一種利用dna熔解溫度分析水稻香味基因的功能標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明根據(jù)水稻香味基因fgr與正常的等位基因BAD2在編碼區(qū)第7外顯子的序列差異設(shè)計(jì)香味基因功能標(biāo)記BAD2-E7。利用該標(biāo)記進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，第一輪PCR以基因組DNA為模板，利用外側(cè)引物擴(kuò)增；第二輪PCR以稀釋的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增。利用儀器檢測第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA熔解溫度，通過熔解溫度高低區(qū)分fgr和BAD2序列差異，從而判別水稻材料的基因型（香味或非香味）。
【專利說明】—種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國重要的農(nóng)作物，香味是高品質(zhì)稻米的一個(gè)重要特性，香型稻米的價(jià)格比非香型稻米的價(jià)格高，其育種工作得到了廣泛重視。選擇是香型稻米育種中最重要環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的香稻育種選擇方法，是通過表現(xiàn)型間接對香味基因型進(jìn)行選擇，這種方法存在周期長、效率低、準(zhǔn)確性較差等缺點(diǎn)。最有效的選擇，應(yīng)是直接對香味基因型進(jìn)行選擇，DNA分子標(biāo)記的出現(xiàn)為這種 直接選擇提供了可能。
[0003]絕大多數(shù)香稻品種的香味性狀主要受位于第8染色體上的一對隱性基因fgr控制。Bradbury等研究認(rèn)為，是編碼甜菜醛脫氫酶2的基因似似在第七外顯子發(fā)生8個(gè)堿基缺失和3處堿基變異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止而使得BAD2酶喪失功能，進(jìn)而使其的作用底物2-乙酰-1-卩比咯啉(2-acetyl-l-pyrroline, 2AP)的代謝途徑中斷，香味物質(zhì)2AP不斷積累，致使水稻的葉片和籽粒產(chǎn)生香味。針對該功能變異位點(diǎn)，基于凝膠電泳的功能標(biāo)記GRFM04已被開發(fā)并用于香型水稻種質(zhì)的鑒定。
[0004]成本低、簡便實(shí)用、重復(fù)性好的共顯性標(biāo)記，是有效開展香稻分子輔助選擇育種的重要基礎(chǔ)。傳統(tǒng)凝膠電泳的分辨率有限，無法滿足廣泛存在的SNP或Indel檢測需求；此外，傳統(tǒng)的凝膠電泳操作費(fèi)時(shí)、具有一定毒性，要實(shí)現(xiàn)大批量分離群體的標(biāo)記檢測難度較大。因此，繼續(xù)開發(fā)新型功能型分子標(biāo)記，是水稻分子育種進(jìn)步的必然需求。
[0005]DNA序列的差異會導(dǎo)致DNA熔解溫度的不同，如果能利用DNA熔解溫度檢測基因型，將可避免凝膠電泳的缺陷，實(shí)現(xiàn)批量化、自動(dòng)化、全封閉的基因型檢測。利用DNA熔解溫度判別基因型在人類疾病的研究中已有報(bào)道，但是，該技術(shù)涉及環(huán)節(jié)較多、需詳盡的前期優(yōu)化工作，目前在水稻上系統(tǒng)開展此技術(shù)研究的報(bào)道較少，這在一定程度上限制了其在水稻育種中的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題克服目前傳統(tǒng)水稻香味基因檢測技術(shù)的缺陷，提供了一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標(biāo)記。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標(biāo)記的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種水稻香味基因功能標(biāo)記BAD2-E7，所述BAD2-E7由一對內(nèi)側(cè)引物BAD2_E7-1n_F/BAD2-E7-1n-R 和一對外側(cè)引物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 組成，BAD2-E7-1n_F、BAD2-E7-1n-R、BAD2-E7-out_F 和 BAD2-E7_out-R 引物序列如 SEQ ID NOl?4 所示。[0009]一種如上所述水稻香味基因功能標(biāo)記BAD2-E7的應(yīng)用，所述應(yīng)用為用于區(qū)分香型水稻和非香型水稻。
[0010]一種區(qū)分香型水稻和非香型水稻的方法，包括以下步驟:
51.以待測水稻基因組DNA為模版，利用權(quán)利要求1所述的外側(cè)引物BAD2-E7-out-F/ BAD2-E7-out-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；
52.將步驟SIPCR擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋，以之為模版，利用權(quán)利要求1所述的內(nèi)側(cè)引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-in-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；
53.檢測步驟S2擴(kuò)增所獲的DNA的熔解溫度，如果待測DNA的熔解溫度在79-79.6°C 之間，待測水稻為非香型水稻；如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，待測水稻為香型水稻。
[0011]本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)水稻香味基因的熔解溫度為77.6°C，正常的等位基因 BAD2的熔解溫度為79.3°C，水稻香味基因fgr的熔解溫度比正常的等位基因似似的熔解溫度低了 1.7°C，所以，通過熔解溫度就可以區(qū)分和似似序列差異，從而判別水稻材料的基因型(香味或非香味)。如果待測水稻的DNA的熔解溫度在79-79.6°C之間，可判斷待測水稻為非香型水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，可判斷待測水稻為香型水稻。
[0012]不同品種的香型水稻都含有水稻香味基因/gr，不同品種的香型水稻的fgr基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是是香型水稻，無論是什么品種，通過BAD2-E7標(biāo)記擴(kuò)增的DNA序列的熔解溫度都會在77.6°C左右范圍，這個(gè)范圍前后不會超過0.3°C。
[0013]優(yōu)選地，步驟S2所述的稀釋為稀釋15-20倍。
[0014]優(yōu)選地，步驟SI所述PCR反應(yīng)體系為:
2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 U L ；
外側(cè)引物(10 U mol/L)各 0.3 u L ；
基因組DNA0.5 u L ；
雙蒸水補(bǔ)足10 ii L ;
PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C，5min; 95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25 個(gè)循環(huán)； 72 °C，5min。
[0015]優(yōu)選地，步驟SI所述PCR反應(yīng)體系為:
2X Power Taq PCR MasterMix 母液4 U L ；
內(nèi)側(cè)引物(10 u mol/L)各 0.3 UL ；
20 X EvaGreen 染料0.5 u L ；
稀釋過的第一輪PCR產(chǎn)物0.5 UL ；
雙蒸水補(bǔ)足10 ii L ;
PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 個(gè)循環(huán)； 72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
[0016]優(yōu)選地，步驟S3所述的熔解溫度曲線為6(T95°C的熔解曲線。
[0017]優(yōu)選地，步驟S3所述的對比，熔解溫度曲線為75°C-82°C的熔解曲線。
[0018]比現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
1.提供的檢測方法簡單，比原來的通過基因測序或凝膠電泳的方法來確定基因型更加的簡便、快捷；此外，此方法不接觸有毒試劑，對操作人員的健康有利。
[0019]2.本發(fā)明提供的功能標(biāo)記通過兩次PCR擴(kuò)增目的片段，顯著提高了目的片段產(chǎn)物的特異性，使結(jié)果的判讀更加準(zhǔn)確。
[0020]3.本發(fā)明所提供的方法，檢測準(zhǔn)確率高，可用于大規(guī)模的篩選目標(biāo)基因。
[0021]說明書附圖
圖1.功能標(biāo)記BAD2-E7的引物所在基因組位置及擴(kuò)增片段和Zfer基因的功能變異位點(diǎn)分別以星號(*)標(biāo)識。
[0022]圖2.利用BAD2-E7雛BAD2、fgr及其雜合型的DNA擴(kuò)增片段熔解溫度。
圖3.利用BAD2-E7擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果；M.DNA ladder ；1-2 BAD2(日本晴);3-4 fgr(Basmati370) ;5-6 雜合型(日本晴+Basmati370)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0024]實(shí)施例1
S1.香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴基因組DNA的提取。
[0025]具體方法:
511.取少量水稻插秧后一月幼葉置于液氮冷凍的2.0 mL滅菌離心管中攪拌至粉末狀，加1000 μ L 2 X CTAB-DNA提取(質(zhì)量分?jǐn)?shù)(W/V)為2%的CTAB，pH8.0 ;質(zhì)量分?jǐn)?shù)(W/V)為1%的PVP ；100 mmol/L Tris-HCl，ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl ；20 mmol/L EDTA，pH8.0 ;體積分?jǐn)?shù)(V/V )為0.2%的巰基乙醇)；
512.置于65°C恒溫水浴鍋中每隔10 min搖動(dòng)一次，30-45 min后取出；
513.冷卻2min后加1000 μ L氯仿-異戊醇(體積比24:1 )，上下劇烈充分搖動(dòng)，使兩者混合均勻；
514.10000 rpm離心10 min,輕取上清至1.5 ml滅菌新離心管中，加入600 μ L預(yù)冷異丙醇上下輕搖均勻；
515._20°C放置30 min使DNA沉淀；10000 rpm離心6 min,立即倒掉上清倒立離心管于紙巾上；
516.1 min后直立離心管，加入800 μ L 70%乙醇和3 M NaAc (體積比9:1),輕搖使DNA懸浮放置30 min ；
517.10000 rpm離心6 min,立即倒掉上清加入800 μ L 70%乙醇將DNA再次漂洗30
min ；
518.10000 rpm 離心 3 min，通風(fēng)櫥內(nèi)烘干；加入 100-200 μ LlXTB Buffer (10 mMTris-HCl, ρΗ8.0 ；1 mM EDTA, ρΗ8.0)溶解，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0026]S2.香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴香味鑒定方法。
[0027]具體方法:將2g左右供試材料的綠葉剪成碎片，放入小錐形瓶中，在每個(gè)瓶中加IOmL 17g/L的氫氧化鉀溶液,立即蓋上瓶蓋,置于室溫下1Omin,然后逐一打開瓶蓋,立即用鼻嗅之，鑒別香味。[0028]S3.香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴香味基因標(biāo)記BAD2-E7開發(fā)及擴(kuò)增。
[0029]S31.比較Basmati370、日本晴BAD2基因第7外顯子序列差異，設(shè)計(jì)涵蓋差異位點(diǎn)的功能標(biāo)記BAD2-E7(圖1)。相比日本晴該區(qū)段，Basmati370在第七外顯子發(fā)生8個(gè)堿基缺失和3處堿基變異，導(dǎo)致該區(qū)段DNA熔解溫度比日本晴降低了 1.5°C。所述的BAD2-E7由一對內(nèi)側(cè)引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 和一對外側(cè)引物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 組成，引物序列如下:
BAD2-E7-out-F 引物序列(5，-3’ ) TACCAGGACTTGTTTGGAGCTT,如 SEQ ID NO:1 所示； BAD2-E7-out-R 引物序列(5，-3’ ) AAACCTTAACCATAGGAGCAGC,如 SEQ ID NO:2 所示；。
[0030]BAD2-E7-1n-F 引物序列(5，_3’)TGTTAGGTTGCAITTACTGGGAGT，如 SEQ ID NO:3 所示；BAD2-E7-1n-R 引物序列(5，-3，)CAAACCTTAACCATAGGAGCAGC，如 SEQ ID NO:4 所示。
[0031]利用功能標(biāo)記BAD2-E7進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，第一輪PCR以基因組DNA為模板，利用 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7-out-R引物擴(kuò)增;第二輪PCR以稀釋的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 引物擴(kuò)增。
[0032]第一輪PCR:反應(yīng)體系依次加入2 X Power Taq PCR MasterMix母液(百泰克,北京) 5 yL、外側(cè)引物(10 iimol/L)各0.3 y L以及0.5 U L基因組DNA，最后以雙蒸水補(bǔ)足10 U L0 在 GeneAmp 9700 型 PCR 儀(Applied Biosystems, USA)上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)?95°C, 5min; 25 X (95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s) ; 72°C , 5min。反應(yīng)完成后，向PCR管加入200 u L雙蒸水，以稀釋第一輪PCR產(chǎn)物(約20倍)。
[0033]第二輪PCR:反應(yīng)體系依次加入2 X Power Taq PCR MasterMix母液(百泰克，北京) 4 UL、內(nèi)部引物(10 iimol/L)各 0.3 u L,0.5 y L 20XEvaGre en 染料(Biotium, USA)、 以及0.5 UL稀釋過的第一輪PCR產(chǎn)物，最后以雙蒸水補(bǔ)足10 yL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C， 2min; 25 X (95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s) ; 72°C , 5min; 95°C , 2min ；25°C , 2min。
[0034]S4.功能標(biāo)記BAD2-E7擴(kuò)增產(chǎn)物DNA熔解溫度檢測方法。
[0035]第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物分 別全部轉(zhuǎn)移至帶裙邊、白底不透明的96孔板，加入20 u L礦物油(SIGMA’USA),離心(1000 rpm, I min)以消除氣泡。將待測的檢測板放入LightScanner 96 (Idaho Technology, USA)分析系統(tǒng),讀取60°C-95°C的熔解曲線。所采集的原始數(shù)據(jù)用 LightScanner Call IT 軟件(Idaho Technology,USA)進(jìn)行分析，選用 Small Amplicon 模式進(jìn)行自動(dòng)化分析，結(jié)果見圖2，從圖2可知，水稻香味基因fgr的熔解溫度為77.6°C，正常的等位基因似似的熔解溫度為79.3°C，水稻香味基因的熔解溫度比正常的等位基因似似的熔解溫度低了 1.7°C，所以，通過熔解溫度就可以區(qū)分和似似序列差異，從而判別水稻材料的基因型(香味或非香味)。如果待測水稻的DNA的熔解溫度在79-79.6°C之間， 可判斷待測水稻為非香型水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，可判斷待測水稻為香型水稻。
[0036]不同品種 的香型水稻都含有水稻香味基因/gr，不同品種的香型水稻的fgr基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是是香型水稻，無論是什么品種，通過BAD2-E7標(biāo)記擴(kuò)增的DNA序列的熔解溫度都會在77.6°C左右范圍，這個(gè)范圍前后不會超過0.3°C。
[0037]S5.功能標(biāo)記BAD2-E7擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法。
[0038]具體方法:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(電泳緩沖液I X TBE，電壓110 V，時(shí)間2.5 h)，通過0.1% AgNO3染色，利用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照及讀帶。
[0039]實(shí)施例2:利用BAD2-E7檢測水稻香味基因型。
[0040]1.供試材料:本實(shí)驗(yàn)所研究材料為香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴。
[0041]2.2份供試材料香味鑒定:香味鑒定方法同實(shí)施例1所述。
[0042]3.結(jié)果表明，Basmati370葉片表現(xiàn)出香味，日本晴葉片無香味。
[0043]4.2份供試材料DNA提取，PCR擴(kuò)增分析:DNA提取和PCR擴(kuò)增方法同實(shí)施例1所述。
[0044]5.功能標(biāo)記BAD2-E7擴(kuò)增產(chǎn)物DNA熔解溫度檢測:熔解溫度檢測方法同實(shí)施例1所述。
[0045]結(jié)果表明，Basmati370擴(kuò)增產(chǎn)物DNA熔解溫度為TL 6°C，說明Basmati370含有香味基因/#，所以可以判定Basmati370為香型水稻；日本晴擴(kuò)增產(chǎn)物DNA熔解溫度為79.3°C，日本晴為野生型基因似似，可以判定日本晴為非香型水稻，以上結(jié)果表明利用功能標(biāo)記BAD2-E7可以區(qū)分香與非香的水稻品種，準(zhǔn)確率達(dá)100%。
[0046]6.功能 標(biāo)記BAD2-E7擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳:聚丙烯酰胺凝膠檢測方法同實(shí)施例1所述。結(jié)果表明，Basmati370較日本晴的擴(kuò)增產(chǎn)物缺少數(shù)個(gè)堿基，與預(yù)期結(jié)果完全一致(圖3)。說明所熔解溫度檢測與常規(guī)凝膠電泳結(jié)果一致，可代替凝膠電泳檢測香味基因型，提聞檢測效率。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻香味基因功能標(biāo)記BAD2-E7，其特征在于，所述BAD2-E7由一對內(nèi)側(cè)引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 和一對外側(cè)弓丨物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 組成， BAD2-E7-1n-F、BAD2-E7-1n-R、BAD2-E7-out-F 和 BAD2-E7_out-R 引物序列如 SEQ ID NOl?4所示。
2.—種權(quán)利要求1所述水稻香味基因功能標(biāo)記BAD2-E7的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為用于區(qū)分香型水稻和非香型水稻。
3.—種區(qū)分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，包括以下步驟:51.以待測水稻基因組DNA為模版，利用權(quán)利要求1所述的外側(cè)引物BAD2-E7-out-F/ BAD2-E7-out-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；52.將步驟SIPCR擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋，以之為模版，利用權(quán)利要求1所述的內(nèi)側(cè)引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；53.檢測步驟S2擴(kuò)增所獲的DNA的熔解溫度，如果待測DNA的熔解溫度在79?79.6°C 之間，待測水稻為非香型水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，待測水稻為香型水稻。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述區(qū)分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟S2所述的稀釋為稀釋15?20倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述區(qū)分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟SI所述 PCR反應(yīng)體系為:2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 U L ；外側(cè)引物(10 U mol/L)各 0.3 u L ；基因組DNA0.5 u L ；雙蒸水補(bǔ)足10 ii L ;PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C，5min; 95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25 個(gè)循環(huán)； 72 °C，5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述·區(qū)分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟SI所述 PCR反應(yīng)體系為:2 X Power Taq PCR MasterMix 母液4 U L ；內(nèi)側(cè)引物(10 u mol/L)各 0.3 UL ；20 X EvaGreen 染料0.5 u L ；稀釋過的第一輪PCR產(chǎn)物0.5 UL ；雙蒸水補(bǔ)足10 ii L ;PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 個(gè)循環(huán)； 72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述區(qū)分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟S3所述的熔解溫度曲線為6(T95°C的熔解曲線。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述區(qū)分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟S3所述的對比，熔解溫度曲線為75?82°C的熔解曲線。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436530SQ201310238700
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月17日
【發(fā)明者】郭濤, 羅文龍, 陳志強(qiáng), 王慧, 黃翠紅, 劉永柱, 張建國 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)