專利名稱：利用透氣性材料進行細胞培養(yǎng)的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域涉及提高細胞培養(yǎng)效率的方法及裝置。所述方法和裝置利用用于氣體交換的透氣性材料，可增加用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的高度，降低透氣裝置的表面積與培養(yǎng)基體積容量的比例，并且整合了傳統(tǒng)的細胞支持支架。所述方法及裝置具有多種益處，包括更有效地使用了庫存空間、培養(yǎng)箱空間、處置空間和勞力以及降低了污染風險。
背景技術(shù)：
細胞的培養(yǎng)是生物技術(shù)的關(guān)鍵因素。在研究階段，細胞培養(yǎng)的量少，但當研究轉(zhuǎn)向有利于人類和動物健康的目的時，培養(yǎng)的量通常會增加。這種數(shù)量的增加通常被稱為放大。某些用于研究階段細胞培養(yǎng)的裝置和方法已經(jīng)發(fā)展成熟，這是因為它們允許培養(yǎng)多種不同的細胞，因此對于大多數(shù)使用者是有用的。這些裝置包括多孔組織培養(yǎng)板、組織培養(yǎng)瓶、滾瓶和細胞培養(yǎng)袋。令人遺憾的是，這些裝置效率低，并且在放大過程中它們在勞力、污染風險以及費用方面的效率就變得更低了。這就需要開發(fā)替代的裝置和方法，這類裝置和方法用于研究并保持改進的放大研究和放大效率。這個討論確定了常規(guī)技術(shù)中的許多缺陷，并且提出解決方法，所述方法隨后將進行更詳細的描述。對于研究規(guī)模的細胞培養(yǎng)來說一個必要的屬性是低復雜性。復雜性降到最低的裝置不需要輔助設(shè)備來混合或灌注用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。它們通常是指靜置裝置。靜置裝置可以再分為兩大類:1)非透氣性且通過氣/液界面給細胞提供氧氣的裝置和2)透氣性且通過穿過裝置的室以氣體交換的方式給細胞提供氧氣的裝置。傳統(tǒng)的陪替氏培養(yǎng)皿、多孔組織培養(yǎng)板、組織培養(yǎng)瓶和多架組織培養(yǎng)瓶屬于第一類。細胞培養(yǎng)袋和室化瓶(compartmentalized flask)屬于第二類。由于包括靜置裝置中培養(yǎng)基駐留高度受限在內(nèi)的各種原因，所有這些靜置裝置的效率都很低。由于提供氣體交換的方法方面的原因,培養(yǎng)基在陪替氏培養(yǎng)皿、多孔組織培養(yǎng)板、組織培養(yǎng)瓶和多架組織培養(yǎng)瓶中的高度受限。為了滿足細胞的需要，氧氣必須從氣/液界面擴散到裝置中駐留有細胞的下表面。為了確保充足的氧氣供應(yīng)，推薦在這些裝置中所采用的用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的最高高度為約3mm。培養(yǎng)基的高度受限會導致各種缺陷。這會形成很小的只能支持少量細胞的培養(yǎng)基體積。培養(yǎng)基需要連續(xù)地取出和添加以維持培養(yǎng)，由此增加了操作的頻度、勞力和污染風險。在裝置中培養(yǎng)更多細胞的唯一方式是使裝置的占地面積更大，從而可以存在更多的培養(yǎng)基。制造占地面積大的裝置從制造觀點來看是個挑戰(zhàn)，很快超過了在典型培養(yǎng)箱和無菌工作臺中可用的空間，使裝置更加難以操作。因此，可商購獲得的細胞培養(yǎng)裝置是小的。因此，放大培養(yǎng)需要多個裝置或選擇更精密、復雜而昂貴的替代方式。依靠氣/液界面來發(fā)揮作用的靜置裝置存在一些固有的問題，組織培養(yǎng)瓶就是一個很好實例。組織培養(yǎng)瓶中允許細胞駐留表面的面積范圍典型地為25cm2至225cm2。推薦用于組織培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基高度在2_和3_之間。例如,Coming 推薦它的T-225cm2瓶工作體積為45ml 67.5ml。因此，IOOOml的培養(yǎng)物需要15 22個T_225cm2瓶。這樣不僅需要給15 22個裝置裝料，從而導致勞力和污染風險增加，而且由于培養(yǎng)瓶以容納約95%氣體和僅5%的培養(yǎng)基的方式進行設(shè)計，因此空間的利用效率非常之低。例如，典型的T-175瓶的占地面積約為23cm長Xllcm寬，高約3.7cm，因此占約936cm3的空間。然而操作時所述培養(yǎng)瓶典型地具有不超過約50ml的培養(yǎng)基。因此，在瓶體(50ml)中存在的培養(yǎng)基相對于瓶體(936cm3)所占的空間顯示出培養(yǎng)瓶容量幾乎95%只不過是氣體?？臻g的低效利用除了浪費寶貴的培養(yǎng)箱空間外，還增加了運輸、滅菌、儲存和處置的費用。常用于研究規(guī)模的細胞培養(yǎng)的裝置的另一個例子是多孔組織培養(yǎng)板。對于傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)瓶，將氣/液界面保持在每一個孔的底部上僅2mm至3mm的高度是標準的操作方法。當在細胞培養(yǎng)實驗室中移動板時，為了防止濺出，典型的可商購獲得的96孔組織培養(yǎng)板的每個孔約9mm深。對于6孔組織培養(yǎng)板，深度增加至約18mm。在96孔板的情況中，氣體約占每個孔的75%，而培養(yǎng)基約占每個孔的25%。在6孔板的情況中，氣體約占每個孔的95%，而培養(yǎng)基約占每個孔的5%。這種低效的幾何形狀增加了裝置運輸、滅菌、儲存和處置的費用。在許多應(yīng)用中，需要通過取出或替換少量的培養(yǎng)基來經(jīng)常供給培養(yǎng)物是會有問題的。例如，如果多孔組織培養(yǎng)板的目的是為了進`行試驗，則操作培養(yǎng)基可能會影響到那些試驗的結(jié)果。而且，由于培養(yǎng)基的量如此之少，只要少量蒸發(fā)就可能會發(fā)生溶質(zhì)濃度的不利變化。允許培養(yǎng)基以較高的高度駐留而不損害細胞培養(yǎng)功能的多孔組織培養(yǎng)板，由于使需要保持培養(yǎng)物存活的操作最小化并且減少因蒸發(fā)引起的濃度變化的量，因此優(yōu)于那些傳統(tǒng)的培養(yǎng)板。頻繁地更換培養(yǎng)基不僅耗時、昂貴，并且導致污染風險的增加。通過特定的液體操作設(shè)備如多道移液槍來緩解所述問題的嘗試并沒有針對問題的來源，即低培養(yǎng)基高度。最好的解決方法是允許在每一個孔中駐留更多的培養(yǎng)基。遺憾地是，這種方法對于傳統(tǒng)培養(yǎng)板是不可能的，這是因為傳統(tǒng)培養(yǎng)板需要通過氣/液界面的方式進行氣體交換。需要有更好的替代傳統(tǒng)裝置的方式。如果有這樣的組織培養(yǎng)裝置:不僅僅依靠氣/液界面來發(fā)揮作用，與使用傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶和多孔板一樣容易，允許在具有同樣的占地面積的裝置中培養(yǎng)更多的細胞，并且容易地和線性地放大，這些有效的改善將使使用細胞來促進人類和動物健康所需費用的降低。本文將顯示如何使用透氣性材料和新的構(gòu)造來達到這個目的。已有不采用氣/液界面作為氣體交換唯一來源的細胞培養(yǎng)裝置的提議，并且已經(jīng)使所述細胞培養(yǎng)裝置進入市場。這種方式依賴于使用下部的透氣性膜來將氣體交換帶到培養(yǎng)基的底部。與僅僅依賴于氣/液界面的裝置相反的是，這種細胞培養(yǎng)裝置允許更多的氣體交換。所述提議和可商購獲得的裝置包括細胞培養(yǎng)袋、室化的透氣瓶、透氣筒、透氣性陪替氏培養(yǎng)皿、透氣性多孔板和透氣性滾瓶。令人遺憾的是，所述的每一種透氣裝置都存在其所固有的低效率和放大缺陷。細胞培養(yǎng)袋、透氣筒、透氣性陪替氏培養(yǎng)皿、透氣性多孔板、室化的透氣瓶和透氣滾瓶的主要缺陷包括培養(yǎng)基高度受限、透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例過大、和對用于培養(yǎng)貼壁細胞的幾何形狀欠佳。結(jié)果使得為放大而必需采用大量的裝置、限制了裝置設(shè)計的選擇方案以及隨著放大的發(fā)生而增加費用和復雜性。對圍繞著透氣裝置的現(xiàn)有技術(shù)所進行的仔細調(diào)查證明了傳統(tǒng)觀念和裝置設(shè)計是如何限制培養(yǎng)基高度和駐留于裝置中的培養(yǎng)基的體積的。1976年，在題目為Diffusion inTissue Cultures on Gas-permeable and Impermeable Supports(Jensen 等，J.Theor.Biol.56,443-458(1976))的文章中，分析了由透氣膜制成的封閉容器的操作理論。Jensen等將擴散描述為培養(yǎng)基中溶質(zhì)運輸?shù)姆绞?，并且該文章提到“擴散按照菲克定律(Fick’ slaws)進行”。Jensen等提到“圖2[Jensen等的]顯示在由透氣性材料制成的袋中培養(yǎng)的細胞的擴散特點”。本文中的

圖1A顯示Jensen等的圖2，其中Dcm是培養(yǎng)基的擴散常數(shù)。本文的圖1B顯示Jensen等的圖3，其中將透氣容器中的PO2和PCO2的穩(wěn)定態(tài)值的模型顯示為基于擴散的整個培養(yǎng)基的線性衰減。在1977 年，Jensen (Jensen, Mona D.“Mass cell culture in a controlledenvironment，，,Cell Culture and its Applications,Academic Pressl977)描述了一種通過使用“透氣無孔的塑料膜”來形成細胞培養(yǎng)裝置的“主要創(chuàng)新”。本文的圖2顯示Jensen的圖2。如圖2所示，該裝置形成了非常低的僅0.76mm的培養(yǎng)基高度和非常高的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體 積的比例。為了放大，該裝置長達30英尺，并且使用常規(guī)的設(shè)備進行灌注。在1981 年，Jensen (Biotechnology and Bioengineering,第 XXIII 卷，第2703-2716頁(1981))特別提到“培養(yǎng)容器設(shè)計必須體現(xiàn)出對于培養(yǎng)的所有細胞來說是固定和恒定的小的擴散距離。該設(shè)計必須使得放大培養(yǎng)不改變擴散距離”。事實上，培養(yǎng)基不應(yīng)當駐留于遠離透氣性膜的高度上的傳統(tǒng)的觀念一直延續(xù)到今天，如通過利用透氣性材料的商業(yè)產(chǎn)品和與它們有關(guān)的專利就是明證。而且，透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的高比例也還繼續(xù)采用。從1981年起，各種透氣的細胞培養(yǎng)裝置已經(jīng)進入市場，并受到了人們的推崇。然而，根據(jù)對用于透氣裝置的發(fā)明、裝置設(shè)計、裝置說明和操作說明書的觀察，繼續(xù)依賴于將擴散作為主要設(shè)計因素的擴散似乎是理所當然的。作為設(shè)計標準，用于擴散的模型限制了培養(yǎng)基的高度，造成透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的高比例，并且提供低效的裝置幾何形狀?？缮藤彨@得的透氣的細胞培養(yǎng)袋形裝置是目前用于細胞培養(yǎng)的標準裝置形式。如同Jensen的構(gòu)造，這些產(chǎn)品允許通過透氣性材料穿過培養(yǎng)基的上下表面進行氣體交換。與Jensen提出的裝置不同的是不需要進行灌注。典型地，它們不進行灌注，而是置于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱中。這降低了費用和復雜性，并且使它們成為市場上可接受的裝置。然而，當其中駐留細胞培養(yǎng)基時，在透氣性膜之間的有限距離對于使它們具有不適合用于有效地放大的幾何形狀。由于需要更多的培養(yǎng)基，袋子的尺寸在橫向方向上必須按比例加大。于是，尺寸超過2升對它們來說由于會使放大需要大量的裝置，因此通常是不可行的。而且，它們與用于傳統(tǒng)裝置的標準的液體處理用具不匹配，從而增加了進行研究規(guī)模的培養(yǎng)的復雜性。袋子是通過將兩片透氣膜層壓在一起而制成的。一個典型的袋子的剖面圖顯示在取自于美國專利N0.5686304的圖3中，這種袋子已經(jīng)被商化為S1-Culture 袋(MedtronicInc.)。傳統(tǒng)靜置細胞培養(yǎng)裝置的一個有利特征是培養(yǎng)基均勻地分布于駐留細胞的區(qū)域中。為確保培養(yǎng)基在整個裝置中的高度恒定的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員特別需要注意調(diào)整培養(yǎng)箱水平。通過觀察圖3中袋子的剖面圖，可以看出為什么不管培養(yǎng)箱的水平如何，培養(yǎng)基在整個下部的透氣性膜上并沒有處于一致的高度。因為膜在周邊進行接合，所以培養(yǎng)基被強制駐留于靠近周邊而不是袋子中別的地方的不同高度。隨著培養(yǎng)基體積的增加，袋子開始呈現(xiàn)出圓柱形，因此培養(yǎng)基分布變得更差。由于形狀不一致，細胞遭遇到潛在的營養(yǎng)梯度。如果袋子中的培養(yǎng)基過多，則下表面將呈非水平狀態(tài)。那樣也會產(chǎn)生問題。駐留于袋子中的懸浮細胞將分布不均。相反，它們將由于重力作用而沉積在低點、堆積并因營養(yǎng)和氧氣在積堆內(nèi)形成梯度而死亡。在貼壁細胞的情況中，它們接種也是不均勻的，這是因為駐留于袋子每一部分的接種物的量發(fā)生變化。如果袋子過滿，除了產(chǎn)生幾何形狀問題之外，培養(yǎng)基的重量超過IOOOml也可能使如美國專利N0.5686304描述的袋子損壞。即使克服袋子的幾何形狀缺陷，基于當培養(yǎng)基駐留的高度過高時擴散障礙將阻止裝置發(fā)揮作用的觀念，與袋子和透氣的其它裝置有關(guān)的說明和專利表明仍然存在缺陷。細胞培養(yǎng)袋是從OriGen Biomedical Group (OriGen PermaLife 袋)、Baxter (與美國專利 N0.4829002、4937194、5935847、6297046B1 相關(guān)的UfecelK X-Fold )、Medtronic (S1-Culture ,美國專利 N0.5686304)、Biovectra (VectraCell ) > 和美國Fluoroseal (VueLife 培養(yǎng)袋系統(tǒng)，被美國專利N0.4847462和4945203所包含)商購的。說明書、操作說明書和/或?qū)＠?guī)定了各產(chǎn)品的培養(yǎng)基的高度和透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例。Pattillo 等(轉(zhuǎn)讓給 Baxter International Inc.的美國專利 N0.4829002 和4937194)指出，一般將袋子“填充到約占總?cè)莘e的四分之一至二分之一，以提供相對高的培養(yǎng)基的體積的內(nèi)表面積與細胞的比例，使得大量的氧氣可以擴散到袋子內(nèi)，并且二氧化碳可以擴散到袋子外，從而有利于細胞的代謝和生長”。根據(jù)Pattillo等的描述，對于Baxter Lifecell X-FoldTM袋子來說，可以獲得最佳培養(yǎng)基高度的是它們的600cm2袋子，該袋子獲得1.0cm至2.0cm的培養(yǎng)基高度，并且透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例為
2.0cm2/ml 至 1.0cm2/ml。VectraCell 袋子的產(chǎn)品說明提到“VectraCelllL的容器可以容納至多達500mL的培養(yǎng)基。VectraCell3L的容器可以容納至多達1500mL的培養(yǎng)基”。因此，如同Baxter袋子那樣，最大培養(yǎng)基體積是袋子總?cè)萘康囊话搿Ｔ谒峁┑母鞣N尺寸的袋子中，3L的袋子所允許的培養(yǎng)基高度最高，為1.92cm，并且最小的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積之比為1.04cm2/ml。對于在產(chǎn)品說明和美國專利5686304中載明的S1-Culture 袋，當駐留于進行物理混合培養(yǎng)基的定軌搖 床中時，推薦的培養(yǎng)基高度的1.6cm。當在混合環(huán)境中使用時,如此可獲得透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例為1.25cm2/mL.由于混合通常用于破壞擴散梯度并且加強溶質(zhì)的轉(zhuǎn)移，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，當袋子不放在定軌搖床中時，培養(yǎng)基的高度應(yīng)會降低。
在VueLife 袋子的產(chǎn)品說明中特別推薦用高度不超過I厘米厚的培養(yǎng)基填充VueLife 培養(yǎng)袋，這是因為“額外的培養(yǎng)基可能會影響營養(yǎng)或氣體的擴散”。因此，有關(guān)擴散的因素限制了 VueLife 袋中的培養(yǎng)基高度。如此在1.0cm的培養(yǎng)基高度獲得了透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積之比為2.0cm2/mloOriGen PermaLife 袋的產(chǎn)品說明載明了在1.0cm的培養(yǎng)基高度(與VueLife 的高度相同)的額定容量。在所提供的各種PermaLife 袋中，它們的120ml的袋子所提供的最小透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例為1.8cm2/mL.
有限的培養(yǎng)基高度的最終結(jié)果是采用這些產(chǎn)品進行放大是不實用的。例如，如果放大Lifecell X-Fold 袋，以使其在2.0cm的培養(yǎng)基高度能夠容納IOL的培養(yǎng)基，其所需的占地面積將至少為5000cm2。這不僅是難以處理的形狀，使占地面積會很快超過標準的用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱，導致需要定做的培養(yǎng)箱。而且，在袋子中所利用的氣體交換面積比所需的面積更大，這是因為所有這些構(gòu)造都依賴袋子的上下表面來進行氣體交換。

這種不實用的幾何形狀已經(jīng)限制了可商購獲得的袋子的尺寸。從各供應(yīng)商獲得的最大袋子在振蕩時所推薦的培養(yǎng)基體積為:0riGen PermaLife 袋的220ml、VueLife 袋的730ml, LiibccliK X-Fold 袋的 1000ml、VectraCell 袋的 1500ml 以及 S1-Culture 袋的2000ml。因此，放大需要用到大量的單個袋子，使該過程的效率由于包括勞力和污染風險加大等各種原因而降低。細胞培養(yǎng)袋的另一個缺點是它們不象常規(guī)培養(yǎng)瓶那樣容易使用。液體進出都很麻煩。它們設(shè)有與注射器、針或泵管適配的管連接。這適合于封閉系統(tǒng)操作，但是對于研究規(guī)模的培養(yǎng)，使用移液槍是處理液體更容易和更常用的方法。當需要加到或取自袋子的培養(yǎng)基的量超過典型的大型注射器的60ml體積時，不能使用移液槍是非常不方便的。在該種情況下，每轉(zhuǎn)移60ml，注射器必須與導管連接又脫接。例如，包含600ml的袋子將需要與60ml注射器進行高達10次的連接和10次的脫接，增加了處理袋子的時間和污染的可能性。為了使連接的次量減到最小，可以使用泵來轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。然而，這增加了小規(guī)模培養(yǎng)的費用和復雜性。許多利用細胞培養(yǎng)袋的雜交瘤核心實驗室一經(jīng)開始就填充它們，并且不再加入細胞，這是由于這些連接和泵的復雜性所引起的高污染風險性。Matusmiya等(美國專利N0.5225346)試圖通過對袋子和培養(yǎng)基儲存室進行整合來解決液體輸送的問題。將培養(yǎng)室和培養(yǎng)基儲存室連接起來，當需要新鮮的培養(yǎng)基時，將培養(yǎng)基從培養(yǎng)基室輸送到培養(yǎng)室。雖然這能夠有助于培養(yǎng)基的輸送，但是沒有解決限制袋子放大效率的培養(yǎng)基高度有限和透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例高的問題。該發(fā)明所提供的培養(yǎng)基高度為0.37cm，透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例為5.4cm2/mL.
筒式透氣的細胞培養(yǎng)裝置已被引入市場，與細胞培養(yǎng)袋不同的是，該裝置具有側(cè)壁。這些類型的裝置利用側(cè)壁來將透氣的上下膜分開。這允許整個裝置的培養(yǎng)基高度一致。遺憾的是，由于這些裝置只含有少量的培養(yǎng)基，因此甚至比袋子更不適合放大，因為它們僅包含少量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基體積小是試圖產(chǎn)生高的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例的結(jié)果。有一種由BioChrystal公司提供的產(chǎn)品稱為OpticcH:這種產(chǎn)品是一種容器，它通過透氣性硅樹脂膜而固定在各具有50cm2表面積的上下表面上。側(cè)壁所包括的材料不是選擇用于氣體交換，而是提供分離上下氣體膜所需要的剛性。產(chǎn)品說明強調(diào)了它的關(guān)鍵特征，“兩個生長表面具有大的表面積與體積的比例”。在Genetic Engineering News的有關(guān)這種產(chǎn)品的一篇文章(2000年12月第20卷第21期)中，專利申請人Barbera-Guillem提到“采用微滴板的占地面積，使膜面積已經(jīng)得到最大化，而體積得到最小化，從而獲得提供具有最大氣體交換的大的生長面積”。這種確定如何使用這種產(chǎn)品的操作程序規(guī)定了只導入IOml培養(yǎng)基，據(jù)此限定培養(yǎng)基可以駐留的高度為0.2cm。涉及這種裝置的美國專利申請N0.10/183132 (2002年6月25日申請)提到高度達到0.5英寸(1.27cm)是可能的，但是更優(yōu)選的高度是約0.07英寸至約0.08英寸(0.18cm至約0.2cm)。也與這種裝置有關(guān)的W00056870提到高度高達20mm是可能的，但是更優(yōu)選的高度為4mm。即使在商業(yè)裝置中采用如該專利中描述的更高的高度，即1.27mm，所述培養(yǎng)基高度也不會超過袋子允許的高度。此外，如此只會將透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例降低到1.0OcmVml，這與所述袋子是相似的。美國專利申請N0.10/183132顯示一種結(jié)構(gòu)，其中裝置只有一個側(cè)面是透氣的。在未經(jīng)商業(yè)化的所述結(jié)構(gòu)中，在0.5英寸(1.27cm)的培養(yǎng)基高度獲得的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例為0.79cm2/ml，該比例比細胞培養(yǎng)袋的要低一些。因此，盡管有側(cè)壁，甚至當幾何形狀允許培養(yǎng)基達到最大高度時，相對于袋子，這種結(jié)構(gòu)也沒有改善放大效率。筒式透氣的細胞培養(yǎng)裝置也已經(jīng)由Laboratories MABIO-1nternationaf 引入市場,該裝置稱為CLINIcell Culture Cassettes。與OpticeU —樣,該裝置的產(chǎn)品設(shè)計與操作說明均沒有提及相對于袋子來說增加了的培養(yǎng)基高度、或降低了的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例。CLlNkdbt 25Culture Cassettes的操作說明提到,駐留于25cm2的下部的透氣性表面上的培養(yǎng)基不應(yīng)當超過10ml。由于下部的透氣性材料的表面積僅為25cm2，因此形成的培養(yǎng)基高度只有0.4cm。而且，由于裝置的頂部和低部均由透氣性材料構(gòu)成，因此透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例高，為5.0cmVmlo CLINIcell 250Culture Cassettes的操作說明提到，駐留于下部250cm2透氣性表面上的培養(yǎng)基不應(yīng)當超過160ml，因此形成的培養(yǎng)基高度低，為0.64cm,并且透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例高，為3.125cm2/mL.
筒式透氣的細胞培養(yǎng)裝置最近也已經(jīng)由Celartis引入市場,稱為Petaka 。與Opticell 和CLINIcell Culture Cassettes 一樣，這些裝置也具有側(cè)壁，該側(cè)壁具有作為分離上下透氣性膜的單元的作用。與那些產(chǎn)品不同`的是，該裝置與標準的移液槍和注射器是相容的，因此液體處理更加方便。然而，該裝置的產(chǎn)品設(shè)計與操作說明均沒有提及相對于袋子來說增加了的培養(yǎng)基高度、或降低了的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例。操作說明提到，駐留于透氣上下表面之間的培養(yǎng)基不應(yīng)當超過25ml，所述上下表面的總表面積為160cm2。產(chǎn)品說明載明“最優(yōu)化的培養(yǎng)基/表面積”為0.156ml/cm2。因此，培養(yǎng)基高度僅為
0.31cm,而最優(yōu)化的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例為6.4cm2/mL.
當回顧這些裝置可獲得的最大培養(yǎng)體積時，可商購獲得的用于放大的筒式透氣的細胞培養(yǎng)裝置的缺陷就會變得清楚。Opticell 提供的培養(yǎng)體積至多達10ml，CLINIcell Culture Cassettes提供的培養(yǎng)體積至多達160ml,而Petaka 提供的培養(yǎng)體積至多達25ml ο因此，僅為進行IOOOrnl的培養(yǎng)，就需要100個Opticeli 筒，7個CLINIcell CultureCassettes,或 40 個 Petaka 筒。Vivascience Sartorius Group將稱為petriPERM的透氣性陪替氏培養(yǎng)皿引進市場。petriPERM35和petriPERM50分別采用常規(guī)的35mm和50mm直徑的陪替氏培養(yǎng)皿產(chǎn)品的形式。底部是透氣性的。PetriPERM35mm培養(yǎng)皿和petriPERM50mm培養(yǎng)皿的高分別為6mm和12mm。Vivascience產(chǎn)品說明顯不petriPERM35的透氣性膜的面積為9.6cm2,最大的液體體積為3.5ml，得到的最大培養(yǎng)基高度為0.36cm。而petriPERM50的透氣性膜面積為19.6cm2，最大液體體積為10ml，得到的最大培養(yǎng)基高度為0.Slcn^petriPERM產(chǎn)品設(shè)計成具有蓋子，其允許培養(yǎng)基的上表面與周圍的氣體交換，下部的透氣性材料允許培養(yǎng)基的下表面與周圍的氣體交換。因此，petriPERM35的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例的最小值為1.74cm2/ml, petriPERM50的最小值為1.96cm2/ml。與其它的透氣裝置一樣，petriPERM產(chǎn)品用于放大的效率也很低。僅為了進行IOOOml的培養(yǎng)，就需要至少100個裝置。而且這些裝置不能作為封閉系統(tǒng)進行操作。Gabridge (美國專利N0.4435508)描述了設(shè)有與陪替氏培養(yǎng)皿一樣的頂蓋的透氣的細胞培養(yǎng)裝置，其設(shè)計用于高分辨的顯微鏡。孔的深度是基于“顯微鏡的最方便的尺寸”，即0.25英寸(0.635cm)。該裝置最大能夠容納0.635cm厚度的培養(yǎng)基。Vivascience Sartorius Group 也已經(jīng)將稱為 Lumox Multiwell 的透氣多孔組織培養(yǎng)板引進市場。這些產(chǎn)品也由Greuner Bio-One分銷。它們采用24孔、96孔和394孔形式。板的底部是由具有非常低的自動熒光的透氣的50微米膜制成。就每個孔的壁高來說，24孔類型的為16.5mm, 96孔類型的為10.9mm, 384孔類型的為11.5mm。就每個孔的培養(yǎng)基的規(guī)定最大工作高度來說，24孔類型的為1.03cm，96孔類型的為0.97cm，384孔類型的為0.91cm。盡管相對于常規(guī)的多孔板培養(yǎng)基高度有所改善，但是它仍然落在其它靜置透氣裝置的限制界限之內(nèi)。Fuller等(W001/92462A1)提出了一種透氣多孔板，該板通過構(gòu)造表面，增加了底部透氣性硅樹脂材料的表面積。然而，壁高被限制為只有“標準微滴板”的高度，因此，相對于傳統(tǒng)板并沒有增加培養(yǎng)基高度。通常，如果靜置透氣的細胞培養(yǎng)裝置可以利用比可商購獲得的裝置所使用的膜更厚的膜，這將是有利的。如美國專利N0.5686304所述，按照依賴于硅樹脂的單室靜置透氣的細胞培養(yǎng)裝置的常規(guī)觀念規(guī)定，適當?shù)墓δ苄枰穸鹊扔诨蛐∮诩s0.005英寸的透氣性材料。S1-Culture 袋由二甲基娃樹脂構(gòu)成，厚約0.0045英寸。Barbera-Guillem等(美國專利申請N0.10/183132)和Barbera-GuiIlem(W000/56870)提到，當膜由下列合適的聚合物構(gòu)成時，透氣性膜的厚度可以在約小于0.00125英寸至約0.005英寸范圍內(nèi)，所述的聚合物包括聚本乙纟布、聚乙纟布、聚碳Ife酷、聚纟布經(jīng)、乙纟布乙Ife乙纟布酷、聚丙纟布、聚諷、聚四氣乙火布或硅氧烷共聚物。保持這樣薄的膜是不利的，這是因為這種膜易于穿孔，在制備中容易形成針孔，并且除了壓延之外，很難通過其它的方法制造，所述的壓延法除了片狀外形之外，不允許其它外形。本文將說明如何超出傳統(tǒng)觀念而增加硅樹脂厚度而不會妨礙細胞培養(yǎng)。改進的靜置透氣裝置是需要的。如果透氣裝置能在豎直方向上放大，效率將會提高，這是因為大量的培養(yǎng)能夠在任何給定占地面積的裝置中進行，并且可以得到更多的人機工程學的設(shè)計方案。室化的靜置透氣裝置是提供了傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置的替代方式的另外一種類型產(chǎn)品。然而，它們的放大效率也為培養(yǎng)基高度受限和過高的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體量的比例所限制。這些類型的裝置對通過將細胞截留在透氣性膜和半透膜之間來形成高密度的培養(yǎng)環(huán)境是特別有用的。盡管未經(jīng)商業(yè)化，但是Vogler (美國專利N0.4748124)公開了室化的裝置結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)將細胞置于靠近透氣性材料，并含有非透氣性的側(cè)壁。這種細胞隔室由下部的透氣性材料構(gòu)成，并且通過上部的半透膜限定。培養(yǎng)基室直接并且完全地駐留于半透膜上。透氣膜駐留于培養(yǎng)基室的頂部。培養(yǎng)基經(jīng)限制而完全駐留于裝置的透氣底部。該專利描述了這樣的試驗，該試驗采用由0.4cm側(cè)壁構(gòu)成的細胞培養(yǎng)室、由0.8cm側(cè)壁構(gòu)成的培養(yǎng)基室、9ml的細胞培養(yǎng)體積、18ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積、22cm2的透氣下膜和22cm2的透氣上膜。這形成了 0.4cm的細胞室培養(yǎng)基高度，并允許培養(yǎng)基駐留于培養(yǎng)基室中的高度為0.8cm。此外，總透氣表面的面積與總培養(yǎng)基體積之比高，為1.76cm2/ml。在一篇題為“ACompartmentalized Device for the Culture of Animal Cells” (Biomat., Art.Cells,Art.0rg.，17 (5) ,597-610 (1989))的文章中，Vogler 提出使用美國專利 N0.4748124 裝置的生物結(jié)果。該文章特別引用1976年Jenson等和1981年Jenson的文章作為“操作的理論基礎(chǔ)”。測試設(shè)備的尺寸描述如下:下部的透氣性膜為28.7cm2、上部的透氣性膜為28.7cm、高度為0.18cm的細胞室壁允許5.1ml的培養(yǎng)基駐留于細胞室中，0.97cm高度的培養(yǎng)基室壁允許27.8ml的培養(yǎng)基駐留于培養(yǎng)基室中。細胞室中培養(yǎng)基的總高度被限制至0.18cm，培養(yǎng)基室中的總高度被限制至0.97cm，透氣總表面積與培養(yǎng)基總體積的比例高，為1.74cm2/mL.
Integra Biosciences銷售有稱為CELLine 室化的透氣產(chǎn)品。如同Vogler的裝置一樣，細胞室有下部的透氣性膜與上部的半透膜限定。然而，與Vogler的幾何形狀不同的是，裝置中所有的培養(yǎng)基不需要全部駐留 于透氣性膜上。僅需要基礎(chǔ)培養(yǎng)基的一部分駐留于半透膜上。該專利包括了 Integra Biosciences產(chǎn)品,該專利與產(chǎn)品說明描述了在細胞室中將液體高度保持低于約15mm的必要性。并描述每平方厘米透氣性膜的表面積5ml至IOml的營養(yǎng)培養(yǎng)基的比例對于細胞維持是適當?shù)?美國專利N0.5693537和美國專利N0.5707869)。盡管就加料頻率最小化來說，增加培養(yǎng)基體積與細胞培養(yǎng)面積的比例是有利的，但是實踐中每平方厘米透氣表面的面積上的培養(yǎng)基高度是有限的。這些專利包括的裝置的商業(yè)設(shè)計表明，它們與其它透氣裝置一樣，限制了可以駐留于細胞上的培養(yǎng)基的量。為了降低直接駐留于細胞上的培養(yǎng)基的高度，培養(yǎng)基體積有一半并沒有直接駐留于半透膜上面的區(qū)域中。裝置的非透氣性側(cè)壁經(jīng)設(shè)計使得當根據(jù)使用說明操作裝置時，CELLine 產(chǎn)品中半透膜上所駐留的培養(yǎng)基的高度在CLlOOO中為約3.8cm，在CL350中為2.6cm,在CL6Well中為1.9cm。當根據(jù)使用說明操作時，細胞培養(yǎng)室中所駐留的培養(yǎng)基的高度在CLlOOO中為15mm，在CL350中為14mm，在CL6Well中為26mm。該專利描述和該裝置采用了在培養(yǎng)基上表面上的氣/液界面。因此，由于穿過裝置的底部以及在培養(yǎng)基的頂部進行氣體交換，因而也限制了氣體交換表面積與培養(yǎng)基體積的比例。就每一裝置的氣體交換表面積與培養(yǎng)基體積的比例來說，CLlOOO的約為0.31cm2/ml,CL350的約為0.32cm2/ml, CL6ffell的約為 1.20cm2/ml。Bader(美國專利N0.6468792)也介紹了室化的透氣裝置。該裝置沒有側(cè)壁，而是采用袋子形式。利用多孔膜進行室化而將細胞與營養(yǎng)物分離。如同其它的室化的透氣裝置一樣，培養(yǎng)基高度也受到了限制。美國專利N0.6468792盡管提到在設(shè)備中可以得到Icm至2cm的培養(yǎng)基高度，但是實際高度需要按“根據(jù)菲克擴散定律(Fick’s law of diffusion)的培養(yǎng)基層”的功能根據(jù)O2供應(yīng)來調(diào)節(jié)。由于袋子的上下表面具有透氣性，因此當該設(shè)備被填充到最大容量時，可獲得的透氣表面的面積的總量與培養(yǎng)基體積的總量的最小比例為
1.0cm2/ml。如果室化的透氣裝置能夠提高在豎直方向的放大潛力，隨著培養(yǎng)量的增加，它們將具有更有效的占地面積。能夠適合于豎向放大的靜置室化的透氣裝置是需要的。已經(jīng)推出了相對于靜置透氣裝置來說旨在提高效率的透氣裝置。該裝置以與傳統(tǒng)滾瓶相似的方式操作，并且試圖通過采用滾動作用混合培養(yǎng)基來改進物質(zhì)的交換。然而沒有取得有效的放大。一個原因是，與靜置裝置一樣，設(shè)計規(guī)格限制了可以駐留的培養(yǎng)基與透氣裝置的壁的距離。這限制了裝置的培養(yǎng)基容積。因此，放大需要多個裝置。Spaulding(美國專利N0.5330908)公開了具有環(huán)形的透氣壁結(jié)構(gòu)的滾瓶。內(nèi)圓筒壁和外圓筒壁與周圍氣體進行交換。壁具有透氣性質(zhì)，可為細胞提供氧，所述細胞駐留于由內(nèi)圓筒壁和外圓筒壁限定的室中。該細胞室被培養(yǎng)基完全填充，就限制細胞剪切來說，這是有利的。Spaulding提到“氧氣效率的下降是培養(yǎng)基中輸送距離的函數(shù)，并且有效性被限制到距離氧氣表面約I英寸或I英寸以下”。因此，Spaulding提到的設(shè)計的缺陷包括為提供充足的氧氣，內(nèi)圓筒壁和外圓筒壁之間的距離保持在等于或小于5.0lcm0以此方式，細胞不能駐留于距離透氣壁超過2.505cm處。那樣還導致透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例為約0.79cm2/mL.此外，由于需要具有中空的透氣中心部分，因此浪費了空間。該裝置每5cm長度僅具有IOOml培養(yǎng)基的內(nèi)部體積,相反,相同長度的傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶具有500ml。培養(yǎng)基體積的受限使這種裝置與傳統(tǒng)滾瓶相比，其放大的效率更低，這是因為相等體積的培養(yǎng)需要更多的瓶子。該裝置的另一個問題是使用了蝕刻孔，孔的直徑為90微米，用于氣體交換。這些孔足夠大到可以允許氣體進入，但是足夠小到可以阻止液體從細胞室中排出。然而，由于大多數(shù)無菌過濾器阻止0.45微米的顆粒，更普遍的是阻止0.2微米的顆粒穿過，因此它們能夠允許細菌透過細胞室。在1992年12月申請的一件專利中，Wolf等(美國專利N0.5153131)描述了一種透氣的生物反應(yīng)器，其具有沿著它的軸滾動的盤狀結(jié)構(gòu)。這種裝置的幾何形狀試圖糾正Schwartz等在美國專利N0.5026650所提出的缺陷。在美國專利N0.5026650中，透氣的管狀插入物駐留于圓筒狀滾瓶內(nèi)，并且外部的殼體不具有透氣性。盡管它對附著在珠子上的貼壁細胞的培養(yǎng)是成功的，但是Wolf等提到該裝置在懸浮細胞培養(yǎng)中并不成功。該裝置設(shè)有一個或兩個透氣的平末端。為了降低離心力的影響，所述盤的直徑被限制至約6英寸。該發(fā)明人提到“培養(yǎng)基中氧 氣的分壓或分壓梯度的降低是滲透性膜的距離的函數(shù)”，這與Jensen在1976年表達的思想方法相同。他們還提到“如果距離滲透性膜太遠，細胞將不會生長”。因此，當盤的兩端具有透氣性時，寬度被限制至小于2英寸。這種尺寸限制意味著該裝置可以容納的大多數(shù)培養(yǎng)基小于1502ml。因此，隨著培養(yǎng)規(guī)模的放大，必須使用越來越多的裝置。而且，透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例必須至少為0.79cm2/cm,并且細胞必須駐留于與透氣的壁的距離小于1.27cm處。此外，該裝置不適合用于現(xiàn)有的實驗室設(shè)備，并且需要特定的旋轉(zhuǎn)裝備和氣泵。在1996年2月提交的一件專利中，Schwarz (美國專利N0.5702941)描述了具有以與滾瓶相似的方式滾動的透氣末端的透氣盤狀生物反應(yīng)器。令人遺憾的是，和美國專利N0.5153131 一樣，所述生物反應(yīng)器的長度被限制至等于或小于2.54cm。除非生物反應(yīng)器的所有的表面都具有透氣性，否則距離甚至變得更小。最大的裝置的直徑為15.24cm。因此，透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例必須至少為0.79ml/cm2,并且細胞絕不會駐留于與透氣的壁的距離大于1.27cm處。即使具有滾動作用，但是相對于傳統(tǒng)靜置培養(yǎng)袋，這也不會使透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例發(fā)生實質(zhì)性的下降，并且隨著培養(yǎng)規(guī)模的放大，將需要越來越多的裝置。來自Synthecon Incorporated 的可商購獲得的稱為 Rotary Cell CultureSystem 的產(chǎn)品系列,該產(chǎn)品結(jié)合了 Spaulding、Schwarz和Wolf等的專利的各個方面。所得產(chǎn)品的培養(yǎng)基容積小，為IOml至500ml，該產(chǎn)品需要通常的滾動裝備，與標準實驗室移液槍不相容，并且與能容納相同體積的培養(yǎng)基的傳統(tǒng)裝置的費用相比，費用非常昂貴。因此它們由于沒有滿足在單個裝置形式提高效率的需要，在市場上幾乎沒有什么影響。Falkenberg等(美國專利N0.5449617和美國專利N0.5576211)描述了采用透析膜室化的透氣滾瓶。該瓶可以容納的培養(yǎng)基的體積為360ml，其中60ml駐留于細胞室中，而300ml駐留于營養(yǎng)室中。在一個實施方式中，瓶的端部均具有滲透性。美國專利N0.5576211提到，當瓶的端部具有透氣性時，“具有至少50cm2的表面積的氣體交換膜已證明適用于35ml的細胞培養(yǎng)”。因此，透氣表面的面積與體積的最小比例為1.43cm2/ml。在另一個實施方式中，瓶體具有透氣性，其表面積為240cm2。該透氣表面可為駐留于該容器中的全部360ml體積的培養(yǎng)基提供氧氣。因此，透氣表面的面積與體積的的最小比例為0.67cm2/mL.瓶子的直徑約5cm，瓶子的長度約15cm。因此，瓶子比傳統(tǒng)滾瓶要小得多，傳統(tǒng)滾瓶的直徑約11.5cm，長度至多達約33cm。盡管這種裝置可用于高密度懸浮細胞培養(yǎng)，但其受限的培養(yǎng)基容量不能減少放大所需要的裝置的數(shù)量。因此，該裝置由于不能提供附著的表面積，因此不適合于貼壁培養(yǎng)。Falkenberg等(美國專利N0.5686301)描述了在美國專利N0.5449617和美國專利N0.5576211所詳細說明的裝置的改進類型。該專利公開了形式為防止內(nèi)部壓力造成損害的活動外殼(collapsible sheathing)的特征。氣體由瓶子端部提供,并且可以通過透氣外殼“擴散進供應(yīng)室”中。令人遺憾的是，由于瓶子的尺寸沒有變，因此不能降低放大所需裝置的數(shù)量。而且所改進的類型仍然不適合于貼壁培養(yǎng)。

Vivascience Sartorius Group 銷售了一種稱為 miniPERM 的產(chǎn)品，該產(chǎn)品與Falkenberg等的專利有關(guān)。細胞室的最大單元為50ml，最大營養(yǎng)單元為400ml。因此，可以駐留于該商業(yè)裝置中的培養(yǎng)基的最大體積為450ml。商業(yè)裝置的尺寸小，并且需要常規(guī)滾動設(shè)備，使其成為無效的解決放大問題的方案。存在改進滾動的透氣裝置，以便使它們能為每個裝置提供更多的培養(yǎng)基，由此減少了放大所需裝置的數(shù)量的需要。如果存在降低的透氣表面的面積與培養(yǎng)基體積的比例，則可以達到上述效果。另一個問題是需要非標準的實驗室設(shè)備來對現(xiàn)有裝置進行操作。標準實驗室設(shè)備的使用還會允許更多的使用者使用這種技術(shù)。先前的討論集中在限制現(xiàn)有和所建議的細胞培養(yǎng)裝置中的放大效率的設(shè)計缺陷上。除了前面描述的限制外，當目的是進行貼壁細胞培養(yǎng)時，另外還有限制放大效率的問題。對于依賴于氣/液界面來提供氧氣的傳統(tǒng)的靜置裝置來說，貼壁細胞培養(yǎng)效率低是由每個裝置的附著表面積受限所造成的。例如，對于陪替氏培養(yǎng)皿、多孔板和組織培養(yǎng)瓶來說，只有裝置的底部適合用于細胞附著。傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶提供了這個問題的一個很好的實例。如前面描述的那樣，典型T-175瓶約占936cm3。然而，它只提供175cm2用于貼壁細胞附著的表面積。因此，占據(jù)空間與生長表面的比例為5.35cm3/cm2，效率非常之低。試圖解決傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶表面積缺陷的產(chǎn)品是存在的。多架組織培養(yǎng)瓶如NUNC CellFactory (美國專利 N0.5310676)和 Corning CellStack (美國專利 N0.6569675)通過在豎直方向堆積聚苯乙烯架來增加表面積。這種裝置設(shè)計成允許培養(yǎng)基和氣體駐留于架子之間。當培養(yǎng)細胞的數(shù)量增加時，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶，這降低了裝置的占地面積。多架培養(yǎng)瓶的外形也比傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶具有更高的空間效率。例如，NUNC Cell Factory的隔板之間的空間約1.4cm，相反，典型T-175培養(yǎng)瓶底部和頂部之間的距離為3.7cm。就滅菌、運輸、儲存、培養(yǎng)箱空間和裝置處置來說，空間使用減少節(jié)省了資金。這種類型的裝置也降低了在放大時的處理量，這是因為不同于對多個組織培養(yǎng)培養(yǎng)瓶進行加料，這種類型的裝置允許對一個多架裝置進行加料。此外，傳統(tǒng)的聚苯乙烯的使用是很容易解決的。遺憾的是，該裝置在效率方面并不是最理想的，因為它的每一個架子都需要氣/液界面來提供氧氣。CeUCube 是一種可由Corning Life Sciences獲得的貼壁細胞培養(yǎng)裝置。它采用與多架組織培養(yǎng)瓶相似的方式構(gòu)造，但是它淘汰了氣/液界面。由于不存在氣體，在豎向堆積的細胞附著架子之間的距離減小了。這減少了裝置所占的空間的量。然而，為了提供氣體交換，需要連續(xù)灌注經(jīng)氧氣處理的培養(yǎng)基。相對于Corning CellStack 來說,這樣會造成極高水平的花費和復雜性，使該裝置不適用于研究規(guī)模的培養(yǎng)。靜置透氣裝置沒有提供比NUNC Cell Factory、Corning CellStack 或CellCube 更好的替代品。細胞培養(yǎng)袋和透氣筒可以提供比傳統(tǒng)組織培養(yǎng)瓶更大的附著面積。這是因為它們能夠允許在裝置的上下表面上培養(yǎng)細胞。然而，適于細胞附著的透氣性材料比傳統(tǒng)的聚苯乙烯要貴得多。而且，即使透氣裝置的上下兩個表面均允許細胞生長，但是相對于占據(jù)同樣占地面積的傳統(tǒng) 的氣/液界面類型的裝置來說，表面積也只是增加了兩倍。此外，仍然存在已在前文描述過的放大缺陷的限制。Fuller等(國際
發(fā)明者約翰·R·威爾遜, 道格拉斯·A·佩奇, 丹·韋爾奇, 艾莉森·羅貝克 申請人:威爾森沃爾夫制造公司