列的一種:流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、冠狀病毒、輪狀病毒、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和幽門螺桿菌。在一優(yōu)選實施方案中，此病原體為流感毒。
[0272]本發(fā)明的化合物可被設(shè)計以用于人類或者動物。在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明的化合物可用于預防病原體對一類動物的感染，例如哺乳動物。在本發(fā)明的一些方面，組合物可用于人類或者動物(雖然藥劑可能不同)。在一些方面，化合物的此活性域?qū)Χ嘤谝粋€種類、類型、亞型或者菌株的病原體有效并且對多于一種的寄主種類有活性。舉例來說，包括，舉例來說，例如防止流感病毒的HA蛋白加工的抑肽酶的活性域的，或包括將唾液酸受體從靶細胞移出的唾液酸酶的，或包括例如結(jié)合肝素或乙酰肝素的錨定域的，本發(fā)明的一些優(yōu)選的化合物，可用于鳥類、哺乳動物或者人類?？蓪σ欢ǚ秶挠心芰Ω腥静煌募闹鞣N類的病原體有效的這樣的化合物也可用于人類以對抗自然寄生在其他種類的病原體的感染。
[0273]在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，藥用組合物預防流感的感染，并且此藥用組合物的藥用有效劑量用到一生物體的呼吸上皮細胞。這可通過應用吸入劑或者通過鼻噴霧劑而實現(xiàn)。優(yōu)選地，此吸入劑或鼻噴霧劑一天用一到四次。
[0274]因為流感病毒主要感染上呼吸道，定位地移出鼻孔、咽、氣管或支氣管的此受體唾液酸可預防或者干擾早期感染。此唾液酸酶可以鼻噴霧劑或者吸入劑的形式傳遞到上呼吸道，并且其可在流感(或其他感染)的早期以治療方式或者在流感發(fā)生前以預防的方式應用。另一選擇是，其可以吸入劑的形式傳遞到下呼吸道以治療流感并且預防流感并發(fā)癥，例如支氣管肺炎。相似地，此唾液酸酶可以鼻噴霧劑或吸入劑的形式傳遞以預防或減少副流感病毒和冠狀病毒的感染。其也可以吸入劑或鼻噴霧劑的形式傳遞以預防或減少病原細菌在呼吸道的定植，包括肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和銅綠假單胞菌。此治療與可通過基因或者化學加工任選地用于提高它們的半衰期或者在呼吸上皮細胞的居留。此外，其可以滴劑、噴霧劑或藥膏的形式局部地傳遞到眼睛或到外傷以預防和治療包括銅綠假單胞菌的細菌感染。其也可局部地用藥到口腔以治療幽門螺桿菌的感染。
[0275]劑量
[0276]所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見，體內(nèi)有用的用藥劑量和用藥的特殊方式會根據(jù)年齡、體重、接受治療的病人的類型、施用的特殊的藥用組合物和施用此藥用組合物的特殊用途來決定。有效劑量水平的確定，其為達到想要的結(jié)果的需要的藥劑水平，可為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員用上述的程序方法完成。在不用人的動物研究中，藥用組合物的施用以一個高的劑量水平開始，隨著劑量降低，直到不再達到想要效果或者相反的副作用減少或者消失。根據(jù)想要的藥效、治療指征、用藥程序、純度和此化合物的活性，本發(fā)明的化合物的劑量可在大范圍內(nèi)變動。典型說來，產(chǎn)品在人類臨床上的應用以低劑量水平開始，并逐漸增加劑量水平直到想要的效果達到了。另一選擇是，可接受的體外研究可用于建立受試化合物的有用劑量和用藥程序。典型說來，劑量可在約lng/kg到約10mg/kg之內(nèi)，優(yōu)選地在在約10ng/kg到約lmg/kg之內(nèi)，且更優(yōu)選地在約100ng/kg到約100mg/kg之內(nèi)。
[0277]專人醫(yī)師可根據(jù)病人的情況選擇確切的藥劑、程序和劑量(見，F(xiàn)ingle等ThePharmacological Basis of Therapeutics (1975))。需要注意的是，由于不恰當?shù)挠盟幰灿袑е露拘浴⑵鞴俟δ芪蓙y或者其他相反的效果的可能性，此參與醫(yī)師應該知道如何和什么時候來終止、打斷或者調(diào)節(jié)用藥。相反地，此參與醫(yī)師也應知道當臨床反應不足夠時應調(diào)整到高劑量水平。處理需關(guān)注的系統(tǒng)紊亂的最高用藥量隨被治療者的情況的嚴重性和用藥程序變化。情況的嚴重性可能部分地，舉例來說，用標準的預后評估方法評估。再者，此劑量和多半劑量的頻率，也會隨年齡、體重和此個別的病人的反應而變化，也包括獸醫(yī)用藥。
[0278] 這樣，根據(jù)本發(fā)明，進一步提供了一種治療的方法和治療和預防流感病毒感染的藥用組合物。此治療包括給需要此處理的病人施用藥物載體和本發(fā)明的任何組合物的治療有效量，或者其藥用的可接受的鹽。[0279]在一優(yōu)選的治療方案中，合適的劑量以吸入劑、鼻噴霧劑或者口服錠劑用于每一個病人。但是可以理解的是，此特殊的劑量水平和用藥水平對于每一個特定的病人來說可能會變化，且依賴于包括此特殊的鹽或其他施用形式的物質(zhì)的活性、代謝穩(wěn)定性和此化合物的活動長度、年齡、體重、健康程度、性別、飲食、用藥的方式和時間、排泄速率、藥物組成、此特別疾患的嚴重性和寄主正在實施的治療。
[0280]VI減少、預防或者治療過敏和發(fā)炎反應的方法
[0281]本發(fā)明也包括減少、預防或者治療生物體過敏和發(fā)炎反應的方法。
[0282]在一方面，此方法包括:用本發(fā)明的藥用的組合物預防或者治療生物體的過敏或者發(fā)炎反應，其包括一個具一個唾液酸酶活性的基于蛋白的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的藥用有效劑量到一生物體的上皮細胞。此唾液酸酶活性可從自然發(fā)生的唾液酸酶蛋白上分離的蛋白或者與自然發(fā)生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重組蛋白。一優(yōu)選的藥用組合物包括與粘性放線菌唾液酸酶(SEQ IDNO: 12)基本同源的唾液酸酶。此被治療的生物體可為動物或者人類。
[0283]在另一方面，此方法包括:用本發(fā)明的藥用組合物預防或者治療生物體的過敏或者發(fā)炎反應，其包括具唾液酸催化域的基于蛋白的化合物。在一些優(yōu)選實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的治療有效劑量到生物體的上皮細胞。此唾液酸酶催化域優(yōu)選地包括與粘性放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)的第274-666個氨基酸基本同源的唾液酸酶催化域。此被治療的生物體可為動物或者人類。
[0284]此過敏或者發(fā)炎反應可為急性或者慢性疾患，且可包括,作為非限制性例子，哮喘，其它的導致呼吸困難、過敏性鼻炎、濕疹、牛皮蘚、對植物或者動物毒素的過敏反應或者自體免疫疾患。
[0285]在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物可以吸入劑或者鼻噴霧劑的形式傳遞已組織或者治療呼吸道的發(fā)炎，包括但不受限于，哮喘和過敏性鼻炎。含唾液酸酶活性(包括唾液酸酶催化域蛋白和唾液酸酶融合蛋白)的本發(fā)明的化合物也可用作滴眼液、滴耳液、噴霧劑、藥膏、洗劑或用于皮膚的凝膠。在另一方面，此方法包括靜脈內(nèi)或者局部注射的包括唾液酸酶活性的本發(fā)明治療具有炎性疾病的患者。
[0286]劑量
[0287]所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見，體內(nèi)有用的用藥劑量和用藥的特殊方式會根據(jù)年齡、體重、接受治療的病人的類型、施用的特殊的藥用組合物和施用此藥用組合物的特殊用途來決定。有效劑量水平的確定，其為達到想要的結(jié)果的需要的藥劑水平，可為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員用上述的程序方法完成。在不用人的動物研究中，藥用組合物的施用以一個高的劑量水平開始，隨著劑量降低，直到不再達到想要效果或者相反的副作用減少或者消失。根據(jù)想要的藥效、治療指征、用藥程序、純度和此化合物的活性，本發(fā)明的化合物的劑量可在大范圍內(nèi)變動。典型說來，產(chǎn)品在人類臨床上的應用以低劑量水平開始，并逐漸增加劑量水平直到想要的效果達到了。另一選擇是，可接受的體外研究可用于建立受試化合物的有用劑量和用藥程序。典型說來，劑量可在約lng/kg到約10mg/kg之內(nèi)，優(yōu)選地在在約10ng/kg到約lmg/kg之內(nèi)，且更優(yōu)選地在約100ng/kg到約100mg/kg之內(nèi)。
[0288]專人醫(yī)師可根據(jù)病人的情況選擇確切的藥劑、程序和劑量(見，F(xiàn)ingle等ThePharmacological Basis of Therapeutics (1975))。需要注意的是，由于不恰當?shù)挠盟幰灿袑е露拘?、器官功能紊亂或者其他相反的效果的可能性，此參與醫(yī)師應該知道如何和什么時候來終止、打斷或者調(diào)節(jié)用藥。相反地，此參與醫(yī)師也應知道當臨床反應不足夠時應調(diào)整到高劑量水平。處理需關(guān)注的系統(tǒng)紊亂的最高用藥量隨被治療者的情況的嚴重性和用藥程序變化。情況的嚴重性可能部分地，舉例來說，用標準的預后評估方法評估。再者，此劑量和多半劑量的頻率，也會隨年齡、體重和此個別的病人的反應而變化，也包括獸醫(yī)用藥。
[0289]在一些優(yōu)選的治療方案中，合適的劑量以吸入劑、鼻噴霧劑或者局部應用用于每一個病人。但是可以理解的是，此特殊的劑量水平和用藥水平對于每一個特定的病人來說可能會變化，且依賴于包括此特殊的鹽或其他施用形式的物質(zhì)的活性、代謝穩(wěn)定性和此化合物的活動長度、年齡、體重、健康程度、性別、飲食、用藥的方式和時間、排泄速率、藥物組成、此特別疾患的嚴重性和寄主正在實施的治療。
[0290]VII增強通過重組病毒載體的基因遞送的方法
[0291]本發(fā)明也 包括增強通過重組病毒載體的基因遞送的方法。該方法一方面包括--給藥包括有唾液酸酶活性的蛋白的本發(fā)明的化合物的有效劑量至至少一個細胞，其在給藥至少一個重組病毒載體之前或者伴隨其。本發(fā)明的組合物可與至少一個重組病毒載體制備在相同的藥劑中或者別的藥劑中。
[0292]在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的化合物的有效的治療劑量和重組病毒載體至一生物體的細胞。此需治療的生物體可為動物或者人類。在一特殊的優(yōu)選實施方案中，重組病毒載體用于為基因治療轉(zhuǎn)導生物體的上皮靶細胞。例如，重組病毒載體可用于轉(zhuǎn)導生物體的具囊性纖維性變的氣管上皮細胞。在此情況下，本發(fā)明的化合物可通過使用吸入劑而用藥。包括治療基因的重組病毒可同時地或者單獨地給藥。
[0293]在一些實施方案中，細胞可用本發(fā)明的化合物和體內(nèi)或者“體外”(指在轉(zhuǎn)導后從一生物體的移出的細胞將被移植到一生物體)重組病毒載體處理。
[0294]此唾液酸酶活性可為一種分離的自然發(fā)生的唾液酸酶蛋白，或者一種與自然發(fā)生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重組蛋白，其包括唾液酸催化域。一優(yōu)選的藥用組合物包括與粘性放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)基本同源的唾液酸酶。
[0295]本發(fā)明的化合物可在使用此重組病毒的一天前或者兩小時后用到靶細胞上。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物在使用此重組病毒前的四小時到十分鐘前用到靶細胞。給藥可為
[0296]重組病毒優(yōu)選地為一可用于轉(zhuǎn)移基因到哺乳動物細胞的重組病毒，例如，優(yōu)選的，人類細胞。舉例來說，重組蛋白可為逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)或者單純皰疹病毒類型I。此重組病毒包括至少一個將轉(zhuǎn)移到靶細胞的外源基因。此基因優(yōu)選地為治療基因，但是不需要為此情形。舉例來說，此基因可為用于標記細胞或者賦予抗藥性的基因。
[0297]在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括提高基因治療載體的功效的方法。此方法包括用本發(fā)明的具唾液酸酶活性的化合物并且在相同的或者另一藥劑中用重組病毒處理病人。本發(fā)明的具有唾液酸酶活性的此化合物可在使用重組病毒之前、同時或者之后用于病人。在一實施方案中，此唾液酸酶與粘性放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)或其部分基本是同源的。在一優(yōu)選的實施方案中，此唾液酸酶包括此粘性放線菌唾液酸酶的催化域。在另一實施方案中，此重組病毒為AAV。在另一實施方案中，此疾病為囊腫性纖維化。在另一實施方案中，此重組病毒包括此囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子(CFTR)基因。[0298]劑量
[0299]所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見，體內(nèi)有用的用藥劑量和用藥的特殊方式會根據(jù)年齡、體重、接受治療的病人的類型、施用的特殊的藥用組合物和施用此藥用組合物的特殊用途來決定。有效劑量水平的確定，其為達到想要的結(jié)果的需要的藥劑水平，可為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員用上述的程序方法完成。在不用人的動物研究中，藥用組合物的施用以一個高的劑量水平開始，隨著劑量降低，直到不再達到想要效果或者相反的副作用減少或者消失。根據(jù)想要的藥效、治療指征、用藥程序、純度和此化合物的活性，本發(fā)明的化合物的劑量可在大范圍內(nèi)變動。典型說來，產(chǎn)品在人類臨床上的應用以低劑量水平開始，并逐漸增加劑量水平直到想要的效果達到了。另一選擇是，可接受的體外研究可用于建立受試化合物的有用劑量和用藥程序。典型說來，劑量可在約lng/kg到約10mg/kg之內(nèi)，優(yōu)選地在在約10ng/kg到約lmg/kg之內(nèi)，且更優(yōu)選地在約100ng/kg到約100mg/kg之內(nèi)。
[0300]專人醫(yī)師可根據(jù)病人的情況選擇確切的藥劑、程序和劑量(見，F(xiàn)ingle等ThePharmacological Basis of Therapeutics (1975))。需要注意的是，由于不恰當?shù)挠盟幰灿袑е露拘?、器官功能紊亂或者其他相反的效果的可能性，此參與醫(yī)師應該知道如何和什么時候來終止、打斷或者調(diào)節(jié)用藥。相反地，此參與醫(yī)師也應知道當臨床反應不足夠時應調(diào)整到高劑量水平。處理需關(guān)注的系統(tǒng)紊亂的最高用藥量隨被治療者的情況的嚴重性和用藥程序變化。情況的嚴重性可能部分地，舉例來說，用標準的預后評估方法評估。再者，此劑量和多半劑量的頻率， 也會隨年齡、體重和此個別的病人的反應而變化，也包括獸醫(yī)用藥。
[0301]在一些優(yōu)選的治療方案中，合適的劑量以吸入劑、鼻噴霧劑或者局部應用用于每一個病人。但是可以理解的是，此特殊的劑量水平和用藥水平對于每一個特定的病人來說可能會變化，且依賴于包括此特殊的鹽或其他施用形式的物質(zhì)的活性、代謝穩(wěn)定性和此化合物的活動長度、年齡、體重、健康程度、性別、飲食、用藥的方式和時間、排泄速率、藥物組成、此特別疾患的嚴重性和寄主正在實施的治療。
實施例
[0302]實施例1:抑肽酶基因的合成、純化和抑肽酶融合蛋白的檢測
[0303]介紹
[0304]流感病毒蛋白血凝素(HA)是主要的流感包膜蛋白，它在病毒感染過程中起重要作用。HA的重要性為它是寄主免疫反應產(chǎn)生的保護性中和抗體的主要作用目標所證實(Hayden, FG (1996) Antiviral drug resistance (D.D.Richman 編)，59-77 頁.Chichester,UK John ffiley&Sons Ltd.)?，F(xiàn)已清楚HA在病毒感染過程中具有兩種作用:首先，HA負責病毒向唾液酸細胞受體的吸附；第二，HA通過促使病毒包膜和細胞膜的融合而介導病毒進入靶細胞。
[0305]HA合成過程中其前體蛋白首先被合成，即ΗΑ0，它以三聚分子復合物的形式通過高爾基體被轉(zhuǎn)運到細胞表面，其后被切割，C末端形成HAl (ΗΑ0的328殘基)，N末端形成HA2。一般認為切割過程發(fā)生于細胞表面或被釋放的病毒上。HAO被切割為HA1/HA2不是HA結(jié)合到唾液酸受體所必需，但卻為病毒感染性所必需(Klenk，HD和Rott，R.(1988) Adv VirRes.34:247-281 ；Kido, H, Niwa, Y, Beppu, Y 和 Towatari, T, (1996) Advan Enzyme Regul36:325-347 ；Skehel, JJ 和 Wiley, DC.(2000)Annu Rev Biochem69:531-569)。[0306]HAO對寄主蛋白酶的敏感性由HAO分子的外環(huán)上的蛋白裂解位點決定。蛋白裂解位點可能包含一個Arg或Lys殘基(一元切割位點)，或包含數(shù)個Lys和/或Arg殘基(多元切割位點)，這些殘基位于R-X-K/R-R基序內(nèi)。只有流感A病毒亞型H5和H7含帶有多元切割位點的HA蛋白。流感A的其他亞型以及流感B和C病毒含有一元切割位點。含多元切割位點的流感A病毒具有較強的感染力，能引起寄主全身感染，而含有一元HA位點的病毒只能引起哺乳動物的呼吸道感染或鳥類的呼吸道和腸道感染(Klenk，HD和Gartenff.1994Trend Micro2:39-43綜述)。幸運的是迄今為止人類中只出現(xiàn)了少數(shù)被攜帶有多元切割位點的高感染力鳥流感病毒A亞型H5和H7感染的病例，這些病例大多發(fā)現(xiàn)于香港。絕大多數(shù)流感是由含只能在一元切割位點進行切割的HA蛋白的病毒引起的。
[0307]含有多元切割位點的流感病毒HA亞型5和7是由費林蛋白酶激活的，費林蛋白酶是類枯草桿菌蛋白內(nèi)切酶或前蛋白轉(zhuǎn)換酶家族成員。費林蛋白酶是在細胞內(nèi)切割病毒的，這一過程普遍存在于許多類型的細胞中，使得這種病毒引起的致命性全身感染能被觀察至丨J (Klenk, HD 和 Garten W.1994.Trend Micro2:39-43 ；Nakayama, K.1997.Biochem327:625-635)。其它所有含一元切割位點HA的流感病毒由分泌型胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶激活。流感病毒的激活涉及到的酶包括:血纖維蛋白溶酶(Lazarowitz SG, Goldberg AR和 Choppin Pff.1973.Virology56: 172-180),小血纖維蛋白溶酶(Murakami M, TowatariT, Ohuchi M, Shiota Μ, Akao Μ, Okumura Y, Parry MA 和 Kido H.(2001) Eur J Biochem268:2847-2855)，類胰蛋白酶 Clara (Kido, Chen Y 和 Murakami Μ.(1999) In B.Dunn(編)，Proteases of infectious agents.205-217 頁，Academic Press, New York, H.Y),激妝釋放酶，尿激酶，凝血酶(Scheiblauer H, Reinacher M, Tashiro M 和 Rott R.(1992) J InfecDisl66:783-791),凝血因子 Xa (Gotoh B, Ogasawara, Toyoda T, Inocencio N, Hamaguchi M和Nagai Y.(1990) EMBO J9:4189-4195)，精子頭粒蛋白(Garten ff, Bosch FX, Linder D, Rott和 Klenk HD.(1981) Virologyl 15:361-374.)，來自人呼吸灌洗的蛋白酶(Barbey-MprelCL, Oeltmann TN, Edwards KN 和 Wright PF.(1987) J Infect Disl55:667-672)，來自金黃色葡萄球菌(Tashiro M, Ciborowski P, Reinacher M, Pulverer G, Klenk HD 和 Rott R.(1987)Virologyl57:421-430)和銅綠假單胞菌(Callan RJ, Hartmann FA, West SE 和 HinshawVS.(1997) J Virol71 =7579-7585)的細菌蛋白酶。一般認為流感病毒被寄主絲氨酸蛋白酶的激活發(fā)生于細胞外，在質(zhì)膜上或病毒從細胞中釋放出以后。
[0308]抑肽酶又稱特斯樂(Trasylol)或牛胰抑肽酶(BPTI)，是一種含58個氨基酸的多肽。它屬于Kunitz型抑制劑，能夠競爭性地、廣譜性地抑制絲氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶。長期以來抑肽酶被人們用作藥物，如用于治療胰腺炎、各種時期的休克綜合征、纖溶出血和心肌梗死。它也用于心內(nèi)直視手術(shù)，包括體外循環(huán)手術(shù)，以減少失血(Fritz H和Wunderer G.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。
[0309]人體內(nèi)抑肽酶對人體的安全性已為多年的治療實踐所證實。此外，抑肽酶顯然是它的特異抗體的弱免疫原，此類免疫原迄今還未在人血清中觀察到(Fritz H和WundererG.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。抑肽酶作為候選藥物的另一特征是它的超穩(wěn)定性，它可在室溫中保存至少18個月而活性絲毫不下降(Fritz H和Wunderer G.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。[0310]為使抑肽酶達到顯著的抑制病毒的效果，在動物試驗中使用了高劑量。例如對小鼠進行6天的腹膜內(nèi)注射，每天使用280到840毫克劑量(Zhirnov OP, Ovcharenko AV和Bukrinskaya AG.(1984) J Gen Virol 65:191-196);進行霧化吸入須使用較低劑量,但每只小鼠每天仍需 63-126 毫克服用 6 天(Ovcharenko AV 和 Zhirnov OP.(1994)AntiviralRes23:107-118)。根據(jù)從小鼠中得到的數(shù)據(jù)推斷，人體需要使用非常高劑量的抑肽酶。因此，為在人體中獲得更好的藥效，需顯著提高抑肽酶分子的效價。
[0311]抑肽酶是通過競爭性抑制位于寄主呼吸上皮細胞表面的絲氨酸蛋白酶發(fā)揮作用的。因此，抑肽酶在接近寄主蛋白酶處具有局部高濃度是決定其競爭優(yōu)勢的關(guān)鍵因素。我們利用兩種方法協(xié)同作用以提高抑肽酶在呼吸上皮表面的競爭優(yōu)勢。
[0312]首先，使抑肽酶形成多價融合蛋白使之親合力(功能型親和力)得到提高，多價融合蛋白由兩個、三個或更多抑肽酶蛋白通過連接子的連接而形成。這種分子能夠以多價形式與膜蛋白酶結(jié)合，與抑肽酶單體相比具明顯的反應動力學優(yōu)勢。單體抑肽酶與牛胰蛋白酶結(jié)合較緊密，其解離常數(shù)(Ki)為6.0X10_14mol/l。然而它的結(jié)合力與其它蛋白酶相比是非常低的，如被認為與流感病毒的激活有關(guān)的胰凝乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶和激肽釋放酶的Ki 值為 ICT8 至Ij lCT9mol/l (Fritz H和 Wunderer G.(1983) Arzneim-Forsch33:479-494)。多聚化可使抑肽酶與這些蛋白酶的結(jié)合力呈指數(shù)性提高。
[0313]第二，我們將抑肽酶與錨定于呼吸表皮的結(jié)構(gòu)域融合。錨定域使抑肽酶停留于接近寄主膜結(jié)合蛋白酶的區(qū)域，使之在在表皮表面保持較高的局部濃度。錨定域也增加了藥物在呼吸表皮的停滯時間。
[0314]克隆
[0315]抑肽酶是一單鏈 多肽，具有58個氨基酸殘基和3個鏈內(nèi)二硫鍵(SEQ IDNO:1)。圖1所示為抑肽酶的氨基酸序列。在利用PCR合成編碼抑肽酶和其融合蛋白的基因時，利用了對密碼子進行優(yōu)化過的重疊寡核苷酸為模板，以利于在大腸桿菌中的表達。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-T0P0載體(Invitrogen)。測序后將基因亞克隆到表達載體pQE (Qiagen)中。該載體含有純化標簽Hisx6，便于純化重組蛋白。將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。轉(zhuǎn)化細胞在加有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，利用標準實驗方法使用IPTG誘導。將細胞離心沉淀后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中利用超聲波將之裂解。利用鎳柱(Qiagen)純化帶His6純化標簽的酶。
[0316]制作了以下幾種抑肽酶融合蛋白:
[0317]1.二價和三價抑肽酶。兩個或三個抑肽酶通過柔性連接子連接為以下結(jié)構(gòu):抑肽酶-(GGGGS(SEQ IDNO:10))n(n = 3，4 或 5)-抑肽酶；
[0318]和
[0319]抑肽酶-(GGGGS(SEQ IDNO: 10)) η (η = 3，4 或 5)-抑肽酶-(GGGGS (SEQ IDNO:10))η (η = 3,4或5)-抑肽酶
[0320]連接肽序列的長度可能會決定多價抑肽酶分子的三維柔性，從而影響它的功能性親和力。因此構(gòu)建了具有多種長度的連接肽的構(gòu)建體。
[0321]具有全功能的重組單價抑肽酶已在大腸桿菌中產(chǎn)生(Auerswald EA, Horlein D,Reinhardt G, Schroder W和 Schnabel Ε.(1988).Biol Chem Hopper-Seyler Vol369, Suppl.,第27-35頁)。因此我們期望大腸桿菌細胞中的多價抑肽酶蛋白能夠正確折疊。除在各種常見的大腸桿菌菌株如BL21、JM83等之中表達外，也在Origami?細胞(Novagen,Bad Soden,Germany)中表達了多價抑肽酶蛋白。Origami?細胞系不含硫氧還蛋白和谷胱甘肽還原酶，因此具有氧化性細胞質(zhì)。該細胞系已被成功用于表達許多含二硫鍵的蛋白(BessettePH, Aslund F，Beckwith J 和 Georg1u G.(1999) Pro Natl Acad Sci USA96:13703-13708 ；Venturi M, Seifert C 和 Hunte C.(2001) JMol B1l315:1-8.)。
[0322]2.表皮細胞錨定抑肽酶。將表皮細胞錨定序列與抑肽酶融合。任何與表皮細胞表面具有親和力的肽或多肽序列都可能作為表皮錨定序列。我們已選出三個人類GAG結(jié)合序列:PF4(aa47-70 ；SEQ ID NO:2)，IL-8 (aa46_72 ；SEQ ID NO:3)，和AT III (aall8-151 ；SEQID NO:4)(圖2)。這些序列與硫酸肝素和硫酸乙酰肝素具有納摩爾(nanomolar)級的高親和力(表1)。硫酸肝素/硫酸乙酰肝素普遍存在于呼吸表皮中。在不同構(gòu)建體中，GAG結(jié)合序列通過通用連接妝序列GGGGS與抑妝酶基因的N末端和C末端融合為以下結(jié)構(gòu):
[0323](GAG 結(jié)構(gòu)域-GGGGS (SEQ ID NO: 10)-抑肽酶);和
[0324](抑肽酶-GGGGS(SEQ ID NO: 10)) -GAG 結(jié)構(gòu)域)
[0325]表1對肝素的親和力
[0326]
【權(quán)利要求】
1.一種唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第270到290氨基酸的任一氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDNO: 12)的第665到901氨基酸的任一氨基酸結(jié)束；其中，所述唾液酸酶催化域蛋白缺少從第I個到第269氨基酸的序列組成的粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列，并且其中所述唾液酸酶催化域蛋白具唾液酸酶活性。
2.—種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求1所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸分子，其在表達載體內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的唾液酸酶催化域蛋白，其包括SEQIDNO:14。
5.一種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求4所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的核酸分子,其在表達載體中。
7.如權(quán)利要求1所述的唾液酸酶催化域蛋白，其中所述唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ IDNO: 12)第270到290氨基酸的任一氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)第665到681氨基酸的任一氨基酸殘基結(jié)束。
8.—種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求8所述的核酸分子，其在表達載體中。
10.如權(quán)利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括SEQIDN0:16。
11.一種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求10所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸分子，其在表達載體中。
13.如權(quán)利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第274氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第681氨基酸殘基結(jié)束。
14.一種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求13所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
15.如權(quán)利要求14所述的核酸分子，其在表達載體中。
16.如權(quán)利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第290氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第666氨基酸殘基結(jié)束。
17.一種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求16所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
18.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其在表達載體中。
19.如權(quán)利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第290氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDN0:12)的第681氨基酸殘基結(jié)束。
20.一種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求19所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
21.如權(quán)利要求20所述的核酸分子，其在表達載體中。
22.—種融合蛋白，其包括: 至少一個唾液酸酶的催化域；和 純化域、蛋白質(zhì)標簽、蛋白質(zhì)穩(wěn)定域、溶解度域、蛋白質(zhì)大小增加域、蛋白質(zhì)折疊域、蛋白質(zhì)定位域、錨定域、N-末端結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域、催化活性域、結(jié)合域或催化活性增強域。
23.如權(quán)利要求22所述的融合蛋白，其還包括至少一個肽連接子。
24.如權(quán)利要求22所述的融合蛋白，其中所述的催化域是與產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶的催化域基本同源的，與粘性放線菌唾液酸酶基本同源的、與產(chǎn)尿素節(jié)桿菌唾液酸酶基本同源的、與生綠小單孢菌唾液酸酶基本同源的、與人Neu2唾液酸酶基本同源的或者與人Neu4唾液酸酶基本同源的。
25.如權(quán)利要求24所述的融合蛋白，其中所述的催化域是與粘性放線菌唾液酸酶的催化域基本同源的。
26.如權(quán)利要求25所述的融合蛋白，其中所述的催化域包括SEQID NO:16。
27.如權(quán)利要求26所述的融合蛋白，其包括至少一個蛋白質(zhì)純化域。
28.如權(quán)利要求27所述的融合蛋白，其中所述的至少一個蛋白質(zhì)純化域為組氨酸標簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合域、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)合域、內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)域或者幾丁 結(jié)合域。
29.如權(quán)利要求28所述的融合蛋白，其中所述的蛋白質(zhì)純化域為組氨酸標簽。
30.如權(quán)利要求29所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白包括SEQID NO: 18。
31.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求30所述的融合蛋白。
32.如權(quán)利要求31所述的核酸分子，其在表達載體中。
33.如權(quán)利要求31所述的核酸分子，其包括SEQID NO: 17。
34.如權(quán)利要求33所述的核酸分子，其在表達載體中。
35.如權(quán)利要求25所述的融合蛋白，其包括至少一個錨定域。
36.如權(quán)利要求35所述的融合蛋白，其中所述的錨定域為GAG結(jié)合域。
37.如權(quán)利要求36所述的融合蛋白，其中所述的錨定域是與人血小板因子4(SEQIDNO:2)的GAG結(jié)合域基本同源的，與人白細胞介素8 (SEQ ID NO: 3)的GAG結(jié)合域基本同源的，與人抗凝血酶III (SEQ ID NO:4)的GAG結(jié)合域基本同源的，與人載脂蛋白E(SEQID NO:5)的GAG結(jié)合域基本同源的，與人脈管關(guān)聯(lián)遷移蛋白(SEQ ID NO:6)的GAG結(jié)合域基本同源的，或與人雙調(diào)蛋白(SEQ ID NO:7)的GAG結(jié)合域基本同源的。
38.如權(quán)利要求37所述的融合蛋白，其中所述的錨定域是與人雙調(diào)蛋白(SEQID NO:7)的GAG結(jié)合域基本同源的。
39.如權(quán)利要求38所述的融合蛋白，其中所述的錨定域包括人雙調(diào)蛋白(SEQID NO:7)的GAG結(jié)合域。
40.如權(quán)利要求39所述的融合蛋白，其中所述的唾液酸酶的催化域包括SEQID NO: 16。
41.如權(quán)利要求40所述的融合蛋白，其包括SEQID NO: 20。
42.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求41所述的融合蛋白。
43.如權(quán)利要求42所述的核酸分子，其在表達載體中。
44.如權(quán)利要求42所述的核酸分子，其包括SEQID NO: 19。
45.如權(quán)利要求44所述的核酸分子，其在表達載體中。
46.如權(quán)利要求40所述的融合蛋白，其包括SEQID NO: 25。
47.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求46所述的融合蛋白。
48.如權(quán)利要求47所述核酸分子，其在表達載體中。
49.如權(quán)利要求47所述的核酸分子，其包括SEQID NO: 24。
50.如權(quán)利要求49所述的核酸分子，其在表達載體中。
51.如權(quán)利要求40所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO:38。
52.如權(quán)利要求40所述的融合蛋白，其還包括連接所述人雙調(diào)蛋白GAG結(jié)合域到所述唾液酸酶的催化域的肽連接子。
53.如權(quán)利要求52所述的融合蛋白，其包括SEQID NO:35。
54.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求53所述的融合蛋白。
55.如權(quán)利要求54所述的核酸分子，其包括SEQID NO:34。
56.—種表達載體,其包括權(quán)利要求55所述的核酸分子。
57.如權(quán)利要求 52所述的融合蛋白，其包括SEQID NO:37。
58.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求57所述的融合蛋白。
59.如權(quán)利要求58所述的核酸分子，其包括SEQID NO:36。
60.—種表達載體,其包括權(quán)利要求59所述的核酸分子。
61.如權(quán)利要求52所述的融合蛋白，其包括SEQID NO:39。
62.如權(quán)利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQID NO:27。
63.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求62所述的融合蛋白。
64.—種表達載體,其包括權(quán)利要求63所述的核酸分子。
65.如權(quán)利要求63所述的核酸分子，其包括SEQID NO: 26。
66.—種表達載體,其包括權(quán)利要求65所述的核酸分子。
67.如權(quán)利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQID NO:29。
68.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求67所述的融合蛋白。
69.—種表達載體,其包括權(quán)利要求68所述的核酸分子。
70.如權(quán)利要求68所述的核酸分子，其包括SEQID NO: 28。
71.—種表達載體,其包括權(quán)利要求70所述的核酸分子。
72.如權(quán)利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQID N0:31。
73.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求72所述的融合蛋白。
74.—種表達載體,其包括權(quán)利要求73所述的核酸分子。
75.如權(quán)利要求73所述的核酸分子，其包括SEQID NO:30。
76.—種表達載體,其包括權(quán)利要求75所述的核酸分子。
77.如權(quán)利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQID NO:33。
78.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求77所述的融合蛋白。
79.—種表達載體,其包括權(quán)利要求78所述的核酸分子。
80.如權(quán)利要求78所述的核酸分子，其包括SEQID NO:32。
81.—種表達載體,其包括權(quán)利要求80所述的核酸分子。
82.—種藥物制劑，其包括唾液酸酶。
83.如權(quán)利要求82所述的藥物制劑，其中所述的唾液酸酶是與產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶至少一部分基本同源的，與粘性放線菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與產(chǎn)尿素節(jié)桿菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與生綠小單孢菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與人Neu2唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與人Neu4唾液酸酶的至少一部分基本同源的。
84.如權(quán)利要求83所述的藥物制劑，其中所述唾液酸酶是與粘性放線菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的。
85.如權(quán)利要求84所述的藥物制劑，其中所述的唾液酸酶包括SEQID NO: 12.
86.—種藥物制劑，其包括權(quán)利要求1所述的組分。
87.一種藥物制劑，其包括權(quán)利要求7所述的組分。
88.—種藥物制劑，其包括權(quán)利要求22所述的組分。
89.—種藥物制劑，其包括權(quán)利要求26所述的組分。
90.一種藥物制劑，其包括權(quán)利要求46所述的組分。
91.一種藥物制劑，其包括權(quán)利要求62所述的組分。
92.如權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的藥物制劑，其配制成噴霧劑。
93.如權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的藥物制劑，其配制成吸入劑。
94.如權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的藥物制劑，其配制成注射用溶液。
95.如權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的藥物制劑，其配制成滴眼液。
96.如權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的藥物制劑，其配制成霜、藥膏、凝膠或軟膏。
97.如權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的藥物制劑，其配制成可口服給藥的藥丸、藥片、錠劑、懸浮液或溶液。
98.一種治療或者預防由流感、副流感病毒或者呼吸道合胞病毒引起的病毒感染的方法，其包括: 將權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91中任一項所述的組合物的治療有效量應用于受治療者的上皮細胞。
99.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的應用是通過用鼻噴霧劑。
100.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的應用是通過用吸入劑。
101.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的應用是以一天一到四次。
102.一種治療或者預防細菌病原體感染的方法，其包括:將權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的組合物的治療有效量給藥于受治療者。
103.如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述的病原體為肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌或幽門螺桿菌。
104.如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述的給藥是通過用鼻噴霧劑。
105.如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述的給藥是通過用吸入劑。
106.如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述的給藥是通過用局部給藥。
107.如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述的給藥是通過用口服給藥。
108.如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述的給藥是以一天一到四次。
109.—種治療和預防過敏或發(fā)炎的方法，其包括:用權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述的組合物的治療有效量向受治療者給藥。
110.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的發(fā)炎與哮喘、過敏性鼻炎、濕疹、牛皮蘚、接觸植物或動物毒素或者自體免疫疾患有關(guān)。
111.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的給藥是通過用鼻噴霧劑。
112.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的給藥是通過用吸入劑。
113.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的給藥是通過用滴眼液。
114.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的給藥是通過用局部使用。
115.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的給藥是局部使用或者靜脈內(nèi)注射。
116.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的給藥是以一天一到四次。
117.—種由重組病毒載體增強基因遞送的方法，其包括:在給藥所述的重組病毒載體之前或者同時將權(quán)利要求82、84、86、87、88、89、90或91所述組合物的治療有效量給藥到受治療者的上皮細胞。
118.如權(quán)利要求117所述的方法，其中所述的重組病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體、腺病毒載體或者腺相關(guān)病毒載體。
119.如權(quán)利要求118所述的方法，其中所述的重組病毒載體為重組的腺相關(guān)病毒載體。
120.如權(quán)利要求119所述的方法，其中所述重組腺相關(guān)病毒載體包括編碼囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子(CFTR)的基因。
121.如權(quán)利要求118所述的方法，其中所述的給藥是通過用吸入劑。
122.如權(quán)利要求118所述的方法，其中所述的給藥是以一天一到四次。
123.—種藥物制劑，其包括權(quán)利要求62所述的組合物。
124.如權(quán)利要求123所述的藥物制劑，其配制成噴霧劑。
125.如權(quán)利要求123所述的藥物制劑，其配制成吸入劑。
126.—種治療或者預防流感感染的方法，其包括:將權(quán)利要求123所述的組合物的治療有效量應用到受治療者的上皮細胞。
127.如權(quán)利要求126所述的方法，其中所述的應用是通過用鼻噴霧劑。
128.如權(quán)利要求126所述的方法，其中所述的應用是通過用吸入劑。
129.如權(quán)利要求126所述的方法，其中所述的應用是以一天一到四次。
【文檔編號】C12N15/56GK104017787SQ201310239638
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2004年9月10日
【發(fā)明者】房芳, 邁克爾·馬拉科夫 申請人:安迅生物制藥公司