專利名稱：芽孢桿菌及其產(chǎn)生的殼聚糖酶和該酶水解獲得的殼寡糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌種及其用途，同時還涉及該菌種所產(chǎn)的殼聚糖酶和由該酶水解獲得的殼寡糖。
背景技術(shù)：
殼聚糖由N-乙?；咸烟蔷酆隙桑亲匀唤缰械诙笊锎蠓肿佣嗵?，近20年來已引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，開展了大量的研究。目前殼聚糖的多種生理活性已被證實(shí)，并在保健食品、生物醫(yī)藥、日用化工、環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域中得以開發(fā)應(yīng)用，但由于殼聚糖不溶于水及其他許多無機(jī)溶劑，限制了其在多領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用。殼寡糖為殼聚糖的降解產(chǎn)物，是由β -1，4糖苷鍵連接的2-氨基葡萄糖組成的聚合度為2 20的低聚糖，與殼聚糖相比具有相對分子質(zhì)量小、水溶性好、生物活性高、易于吸收、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。殼寡糖具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飲料、化妝品和化工等多種領(lǐng)域中。在眾多降解殼聚糖獲取殼寡糖的方法中，酶解法是近年來應(yīng)用最為廣泛的降解方法。大多數(shù)的殼聚糖酶是以內(nèi)切方式水解部分乙?；臍ぞ厶?。殼寡糖生物活性的高低與其聚合度有著密切聯(lián)系，研究表明，聚合度為5 6的殼寡糖生物活性最高。目前在殼寡糖制備及應(yīng)用研究中，殼寡糖聚合度難以控制，大多為寬聚合度范圍的混合物，其生物活性不穩(wěn)定。有關(guān)殼聚糖酶的研究與進(jìn)一步開發(fā)利用已成為殼寡糖生產(chǎn)和應(yīng)用的關(guān)鍵與瓶頸。通過篩選獲得的專一性殼聚糖酶的高產(chǎn)菌株產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)殼聚糖酶，并利用專一性殼聚糖酶降解殼聚糖具有反應(yīng)溫和，易控制，易分離處理，不污染環(huán)境，產(chǎn)物活性高等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一株發(fā)酵可獲取高活性的專一性殼聚糖酶、通過該殼聚糖酶水解殼聚糖可獲得聚合度為4 6的高生物活性的殼寡糖的芽孢桿菌(Bacillus sp.)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的芽孢桿菌(Bacillus sp.) Dg屬于芽孢桿菌，其于2012年12月21日在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCN0.7024。該菌株大小為0.5-0.7X1.2-2.8um，端生芽孢，無莢膜，有鞭毛，革蘭氏陽性桿菌。于PDA培養(yǎng)基上生長良好，PDA培養(yǎng)基上菌落特征為:菌落較厚，表面光滑、易挑起、無光澤、淺乳白色不透明，邊緣整齊。最適生長溫度為36± I°C。兼性厭氧菌。該菌株發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖產(chǎn)酸，不能利用乳糖、阿拉伯糖、木糖、瓊脂糖、半乳糖和蔗糖產(chǎn)酸；噴哚試驗(yàn)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽性；V-P試驗(yàn)陰性；硫化氫試驗(yàn)陽性；能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源。

同時本發(fā)明提供了該菌株的用途，其應(yīng)用在以殼聚糖為誘導(dǎo)物發(fā)酵產(chǎn)生殼聚糖酶中。
同時本發(fā)明還涉及一種殼聚糖酶，其由保藏編號為CGMCC N0.7024的芽孢桿菌(Bacillus sp.) Dg,以殼聚糖為誘導(dǎo)物發(fā)酵產(chǎn)生。作為對上述技術(shù)方案的限定,在由芽孢桿菌(Bacillus sp.)Dg以殼聚糖為誘導(dǎo)物發(fā)酵產(chǎn)生殼聚糖酶中，產(chǎn)酶條件為殼聚糖含量為0.5%-2%，牛肉膏含量為0.25-0.35%,溫度為30-40°C，接種量為5%-15%。作為對上述方案的進(jìn)一步限定，其最優(yōu)產(chǎn)酶條件為殼聚糖含量為1%，牛肉膏含量為0.3%，溫度為30°C，接種量為15%。作為對殼聚糖酶反應(yīng)條件的限定，該殼聚糖酶的反應(yīng)溫度為35-55°C，pH為
4.5-6 ο作為對上述方案的限定，該殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為45°C，pH為5.5。此外，本發(fā)明還提供了一種殼寡糖，該殼寡糖是由如上所述的殼聚糖酶降解殼聚糖獲得，殼寡糖聚合度為4-6。上述技術(shù)方案中，利用以殼聚糖為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，采用透明水解圈法篩選獲得的菌株Dg具有產(chǎn)酶能力強(qiáng)、所產(chǎn)殼聚糖酶活性高、且酶降解產(chǎn)物為聚合度4-6的高活性殼寡糖等特點(diǎn)，從而確保了通過本發(fā)明能夠以較低的成本制備大量專一性殼聚糖酶，進(jìn)而獲取高活性殼寡糖。使用保藏編號為GMCC N0.7024的菌株Dg發(fā)酵獲得專一性殼聚糖酶的過程中，發(fā)酵條件確定的依據(jù)是:影響菌體產(chǎn)酶活力的四個主要因素依次為:牛肉膏含量、殼聚糖含量、溫度、接種量。牛肉膏含量是影響酶活性的首要因素，當(dāng)牛肉膏含量過低時會造成發(fā)酵過程菌體營養(yǎng)基質(zhì)的不 足，從而影響菌體生長和產(chǎn)生殼聚糖酶；牛肉膏含量過高會造成培養(yǎng)基配方中碳氮比的失衡，從而導(dǎo)致發(fā)酵液PH嚴(yán)重偏離最適產(chǎn)酶條件，造成酶活較低，同時還會影響發(fā)酵液中殼聚糖酶的穩(wěn)定性，且不經(jīng)濟(jì)；殼聚糖是影響酶活性的第二重要因素，殼聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵培養(yǎng)基中需添加一定量的殼聚糖做誘導(dǎo)物來提高產(chǎn)酶量；發(fā)酵溫度影響菌體生長和產(chǎn)酶，溫度過低菌體生長和產(chǎn)酶較慢，溫度過高菌體易衰老，且不利于產(chǎn)酶；接種量過低，延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率；接種量過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多產(chǎn)生代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)。酶催化殼聚糖水解反應(yīng)溫度過低時，酶促反應(yīng)較慢，效率較低；反應(yīng)溫度過高時，殼聚糖酶的穩(wěn)定性有所降低，在70°C，30min后酶完全失活。反應(yīng)體系pH過高過低均會影響酶活，進(jìn)而影響酶促反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)體系PH值小于等于4.0,大于等于7.0時，該殼聚糖酶喪失酶活。在殼寡糖制備及應(yīng)用研究中，殼寡糖聚合度難以控制，大多為寬聚合度范圍的混合物，其生物活性不穩(wěn)定。采用乙酰丙酮法測定本發(fā)明中所述的專一性殼聚糖酶酶解殼聚糖制備的殼寡糖，其數(shù)均分子量為1246.38，聚合度為4-6，其生物活性較高。


下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作更進(jìn)一步詳細(xì)說明:
圖1是本發(fā)明實(shí)施例所得的酶液通過SDS-PAGE法，得到的殼聚糖酶凝膠電泳 圖2為不同溫度下殼聚糖酶比活力曲線 圖3為不同pH下殼聚糖酶比活力曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
本實(shí)施例涉及了以保藏編號為CGMCC N0.7024的芽孢桿菌(Bacillus sp.)Dg發(fā)酵制備殼聚糖酶的方法，該方法包括以下步驟:
1、菌種活化及發(fā)酵
將保藏的Dg菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，37°C條件下培養(yǎng)24小時，反復(fù)轉(zhuǎn)接兩次，進(jìn)行活化。然后，將活化好的菌種接入P DA液體培養(yǎng)基中，370C，180rpm搖床培養(yǎng)18h制備種子液。最后，按15%的接種量將種子液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，180rpm搖床培養(yǎng)24h。上述培養(yǎng)基的配方，可采用常規(guī)的PDA培養(yǎng)基，如本實(shí)施例中:
斜面種子培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖30g，蛋白胨2g，瓊脂20g, K2HPO4 0.5g, MgSO4 0.5g, VBl 10mg，蒸餾水 IOOOmL0PDA液體培養(yǎng)基:同斜面種子培養(yǎng)基，但未加瓊脂。本實(shí)施例采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(%,w / v)中，可采用常規(guī)的無機(jī)鹽及微量元素。值得說明的是，培養(yǎng)基中牛肉膏及殼聚糖的含量對產(chǎn)酶影響顯著。在本實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基(%,w / V)的配方:NaCl、KCl、MgSO4.7Η20 各 0.5%，K2HPO4 0.075%, FeSO4 0.001%，蛋白胨
0.85%，牛肉膏 0.3%，殼聚糖 1%, pH 7.5。2、提取殼聚糖酶
將發(fā)酵液經(jīng)5000rpm，4°C低溫離心20min，得粗酶液。粗酶液中殼聚糖酶活性為2000U/
ml ο殼聚糖的酶活力測定:以每分鐘催化I μ g殼聚糖轉(zhuǎn)化成殼寡糖所需要的酶量(ml或mg)作為一個酶活單位U。以每ml (或mg)酶液所含的酶活力單位數(shù)為酶比活力。在本實(shí)施例中，酶活的測定采用如下方法:在IOOmL的三角瓶中分別加入50g 3%的殼聚糖膠體溶液，將其預(yù)熱至45°C后分別加入5mL粗酶液，45°C、180rpm條件下進(jìn)行反應(yīng)，定時取樣，滴加lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0 ,沸水浴20min,離心取沉淀，105°C烘干至恒重，稱量沉淀重量，最后根據(jù)沉淀的的減少量計(jì)算酶活。將得到的粗酶液用60%的乙醇醇析沉淀，干燥后得殼聚糖酶的粗品。3、殼聚糖酶相對分子量的確定
首先，將500mL粗酶液用砂芯過濾裝置進(jìn)行抽慮，得到去除菌體的殼聚糖酶溶液。而后，將去除菌體的殼聚糖酶溶液進(jìn)行分級醇析，取60%乙醇醇析沉淀即為殼聚糖酶，得到殼聚糖酶沉淀后再用蒸餾水溶解。采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳，得到的殼聚糖酶凝膠電泳圖，如圖1所示，圖中，I為純化后的酶液，2為標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，根據(jù)樣品蛋白質(zhì)的相對遷移距離對照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(牛血清蛋白)的相對遷移距離，測定殼聚糖酶的相對分子質(zhì)量為41.7kD。4、殼聚糖酶最適反應(yīng)條件的確定 (O最適反應(yīng)溫度的測定
將制備的酶液與殼聚糖底物(3%的殼聚糖溶膠，其pH值為5.0)反應(yīng)，溫度分別設(shè)定為250C、35 °C、45 V、55°C、65 °C，測定剩余酶活力，確定該殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度，其測定曲線如圖2所示。
由圖2可以看出，隨溫度升高，殼聚糖酶的活性先升高后降低，在溫度為45°C時，酶活達(dá)最高。故該殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為45°C。(2)最適反應(yīng)pH值的測定
將制備的酶液與PH為4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5及7.0的殼聚糖底物(3%的殼聚糖溶膠)在45°C反應(yīng)，測定剩余酶活力，檢測此殼聚糖酶反應(yīng)的最適pH值，其測定曲線如圖3所示，由圖3可知，隨pH值的升高，酶活先升高后降低，在pH值為5.5時，酶活最高，故其最適反應(yīng)pH值為5.5。實(shí)施例二
本實(shí)施例涉及殼寡糖的制備，是以實(shí)施例一得到的殼聚糖酶降解殼聚糖獲得，其制備方法如下:
將3%殼聚糖膠體溶液pH5.5預(yù)熱至45°C，之后按每毫升3%殼聚糖膠體溶液加200單位酶活加入殼聚糖酶、180rpm酶解2.5h，滴加lmol/L NaOH調(diào)pH至8.0終止反應(yīng)，4000 r/min離心20分鐘，對上清液進(jìn)行分級醇析，取70%乙醇醇析沉淀，沉淀凍干即為殼寡糖。對如上制備獲得的殼寡糖，采用乙酰丙酮法進(jìn)行分子量測定，其步驟如下:
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密量取 30 μ g/ml GluNH2.HCl 溶液 O、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,分別置于具塞試管中，各加水至5.0ml，再分別加乙酰丙酮溶液lmL，搖勻，置沸水浴中加熱25min，取出，置冷水中冷卻，再加DMABA溶液1ml，加無水乙醇至10mL，搖勻，60°C水浴中保溫lh，放冷，以O(shè)管為空白，在525nm波長處測定A值，以GluNH2.HCl微摩爾數(shù)為縱坐標(biāo)，A值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.8554x — 0.0293，R2= 0.9992。精確量取100 μ g/m l殼寡糖溶液3 ml置于具塞試管中，其余步驟同上，于波長525nm處測定A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖溶液的摩爾濃度，根據(jù)公式計(jì)算殼寡糖的數(shù)均分子量。殼寡糖的數(shù)均分子量M = m/n
式中:m為殼寡糖質(zhì)量，η為殼寡糖的摩爾數(shù)。殼寡糖溶液于525nm處測得A值為0.316，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得n=0.24 μ mol，則該殼寡糖數(shù)均分子量M=1246.38。據(jù)此推算該殼寡糖的聚合度為4-6。綜上所述，本發(fā)明所用的殼聚糖酶活性高、底物專一性強(qiáng)，且利用本發(fā)明的專一性殼聚糖酶能夠降解制得數(shù)均分子量為1246.38，聚合度4-6的殼寡糖，所得殼寡糖純度高，具有較高的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)，其特征在于該菌種的保藏編號為CGMCC No. 7024。
2.一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)的用途，其特征在于其應(yīng)用在以殼聚糖為誘導(dǎo)物發(fā)酵產(chǎn)生殼聚糖酶中。
3.一種殼聚糖酶，其特征在于所述的殼聚糖酶由芽孢桿菌(Bacillus sp.)以殼聚糖為誘導(dǎo)物發(fā)酵產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶，其特征在于產(chǎn)酶條件為殼聚糖含量為O.5%-2%，牛肉膏含量為O. 25-0. 35%，溫度為30-40°C，接種量為5%_15%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的殼聚糖酶，其特征在于最優(yōu)產(chǎn)酶條件為殼聚糖含量為1%，牛肉膏含量為O. 3%，溫度為30°C，接種量為15%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶，其特征在于該殼聚糖酶的反應(yīng)溫度為35-55°C，pH 為 4. 5-6。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的殼聚糖酶，其特征在于該殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為45°C，pH 為 5. 5。
8.一種殼寡糖，其特征在于該殼寡糖由權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述的殼聚糖酶降解殼聚糖獲得，所述的殼寡糖的聚合度為4-6。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菌種及其用途，同時還涉及該菌種所產(chǎn)的殼聚糖酶和由該酶水解獲得的殼寡糖。本發(fā)明所用的殼聚糖酶活性高、底物專一性強(qiáng)，且利用本發(fā)明的專一性殼聚糖酶能夠降解制得數(shù)均分子量為1246.38，聚合度4-6的殼寡糖，所得殼寡糖純度高，具有較高的生物活性。
文檔編號C12N1/20GK103255086SQ20131014726
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月25日
發(fā)明者袁建平, 高永闖, 侯曉強(qiáng), 王淑敏, 李潔, 馬立芝 申請人:廊坊師范學(xué)院