從微生物中制造類視黃醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從微生物中制造類視黃醇的方法，更具體而言，涉及通過在含有親脂性物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生類視黃醇的微生物并從所述親脂性物質(zhì)中分離出類視黃醇從而從微生物中有效地獲得缺乏穩(wěn)定性的類視黃醇的方法。
【專利說明】從微生物中制造類視黃醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從具有類視黃醇(retinoid)生產(chǎn)功效的微生物中制造類視黃醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]類視黃醇屬于在化學上與維生素A相關(guān)的一類親脂性類異戊二烯分子。類視黃醇包含β -紫羅酮環(huán)和多不飽和支化鏈以及醇(例如，視黃醇)、醛(例如，視黃醛)、羧酸(例如，視黃酸)或酯(例如，乙酸視黃酯)官能團。眾所周知的是，這些官能團在人體保健中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如視力保護、骨骼生長和再生、抗氧化效果和防止皮膚老化，并且還可降低癌癥的危險。
[0003]近年來，作為用于改善皺紋和治療皮膚病的化妝品和藥品的有效原料，類視黃醇已經(jīng)引起了極大的關(guān)注。據(jù)估計，類視黃醇在全世界的市場規(guī)模為約160億美元。化學合成的類視黃醇是在市場上商售的代表性原料。視黃醛通過還原戊二烯衍生物而化學合成，視黃醇通過酸化或水解視黃醛而產(chǎn)生。然而，上述的這一化學過程具有諸如復(fù)雜的純化過程和產(chǎn)生不合乎需要的副產(chǎn)物等缺點。動物利用從水果和蔬菜獲得的類胡蘿卜素產(chǎn)生類視黃醇，而植物不能合成類視黃醇。類視黃醇合成的總路徑可能僅體現(xiàn)在含有以視黃醛作為輔基的細菌視紫紅質(zhì)或變形菌視紫紅質(zhì)的特定微生物中。不過，所述微生物產(chǎn)生蛋白質(zhì)組合形式的視黃醛，因此并不優(yōu)選用于大量產(chǎn)生游離的類視黃醇。到目前為止，雖然利用用于生物生產(chǎn)的酶進行了部分有限的嘗試，這些還沒有取得成功的結(jié)果。因此，仍然需要開發(fā)利用經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化的微生物來生產(chǎn)類視黃醇的生物技術(shù)方法。
[0004]類視黃醇由于共軛的活性雙鍵而在化學上不穩(wěn)定，并且容易因熱、氧和光而氧化和同分異構(gòu)化。另外，在生物學方面，類視黃醇容易通過視黃酸而降解。因此，尚未開發(fā)出產(chǎn)生類視黃醇的有效方法?！?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題
[0006]因此，本發(fā)明的目的是提供從微生物中有效地產(chǎn)生類視黃醇的方法。
[0007]技術(shù)方案
[0008]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種從微生物中制造類視黃醇的方法，所述方法包括:在含有親脂性物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有類視黃醇生產(chǎn)功效的微生物；和從所述親脂性物質(zhì)相中分離出類視黃醇。
[0009]所述方法可包括在含有親脂性物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有類視黃醇生產(chǎn)功效的微生物。
[0010]本文所用的術(shù)語“微生物”可包括可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞。微生物可包括可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原核細胞、真核細胞或經(jīng)分離的動物細胞。所述微生物可包括例如細菌、真菌或它們的組合。細菌可包括例如革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或它們的組合。革蘭氏陰性細菌可包括埃希氏菌屬(Escherichia)。革蘭氏陽性細菌可包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)或它們的組合。真菌可包括酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces)或它們的組合。微生物可包括導(dǎo)入其中的天然基因或外源基因。外源基因可以是與類視黃醇生產(chǎn)相關(guān)的基因，例如MEP或MVA路徑中的至少一種基因。動物細胞可以包括用于生產(chǎn)重組蛋白的細胞。例如，可包括CHO細胞、BHK細胞或它們的組合。
[0011]具有類視黃醇生產(chǎn)功效的埃希氏菌屬的微生物可包括天然的或經(jīng)轉(zhuǎn)化的埃希氏菌屬的微生物。天然的埃希氏菌屬的微生物已知具有MEP路徑作為用于合成類視黃醇的固有路徑。經(jīng)轉(zhuǎn)化的埃希氏菌屬的微生物可包含導(dǎo)入其中的與用于合成類視黃醇的固有MEP路徑相關(guān)的基因、與用于合成類視黃醇的外源MVA路徑相關(guān)的基因或它們的組合。MVA路徑基因可以是編碼與從乙酰輔酶A產(chǎn)生IPP相關(guān)的外源甲羥戊酸路徑中的酶的基因。作為另一種選擇，還可以包括已導(dǎo)入了編碼與由上述IPP合成β -胡蘿卜素相關(guān)的酶的基因的菌株。此外，上述微生物可以是具有導(dǎo)入其中的至少兩個拷貝的IPP異構(gòu)酶的微生物，其進而顯示出提升的由IPP至DMAPP的轉(zhuǎn)化。因此，微生物可以產(chǎn)生高濃度的類視黃醇。圖1是示意性顯示視黃醛生物合成的MEP路徑和外源MVA路徑的圖。
[0012]天然的埃希氏菌屬的微生物可包括例如大腸桿菌。埃希氏菌屬大腸桿菌可包括例如 DH5 a、MG1655、BL21 (DE)、S17-1、XLl-Blue、BW25113 或它們的組合。
[0013]經(jīng)轉(zhuǎn)化的埃希氏菌屬的微生物可以轉(zhuǎn)化為具有例如以下基因的微生物:由SEQ.1D N0.1限定的編碼源自糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶/羥基甲基戊二酰(HMG)輔酶A還原酶的基因；由SEQ.1D N0.2限定的編碼源自糞腸球菌的HMG輔酶A合成酶的基因；由SEQ.1D N0.3限定的編碼源自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的甲輕戍酸激酶的基因；由SEQ.1D N0.4限定的編碼源自肺炎鏈球菌的磷酸甲羥戊酸激酶的基因；由SEQ.1D N0.5限定的編碼源自肺炎鏈球菌的甲羥戊酸二磷酸脫羧酶的基因；由SEQ.1D N0.6限定的編碼源自大腸桿菌的異戊烯二磷酸(IPP)異構(gòu)酶的基因；由SEQ.1D N0.7限定的編碼源自成團泛菌(Pantoea agglomerans)的香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)合成酶的基因；由SEQ.1D N0.`8限定的編碼源自成團泛菌的八氫番茄紅素合成酶的基因；由SEQ.1D N0.9限定的編碼源自成團泛菌的八氫番茄紅素脫氫酶的基因；和由SEQ.1D N0.10限定的編碼源自菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)的番爺紅素β_環(huán)化酶的基因。
[0014]經(jīng)轉(zhuǎn)化的埃希氏菌屬的微生物可以是轉(zhuǎn)化為具有由SEQ.1D N0.1至10限定的任一種基因的微生物，并且可以進一步轉(zhuǎn)化為具有選自由例如以下基因組成的組中的至少一種:由SEQ.1D N0.13限定的編碼源自未培育的海洋細菌66Α03的β -胡蘿卜素單加氧酶的基因；由SEQ.1D N0.14限定的編碼源自小家鼠(Mus musculus)的β -胡蘿卜素15，15’ -單加氧酶的基因；由SEQ.1D N0.15限定的編碼源自法老嗜鹽堿單孢菌(Natronomonas pharaonis) ATCC35678 的 brp 樣蛋白 2 (brp2)的基因；和由 SEQ.1D N0.16或17限定的編碼源自鹽沼鹽桿菌(Halobacterium sal inarum) ATCC700922的β -胡蘿卜素單加氧酶的基因；等等。
[0015]可以產(chǎn)生類視黃醇的上述微生物還可轉(zhuǎn)化為具有由SEQ.1D N0.12限定的編碼源自雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)的IPP異構(gòu)酶的基因。
[0016]具有類視黃醇生產(chǎn)功效的微生物可以轉(zhuǎn)化為具有由SEQ.1D N0.11限定的編碼源自大腸桿菌的1-脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)合成酶的基因(dxs)。由于DXP是與固有MEP路徑中的速度決定步驟相對應(yīng)的酶，因此，通過進一步引入編碼DXP合成酶的基因，上述微生物可以以高濃度產(chǎn)生β -胡蘿卜素。
[0017]如果本發(fā)明的具有類視黃醇生產(chǎn)功效的微生物屬于埃希氏菌屬，則其可以是例如保藏號為KCTC11254BP(韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，于2008年I月2日保藏)的大腸桿菌DH5a/pTDHB/pSNA，或保藏號為KCTC11255BP (韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，于2008年I月2日保藏)的大腸桿菌DH5 a /pTDHBSR/pSNAο特別是，大腸桿菌DH5 a /pTDHBSR/pSNA能夠從培養(yǎng)基中的碳源以高生產(chǎn)率產(chǎn)生類視黃醇。
[0018]根據(jù)一個實施方式，上述微生物可以是轉(zhuǎn)化為具有例如以下基因的埃希氏菌屬微生物:由SEQ.1D N0.1限定的編碼源自糞腸球菌的乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶/羥基甲基戊二酰(HMG)輔酶A還原酶的基因；SSEQ.1D N0.2限定的編碼源自糞腸球菌的HMG輔酶A合成酶的基因；由SEQ.1D N0.3限定的編碼源自肺炎鏈球菌的甲羥戊酸激酶的基因；由SEQ.1D N0.4限定的編碼源自肺炎鏈球菌的磷酸甲羥戊酸激酶的基因；由SEQ.1D N0.5限定的編碼源自肺炎鏈球菌的甲羥戊酸二磷酸脫羧酶的基因；由SEQ.1D N0.6限定的編碼源自大腸桿菌的異戊烯二磷酸(IPP)異構(gòu)酶的基因；由SEQ.1D N0.7限定的編碼源自成團泛菌的香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)合成酶的基因；由SEQ.1D N0.8限定的編碼源自成團泛菌的八氫番茄紅素合成酶的基因；由SEQ.1D N0.9限定的編碼源自成團泛菌的八氫番茄紅素脫氫酶的基因；由SEQ.1D N0.10限定的編碼源自菠蘿泛菌的番茄紅素β-環(huán)化酶的基因；由SEQ.1D N0.11限定的編碼源自大腸桿菌的1-脫氧木酮糖_5_磷酸(DXP)合成酶的基因(dxs);和由SEQ.1D N0.12限定的編碼源自雨生紅球藻的IPP異構(gòu)酶的基因。更特別的是，如上所述的這種埃希氏菌屬微生物可以是進一步轉(zhuǎn)化為具有選自由例如以下基因組成的組中的至少一種的埃希氏菌屬微生物:由SEQ.1D N0.13限定的編碼源自未培育的海洋細菌66A03的β -胡蘿卜素單加氧酶的基因；由SEQ.1D N0.14限定的編碼源自小家鼠的β -胡蘿卜素15，15’ -單加氧酶的基因；由SEQ.1D N0.15限定的編碼源自法老嗜鹽堿單孢菌ATCC35678的brp樣蛋白2 (brp2)的基因；和由SEQ.1D N0.16或17限定的編碼源自鹽沼鹽桿菌ATCC700922的β -胡蘿卜素單加氧酶的基因。由SEQ.1D N0.13限定的編碼源自未培育的海洋細菌66Α03的β -胡蘿卜素`單加氧酶的基因可以具有針對大腸桿菌進行了密碼子優(yōu)化的由SEQ.1D N0.32限定的堿基序列。
[0019]在本文中，術(shù)語“類視黃醇”表示在化學上與維生素A相關(guān)的一類化學物質(zhì)。類視黃醇可以具有由環(huán)狀末端基團、多烯支化鏈和極性末端基團構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。由多烯支化鏈中的交替排列的C=C雙鍵形成的共軛體系可顯示出類視黃醇的顏色(通常為黃色、橙色或紅色)。大多數(shù)類視黃醇是生色團。通過改變支化鏈和末端基團，可以產(chǎn)生多種類視黃醇。這些類視黃醇可包括視黃醛、視黃醇、視黃酸、乙酸視黃酯或它們的組合。此外，類視黃醇可以包括視黃醛、視黃醇、視黃酸、乙酸視黃酯或它們的組合在體內(nèi)降解的任何產(chǎn)物。
[0020]類視黃醇是具有20個基礎(chǔ)碳原子的物質(zhì)，并且根據(jù)其所鍵合的脂肪酸輔基，碳原子的最終數(shù)目可能有變化。例如，在乙酸酯鍵合的情況下，最終碳原子數(shù)為22。另一方面，對于油酸鍵合，最終碳原子數(shù)可以為38。
[0021]上述親脂性物質(zhì)可以是具有親脂性的含8至50個碳原子的有機化合物。
[0022]親脂性物質(zhì)可以包括例如具有8至50個碳原子的烷烴化合物、由下式I表示的化合物、由下式2表示的化合物或它們的組合。
[0023][式I]
[0024]R1 (CO) OR2
[0025](其中R1和R2各自獨立地為具有8至50個碳原子的烷基，且CO表示羰基)。
[0026][式2]
[0027]
【權(quán)利要求】
1.一種從微生物中制造類視黃醇的方法，所述方法包括: 在含有親脂性物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有類視黃醇生產(chǎn)功效的微生物；和 從所述親脂性物質(zhì)的相中分離出所述類視黃醇。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述微生物是細菌、真菌、經(jīng)分離的動物細胞或它們的組合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述微生物是埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces)或它們的組合。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述親脂性物質(zhì)是具有8至50個碳原子的烷烴化合物、由下式I表示的化合物、由下式2表示的化合物或它們的組合: [式I]
R1 (CO) OR2 其中R1和R2各自獨立地為具有8至50個碳原子的烷基，并且CO表示羰基， [式2]
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述親脂性物質(zhì)是辛烷、癸烷、十二烷、十四烷、植物角鯊?fù)?、礦物油、肉豆蘧酸異丙酯、乙基己酸鯨蠟酯、二辛酰基癸?；视汀⒔酋?fù)榛蛩鼈兊慕M合。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基與所述親脂性物質(zhì)的體積比為1:0.2~3.0。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在搖動的同時進行所述培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基包含甘油。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基包含葡萄糖。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分離步驟包括:將細胞從培養(yǎng)液中移除，然后從十二烷中分離出所述類視黃醇。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述類視黃醇是選自由視黃醛、視黃醇、視黃基酯和視黃酸組成的組的至少一種。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述微生物是大腸桿菌。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述大腸桿菌是DH5a、MG1655、BL21(DE)、S17-l、XLl-Blue、BW25113 或它們的組合。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述微生物被轉(zhuǎn)化為具有以下基因: 由SEQ.1D N0.1限定的編碼源自糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶/羥基甲基戊二酰(HMG)輔酶A還原酶的基因；SSEQ.1D N0.2限定的編碼源自糞腸球菌的HMG輔酶A合成酶的基因；由SEQ.1D N0.3限定的編碼源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的甲輕戍酸激酶的基因；由SEQ.1D N0.4限定的編碼源自肺炎鏈球菌的磷酸甲羥戊酸激酶的基因；由SEQ.1D N0.5限定的編碼源自肺炎鏈球菌的甲羥戊酸二磷酸脫羧酶的基因；由SEQ.1D N0.6限定的編碼源自大腸桿菌的異戊烯二磷酸(IPP)異構(gòu)酶的基因；*SEQ.1D N0.7限定的編碼源自成團泛菌(Pantoea agglomerans)的香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)合成酶的基因；由SEQ.1D N0.8限定的編碼源自成團泛菌的八氫番茄紅素合成酶的基因；由SEQ.1D N0.9限定的編碼源自成團泛菌的八氫番茄紅素脫氫酶的基因；和由SEQ.1D N0.10限定的編碼源自菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)的番爺紅素β-環(huán)化酶的基因。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述微生物進一步被轉(zhuǎn)化為具有選自由以下基因組成的組的至少一種基因: 由SEQ.1D N0.13限定的編碼源自未培育的海洋細菌66Α03的β -胡蘿卜素單加氧酶的基因；由SEQ.1D N0.14限定的編碼源自小家鼠(Mus musculus)的β -胡蘿卜素15，15’ -單加氧酶的基因；由SEQ.1D N0.15限定的編碼源自法老嗜鹽堿單孢菌(Natronomonas pharaonis)ATCC35678 的 brp 樣蛋白 2 (brp2)的基因；和由 SEQ.1D N0.16或17限定的編碼源自鹽沼鹽桿菌(Halobacterium sal inarum) ATCC700922的β -胡蘿卜素單加氧酶的基因。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述微生物被進一步轉(zhuǎn)化為具有由SEQ.1DN0.32定義的堿基序列的基因，所述序列經(jīng)過了針對大腸桿菌的密碼子優(yōu)化。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述微生物被轉(zhuǎn)化為具有由SEQ.1D N0.11限定的編碼源自大腸桿菌的1-脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)合成酶的基因。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述微生物被轉(zhuǎn)化為具有由SEQ.1D N0.12限定的編碼源自雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)的IPP異構(gòu)酶的基因。
19.如權(quán)利要求1所述的方法`，其中，所述微生物是埃希氏菌屬中的保藏號為KCTCl 1254BP的大腸桿菌DH5 a /pTDHB/pSNA或保藏號為KCTCl 1255BP的大腸桿菌DH5 α /pTDHBSR/pSNA。
【文檔編號】C12N15/70GK103857786SQ201280042839
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月29日
【發(fā)明者】金善原, 張喜貞, 尹相活, 河寶暻, 柳喜敬 申請人:慶尚大學校產(chǎn)學協(xié)力團