一種具有增強(qiáng)的葡萄糖輸入的用于產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于改進(jìn)的甲硫氨酸生產(chǎn)的重組微生物，其包含通過(guò)發(fā)酵從作為主要碳源的葡萄糖產(chǎn)生甲硫氨酸的修飾，和改進(jìn)葡萄糖輸入的修飾，其中通過(guò)修飾至少一種選自ptsG、sgrT、sgrS和dgsA的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。本發(fā)明還涉及一種發(fā)酵性產(chǎn)生甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的方法，其包括以下步驟：-在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上文所述的重組微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，并-從所述培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
【專利說(shuō)明】—種具有增強(qiáng)的葡萄糖輸入的用于產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于甲硫氨酸生產(chǎn)的改進(jìn)的微生物和用于制備甲硫氨酸的工藝。具體地，本發(fā)明涉及一種具有改進(jìn)的葡萄糖輸入的用于產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物，其包含至少一種選自ptsG、sgrS、sgrT或dgsA的基因的經(jīng)修飾的表達(dá)。
[0002]發(fā)明背景
[0003]含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸對(duì)于細(xì)胞代謝是關(guān)鍵的，且在工業(yè)上生產(chǎn)以用作食品或飼料添加劑和醫(yī)藥品。具體而言，甲硫氨酸，作為一種不能由動(dòng)物合成的必需氨基酸，在許多身體功能中起著重要作用。除了其在蛋白質(zhì)生物合成中的作用以外，甲硫氨酸還涉及轉(zhuǎn)甲基作用以及硒和鋅的生物利用度。甲硫氨酸還被直接用作病癥如過(guò)敏和風(fēng)濕熱的治療物。然而，大多數(shù)生產(chǎn)的甲硫氨酸被添加到動(dòng)物飼料中。
[0004]由于動(dòng)物源蛋白質(zhì)的降低的使用(BSE和禽流感的結(jié)果)，對(duì)純甲硫氨酸的需求增加。D, L-甲硫氨酸通常從丙烯醛、甲基硫醇和氰化氫化學(xué)產(chǎn)生。然而，外消旋混合物不如純L-甲硫氨酸作用得好(Saunderson, C.L., 1985)。另外，盡管可例如經(jīng)由N-乙酰-D, L-甲硫氨酸的?；柑幚韽耐庀琢虬彼岙a(chǎn)生純L-甲硫氨酸，但這急劇增加了生產(chǎn)成本。因此，對(duì)純L-甲硫氨酸的增加的需求連同環(huán)境擔(dān)憂使得微生物生產(chǎn)甲硫氨酸成為有吸引力的前景。
[0005]優(yōu)化從微生物 的化學(xué)物生產(chǎn)通常牽涉過(guò)表達(dá)涉及生物合成途徑的蛋白質(zhì)、減弱涉及生物合成途徑抑制的蛋白質(zhì)、或減弱涉及生產(chǎn)不想要的副產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。之前已描述了所有這些用于優(yōu)化微生物中的L-甲硫氨酸生產(chǎn)的方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利 N0.7，790，424、美國(guó)專利 N0.7，611，873、專利申請(qǐng) TO2002/10209、W02006/008097 和W02005/059093);然而，從微生物工業(yè)生產(chǎn)L-甲硫氨酸需要進(jìn)一步的改進(jìn)。
[0006]通常，L-甲硫氨酸由在發(fā)酵工藝中通過(guò)在作為主要碳源的葡萄糖上生長(zhǎng)的微生物產(chǎn)生。在細(xì)菌中，外部葡萄糖被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，并且通過(guò)磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)憐酸化(Meadow 等 1990; Rohwer 等 1996; Tchieu 等 2001)。PTS 由兩種普遍的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì):酶I和HPr、以及一系列糖特異性的酶II復(fù)合物(EU)組成。由大腸桿菌(E.coli)中ptsG編碼的PTS酶IICBele運(yùn)輸并同時(shí)將葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸(G6P)。盡管G6P是葡萄糖代謝中的必要中間物，但其胞內(nèi)積累導(dǎo)致糖-磷酸毒性現(xiàn)象，亦稱為“磷酸糖應(yīng)激”。確實(shí)，已報(bào)告葡萄糖的積累對(duì)細(xì)菌非常有毒，其導(dǎo)致糖化(glycation)、DNA 誘變和生長(zhǎng)抑制(Lee 和 Cerami, 1987; Kadner 等 1992)。
[0007]最近的研究顯示，取決于生理學(xué)條件，大腸桿菌中編碼IICBek的ptsG基因以相當(dāng)有趣的方式在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上受到高度調(diào)節(jié)(Plumbridge, 1998;Kimata等1998; Plumbridge 等 2002;Morita 和A'iba, 2007; G5rke和 Vogel, 2008)。具體地，已鑒定出幾種調(diào)節(jié)水平:
[0008]-通過(guò)許多不同調(diào)節(jié)物(ArcA、Fis、Crp)對(duì)ptsG基因表達(dá)的調(diào)節(jié),且具體地通過(guò)DgsA ( 一種首先稱為Mlc (Making larger colonies)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物)的抑制；[0009]-通過(guò)反義機(jī)制由小RNA sgrS (Sugar transport-related sRNA)對(duì) ptsGmRNA 的去穩(wěn)定;
[0010]-通過(guò)未知機(jī)制由小多肽SgrT對(duì)PtsG活性的控制；和
[0011]-通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物SgrR對(duì)sgrS/sgrT表達(dá)的調(diào)節(jié)。
[0012]由于G6P的毒性和該系統(tǒng)的高度受控和復(fù)雜的性質(zhì)，對(duì)微生物中葡萄糖運(yùn)輸系統(tǒng)的操作非常困難。迄今為止，已進(jìn)行過(guò)幾種嘗試來(lái)改進(jìn)氨基酸生產(chǎn)特別是蘇氨酸生產(chǎn)，即通過(guò)操作PtsG或dgsA基因來(lái)增加葡萄糖輸入(Degussa的W003004675和W003004670 ；Ajinomoto的US2004229320和Degussa的W00281721)。但是，沒(méi)有通過(guò)增加細(xì)菌的葡萄糖輸入來(lái)改進(jìn)甲硫氨酸生產(chǎn)的例子。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明的發(fā)明人克服了上述困難，通過(guò)增加葡萄糖輸入來(lái)改進(jìn)微生物的L-甲硫氨酸產(chǎn)生。因此，在第I個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于改進(jìn)的甲硫氨酸產(chǎn)生的重組微生物，包含:a)通過(guò)發(fā)酵從作為主要碳源的葡萄糖產(chǎn)生甲硫氨酸的修飾，和b)改進(jìn)葡萄糖輸入的修飾，其中通過(guò)修飾至少一種選自ptsG、sgrT、sgrS或dgsA(mlc)的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。
[0015]發(fā)明人顯示，通過(guò)修飾涉及葡萄糖輸入的基因的表達(dá)，葡萄糖到微生物中的輸入得到改進(jìn)，且增加微生物的甲硫氨酸生產(chǎn)。另外，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，對(duì)涉及葡萄糖輸入的基因的表達(dá)的修飾減少副產(chǎn)物酮甲基戊酸(KMV)和高羊毛氨酸(HLA)的產(chǎn)生，如此改進(jìn)產(chǎn)物甲硫氨酸的純度。在一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)了編碼IICB&的基因ptsG的表達(dá)。盡管可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任意手段來(lái)增強(qiáng)PtsG的表達(dá)，但在一個(gè)實(shí)施方案中，在可誘導(dǎo)或組成型啟動(dòng)子的調(diào)控下來(lái)過(guò)表達(dá)基因PtsG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因ptsG不含針對(duì)小RNA sgrS的結(jié)合位點(diǎn)的序列。
[0016]在其他實(shí)施方案中，減弱基`因sgrS、sgrT或dgsA的表達(dá)。減弱基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因sgrS缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因sgrT缺失。在本發(fā)明的一個(gè)別的實(shí)施方案中，基因dgsA缺失。
[0017]另外，可經(jīng)由上述修飾的組合來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因PtsG的表達(dá)增強(qiáng)而基因sgrS的表達(dá)減弱。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因ptsG的表達(dá)增強(qiáng)而基因sgrT的表達(dá)減弱。在一個(gè)別的實(shí)施方案中，基因ptsG的表達(dá)增強(qiáng)而基因sgrS和sgrT的表達(dá)減弱。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因ptsG的表達(dá)增強(qiáng)而基因dgsA的表達(dá)減弱。
[0018]本發(fā)明的微生物經(jīng)過(guò)修飾以產(chǎn)生甲硫氨酸。盡管會(huì)理解所述微生物可包含本領(lǐng)域中已知的任意修飾來(lái)促進(jìn)微生物中甲硫氨酸的產(chǎn)生，但在一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)至少一種以下基因的表達(dá):pyc、pntAB、cysP、cysU、cysff> cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、thrA、編碼具有降低的對(duì) S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)、或編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種基因在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的調(diào)控下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種以下基因的表達(dá)減弱:metj、pykA、pykF、purU、yncA、或 udhAo
[0019]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，減弱基因metj的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，減弱基因metj的表達(dá)而增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)。在一個(gè)別的實(shí)施方案中，減弱基因metj的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)；而且增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表達(dá)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，減弱基因metj的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表達(dá)；而且增強(qiáng)基因cysE的表達(dá)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，減弱基因metj的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表達(dá)；增強(qiáng)基因cysE的表達(dá)；而且增強(qiáng)基因metF和/或metH的表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含一種微生物，其中:a)基因pstG過(guò)表達(dá)和/或不含有sRNA sgrS結(jié)合位點(diǎn)和/或基因sgrS缺失和/或基因 sgrT 缺失和 / 或基因 dgsA 缺失；b)基因 metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA* 和 pyc 的表達(dá)增強(qiáng)；和 c)基因 metj、pykA、pykF、purU和yncA的表達(dá)減弱。
[0020]本發(fā)明的微生物產(chǎn)生更少的酮甲基戊酸(KMV)和高羊毛氨酸(HLA)，且由此產(chǎn)生具有改進(jìn)純度的甲硫氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的甲硫氨酸具有提高的純度。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于發(fā)酵性產(chǎn)生具有提高純度的甲硫氨酸的方法，包括以下步驟:a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述重組微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，并b)從所述培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
[0021]在第2個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵性產(chǎn)生具有提高純度的甲硫氨酸的方法，包括以下步驟:a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，其中所述微生物包含:i)通過(guò)發(fā)酵從作為主要碳源的葡萄糖產(chǎn)生甲硫氨酸的修飾，和ii)改進(jìn)葡萄糖輸入的修飾，其中通過(guò)修飾至少一種選自ptsG、sgrT、sgrS或dgsA的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入，并b)從所述培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
[0022]會(huì)領(lǐng)會(huì)本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于發(fā)酵性產(chǎn)生甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的方法，包括以下步驟:a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述重組微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，并b)從所述培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
[0023]在第3個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵性產(chǎn)生甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的方法，包括以下步驟:a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，其中所述微生物包含:i)通過(guò)發(fā)酵從作為主要碳源的葡萄糖產(chǎn)生甲硫氨酸的修飾，和ii)改進(jìn)葡萄糖輸入的修飾，其中通過(guò)修飾至少一種選自ptsG、sgrT、sgrS或dgsA的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入，并b)從所述培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
[0024]發(fā)明詳述
[0025]在詳細(xì)描述本發(fā)明 之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體例示的方法，而且當(dāng)然可以變化。還應(yīng)理解本文中使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述本發(fā)明具體實(shí)施方案的目的，而不意圖限制僅由所附權(quán)利要求限制的范圍。[0026]本文中引用的所有公開(kāi)出版物、專利和專利申請(qǐng)(無(wú)論作為上文或下文引用)，均通過(guò)全文提述并入本文。然而，引用本文中提及的公開(kāi)出版物的目的僅在于描述和公開(kāi)出版物中報(bào)道的且可能與本發(fā)明使用相關(guān)的方案、試劑和載體。本文中的任何文字都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒(méi)有資格憑借在先發(fā)明而使發(fā)明日早于這類公開(kāi)。
[0027]此外，除非另外指示，本發(fā)明的實(shí)踐采用了本領(lǐng)域技能中的常規(guī)微生物和分子生物學(xué)技術(shù)。這類技術(shù)是技術(shù)人員公知的，且在文獻(xiàn)中全面解釋。參見(jiàn)，例如Prescott等(1999);和 Sambrook 等(1989) (2001)。
[0028]必須注意的是，在用于本文及所附權(quán)利要求時(shí)，單數(shù)形式“一個(gè)/種”、“該”和“所述”等包括對(duì)復(fù)數(shù)的指代，除非上下文另外清楚地指示。如此，例如，提到“一種微生物”包括多種/個(gè)這類微生物，提到“一種酶”包括一種或多種酶，諸如此類。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管可將類似或等同于本文所述那些的任何材料和方法用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的材料和方法。
[0029]如本文中使用的，以下術(shù)語(yǔ)可用于權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)的解釋。
[0030]在所附權(quán)利要求和本發(fā)明的前文描述中，除非上下文另外出于語(yǔ)言表述或必要暗示的需要，詞語(yǔ)“包含/包括”或其變體以涵蓋性意義使用，即指明所述特征的存在但不排除在本發(fā)明的各實(shí)施方案中存在或加入別的特征。
[0031]在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，使用大腸桿菌中對(duì)應(yīng)基因的命名來(lái)鑒別基因和蛋白。然而，且除非另行指明，根據(jù)本發(fā)明這些命名的使用具有更加一般的含意，并涵蓋其它生物更具體而言其它微生物中所有的相應(yīng)基因和蛋白。
[0032]PFAM(比對(duì)和隱藏Markov模型的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)(protein families databaseof alignments and hidden Markov models) ；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白序列比對(duì)的大集合。每個(gè)`PFAM使得能夠顯現(xiàn)多重比對(duì)、發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)域、評(píng)價(jià)生物間的分布、訪問(wèn)其它數(shù)據(jù)庫(kù)并顯現(xiàn)已知的蛋白結(jié)構(gòu)。
[0033]COG (蛋白質(zhì)直向同源組的族(clusters of orthologous groups ofproteins) ;http://www.ncb1.nlm.nih.gov/COG/)是通過(guò)將來(lái)自代表38個(gè)主要系統(tǒng)發(fā)生系的66個(gè)完全測(cè)序的基因組的蛋白序列相比較而獲得的。每個(gè)COG根據(jù)至少三個(gè)系來(lái)限定，其使得能夠鑒定之前保守的域。
[0034]鑒定同源序列及其同源性百分比的手段對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并包括特別是BLAST程序，其可從網(wǎng)站http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/用該網(wǎng)站所示的缺省參數(shù)來(lái)使用?？墒褂美绯绦駽LUSTALW(http://www.eb1.ac.uk/cIustalw/)或MULTALIN(http://bioinf0.genotoul.fr/multalin/multalin.html)用這些網(wǎng)站所不的缺省參數(shù)來(lái)發(fā)掘(exploit)(例如比對(duì))獲得的序列。
[0035]使用GenBank給出的用于已知基因的參照,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定其它生物、細(xì)菌菌株、酵母、真菌、哺乳動(dòng)物、植物等中的等同基因。該常規(guī)工作是使用可通過(guò)與來(lái)源于其它微生物的基因進(jìn)行序列比對(duì)，并設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針克隆另一種生物中相應(yīng)基因而確定的共同序列來(lái)有利地進(jìn)行的。這些分子生物學(xué)常規(guī)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并記載于例如 Sambrook 等(1989)。
[0036]本發(fā)明涉及用于甲硫氨酸產(chǎn)生的重組微生物。具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)增加葡萄糖輸入來(lái)在微生物中改進(jìn)甲硫氨酸產(chǎn)生。
[0037]術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)的甲硫氨酸產(chǎn)生”指增加的甲硫氨酸生產(chǎn)力和/或增加的甲硫氨酸效價(jià)和/或增加的甲硫氨酸/碳源產(chǎn)率和/或增加的甲硫氨酸純度。術(shù)語(yǔ)“增加的甲硫氨酸/碳源產(chǎn)率”定義為在發(fā)酵期間獲得的甲硫氨酸量除以已消耗的葡萄糖量。它可以表示為百分比g甲硫氨酸/g葡萄糖或mol甲硫氨酸/mol葡萄糖。術(shù)語(yǔ)“增加/提高的”在此上下文中描述了相比于沒(méi)有所述修飾的微生物的可測(cè)量的增加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述增加為至少約7%，優(yōu)選為至少約15%，優(yōu)選為至少約25%，最優(yōu)選為至少約30%?？偟募琢虬彼?葡萄糖產(chǎn)率優(yōu)選為至少約7%g/g,優(yōu)選為至少約15%g/g,優(yōu)選為至少約20%g/g,最優(yōu)選為至少約24%g/g。
[0038]用于確定消耗的葡萄糖量和產(chǎn)生的甲硫氨酸量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且在本文別處論述。
[0039]術(shù)語(yǔ)“增加的甲硫氨酸純度”或“具有增加的純度的甲硫氨酸”指發(fā)酵期間獲得的酮甲基戊酸(KMV)和/或高羊毛氨酸(HLA)的量相比于產(chǎn)生的甲硫氨酸的量。在此上下文中，KMV和HLA的量相比于甲硫氨酸量的比率在本發(fā)明的微生物中得到改進(jìn)。該比率可通過(guò)降低產(chǎn)生的KLV和HLA的量，或通過(guò)改進(jìn)產(chǎn)生的甲硫氨酸量而同時(shí)KMV和HLA的濃度保持恒定，或兩者皆是來(lái)改進(jìn)。有利地是，它還指在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)剩余在發(fā)酵液中的葡萄糖量相比于產(chǎn)生的甲硫氨酸量。在本發(fā)明中，剩余在發(fā)酵液中的葡萄糖量相比于產(chǎn)生的甲硫氨酸量在本發(fā)明的微生物中降低。該比率可通過(guò)降低剩余在發(fā)酵液中的葡萄糖量，或通過(guò)改進(jìn)產(chǎn)生的甲硫氨酸量而同時(shí)注入發(fā)酵罐的葡萄糖總量保持恒定，或兩者皆是來(lái)改進(jìn)。
[0040]用于確定包含在培養(yǎng)基中的甲硫氨酸、NAM、KMV、HLA和葡萄糖的量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，L-甲硫氨酸可在使用L-甲硫氨酸(Fluka，Ref64319)作為標(biāo)準(zhǔn)的OPA/Fmoc衍生化之后通過(guò)HPLC測(cè)量。
[0041]如上文論述的，外部葡萄糖被運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌細(xì)胞中且被磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)磷酸化(Meadow等1990; Rohwer等1996; Tchieu等2001)。磷酸化的葡萄糖在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有毒，因此PTS系統(tǒng)受到高度調(diào)節(jié)。這個(gè)，加上該系統(tǒng)較為復(fù)雜的事實(shí)，使得對(duì)該系統(tǒng)的操作非常困難。然而，如下文描述的，發(fā)明人已產(chǎn)生了具有改進(jìn)的葡萄糖輸入的重組微生物。
[0042]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“重組微生物”指未見(jiàn)于自然界中且與自然界中發(fā)現(xiàn)的同等微生物遺傳上不同的細(xì)菌、酵母或真菌。依照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“修飾”指在微生物中引入或誘導(dǎo)的任何遺傳變化。微生物可經(jīng)由新遺傳元件的引入或缺失來(lái)修飾。另外，可通過(guò)迫使開(kāi)發(fā)和進(jìn)化出新的代謝途徑來(lái)修飾微生物，這通過(guò)組合定向誘變和在特定選擇壓力下的進(jìn)化(參見(jiàn)，例如W02004/076659)來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述微生物選自包含以下的組:腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽抱桿菌科(Bacillaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)和酵母科(Saccharomyceteceae)。更優(yōu)選地,所述微生物是腸桿菌科或棒狀桿菌科的物種或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物是大腸桿菌。
[0043]具體地，例子中顯示的是經(jīng)修飾的大腸桿菌菌株，但這些修飾可容易地在同一科的其他微生物上進(jìn)行。
[0044]大腸桿菌屬于腸桿菌科，該科包含革蘭氏陰性的、棒狀、不形成芽孢的成員，通常長(zhǎng)度為1_5μπι。大多數(shù)成員有用于移動(dòng)的鞭毛，但有幾個(gè)屬是不移動(dòng)的。該家族許多成員是在人和其他動(dòng)物的腸中發(fā)現(xiàn)的消化道菌群的正常的一部分，其他在水或土壤中發(fā)現(xiàn)，或者是多種不同動(dòng)物和植物的寄生物。大腸桿菌是最重要的模式生物之一，但腸桿菌科的其他重要成員包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，特別是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和沙門氏菌屬(Salmonella)。
[0045]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)葡萄糖輸入”、“改進(jìn)的葡萄糖輸入”和其語(yǔ)法等同物指增加的葡萄糖攝取速率。術(shù)語(yǔ)“增加的葡萄糖攝取速率”指在發(fā)酵期間消耗的葡萄糖量除以生物質(zhì)濃度。具體地，葡萄糖攝取速率可如下文描述的定義為:
[0046]K=J f其中rs是葡萄糖攝取速率，X是生物質(zhì)濃度。
[0047]葡萄糖攝取速率可描述為其中S是在時(shí)間t時(shí)消耗的葡萄糖量。對(duì)于分
批補(bǔ)料發(fā)酵，在培養(yǎng)期間消耗的葡萄糖量對(duì)應(yīng)于在分批培養(yǎng)物中存在的葡萄糖加上添加于接種物的葡萄糖加上在分批補(bǔ)料階段注入的葡萄糖減去實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的剩余葡萄糖?？墒褂闷渌夹g(shù)且已記載于文獻(xiàn)中:
[0048]-使用熒光葡萄糖類似物(2-(N_(7-硝基苯并-2-氧雜_1，3_二唑-4-基)氨基)-2_ 脫氧葡萄糖(2-(N-(7_nitrobenz-2-oxa-l，3-diazol_4-yl)amino)-2-deoxyglucose 或 2-NBDG))來(lái)測(cè)量葡萄糖攝取速率(Natarajan A.和 SriencF.(1999)metabolic engineering, voll, issue4, 320-333),
[0049]-測(cè)量PtsG 活性(Kornberg H.L.和 Reeves R.E.Biochem.J (1972) 128，1339-1344;Rungrassamee 等,Erc h Microbiol(2008) 190:41-49)，
[0050]-qRT-PCR(定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))概貌分析(profiling),其用于量化特定革巴物如ptsG mRNA并確認(rèn)相應(yīng)基因的增強(qiáng)的表達(dá)。
[0051]術(shù)語(yǔ)“增加/提高的”在此上下文中描述相比于沒(méi)有所述修飾的微生物的可測(cè)量的增加。
[0052]依照本發(fā)明，通過(guò)修飾至少一種選自ptsG、sgrT、sgrS或dgsA的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。此外，通過(guò)PtsG過(guò)表達(dá)或經(jīng)由微生物中增加的PtsG活性實(shí)現(xiàn)的葡萄糖輸入的改進(jìn)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同技術(shù)來(lái)測(cè)量。
[0053]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“修飾表達(dá)”指示經(jīng)由遺傳元件的引入或缺失來(lái)增加或降低基因的表達(dá)。通常，基因的表達(dá)相比于未經(jīng)修飾的等同微生物(即不包含改進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的遺傳元件的引入或缺失的微生物)增加或降低。確定基因的表達(dá)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)是增加還是降低的方法是本領(lǐng)域中公知的，且亦在下文論述。
[0054]依照本發(fā)明，通過(guò)增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。ptsG基因編碼大腸桿菌中的PTS酶IICBelI同義名-EC2.7.1.69 ;蛋白質(zhì)-N(pi)-磷酸組氨酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶；磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的酶II ;PEP-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶酶II ；PTS通透酶)。ptsG基因的核苷酸序列顯示于 SEQ ID NO: 18。
[0055]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)的”、“增強(qiáng)”及其語(yǔ)法等同物，指一種基因的表達(dá)相比于未經(jīng)修飾的等同微生物增加或上調(diào)的修飾。術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)的表達(dá)”、“增加的表達(dá)”或“過(guò)表達(dá)”在本文中可互換使用，并具有類似含義。
[0056]增加微生物中基因表達(dá)的各種手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且包括例如，增加信使RNA的穩(wěn)定性，增加基因拷貝數(shù)，使用更強(qiáng)的啟動(dòng)子，除去調(diào)節(jié)元件或使用具有更高活性的等位基因，或可以通過(guò)組合這些手段。另外，基因表達(dá)可經(jīng)由染色體或染色體外手段增加。例如，可將幾個(gè)基因拷貝通過(guò)重組方法引入微生物基因組中?；蛘?，基因可由就其復(fù)制起點(diǎn)(由此基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù))而言不同的不同類型的質(zhì)粒攜帶?；蚩梢砸?-5拷貝，約20或多達(dá)500拷貝存在，對(duì)應(yīng)于具有嚴(yán)緊復(fù)制的低拷貝數(shù)質(zhì)粒(pSClOl、RK2)、低拷貝數(shù)質(zhì)粒(pACYC、pRSFlOlO)或高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pSK bluescript II)。調(diào)節(jié)元件對(duì)于調(diào)控基因表達(dá)是重要的。例如，可使用具有不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)基因，所述啟動(dòng)子還可以是可誘導(dǎo)的。這些啟動(dòng)子可以是同源或異源的。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全有能力去選擇適宜的啟動(dòng)子；然而，廣泛使用例如啟動(dòng)子Ptrc、Ptac、Plac或lambda啟動(dòng)子Cl。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因ptsG的表達(dá)通過(guò)將該基因置于可誘導(dǎo)或組成型啟動(dòng)子的調(diào)控下得到增強(qiáng)。
[0057]在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因ptsG的表達(dá)通過(guò)除去編碼小RNA sgrS的結(jié)合位點(diǎn)的序列得到增強(qiáng)。
[0058]術(shù)語(yǔ)“除去編碼小RNA sgrS的結(jié)合位點(diǎn)的序列”意指完全或部分缺失小RNA sgrS的結(jié)合位點(diǎn)(SEQ ID NO: 19)，從而阻止小RNA sgrS對(duì)基因ptsG的結(jié)合。
[0059]還通過(guò)減弱基因sgrS和/或基因sgrT和/或基因dgsA的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。sgrS基因編碼大腸桿菌中的小RNA糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)sRNA。sgrS基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID N0:20。sgrT基因編碼大腸桿菌中的小多肽SgrT。sgrT基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID NOjUdgsA基因編碼充當(dāng)幾個(gè)基因(特別是來(lái)自大腸桿菌的ptsG基因和ptsHIcrr操縱子)的轉(zhuǎn)錄阻遏物的全局調(diào)節(jié)物。dgsA基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID N0:22。
[0060]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“減弱的”指基因表達(dá)的部分或完全抑制。該表達(dá)抑制可為基因表達(dá)的抑制，基因表達(dá)所需的啟動(dòng)子區(qū)域的全部或部分缺失，基因編碼區(qū)中的缺失，和/或由較弱的天然或合成啟動(dòng)子替換野生型啟動(dòng)子。優(yōu)選地，基因減弱基本上是該基因的完全缺失，其可由便于鑒定、分離和純化本發(fā)明的菌株的選擇性標(biāo)記基因所替代。例如，對(duì)基因表達(dá)的抑制可通過(guò)同源重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)(Datsenko&Wanner, 2000)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)缺失基因sgrS來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。`在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)缺失基因sgrT來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)缺失基因dgsA來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入葡萄糖輸入。
[0061]在一個(gè)別的實(shí)施方案中，葡萄糖輸入經(jīng)由上述修飾的組合得到改進(jìn)。例如，在本發(fā)明的微生物中，可通過(guò)以下來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入:
[0062]?增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因sgrS的表達(dá)；
[0063]?增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因sgrT的表達(dá)；
[0064]籲增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因dgsA的表達(dá)；
[0065]?增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因sgrS和基因sgrT的表達(dá)；
[0066]?增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因dgsA和基因sgrS的表達(dá)；
[0067]?增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因dgsA和基因sgrT的表達(dá)；
[0068]?增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因dgsA和基因SgrT和sgrS的表達(dá)；
[0069]?減弱基因dgsA的表達(dá)并減弱基因sgrS和/或SgrT的表達(dá)。
[0070]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因sgrS和基因sgrT的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。
[0071]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因dgsA的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。
[0072]更優(yōu)選地，通過(guò)增強(qiáng)基因ptsG的表達(dá)并減弱基因dgsA和基因sgrT和sgrS的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。
[0073]改進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)以改進(jìn)甲硫氨酸產(chǎn)生的修飾不是單獨(dú)進(jìn)行的，而是與促進(jìn)微生物從作為主要碳源的葡萄糖發(fā)酵性產(chǎn)生甲硫氨酸的修飾組合。促進(jìn)微生物中甲硫氨酸產(chǎn)生的修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)至少一種以下基因的表達(dá):pyc、pntAB、cysP、cysU、cysff> cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、thrA、編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)、或編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這些基因中至少一種在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的調(diào)控下。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因thrA*在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子下表達(dá)。
[0074]在另一個(gè)實(shí)施方案中，減弱至少一種以下基因的表達(dá):metj、pykA、pykF、purU、yncA、或udhA。修飾微生物中基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且在上下文中論述。
[0075]另外，通過(guò)微生物從作為主要碳源的葡萄糖發(fā)酵性產(chǎn)生甲硫氨酸可經(jīng)由上述修飾的組合實(shí)現(xiàn)，例如:
[0076]>減弱基因metj的表達(dá)并增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)；
[0077]>減弱基因metj的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)；并增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表達(dá)；
[0078]>減弱基因metj的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表達(dá)；并增強(qiáng)基因cysE的表達(dá)；
[0079]>減弱基因metj的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表達(dá)；增強(qiáng)編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表達(dá)；增強(qiáng)基因cysE的表達(dá)；并增強(qiáng)基因metF和/或metH的表達(dá)。
[0080]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述重組微生物包含以下遺傳修飾:
[0081]a)基因pstG過(guò)表達(dá)和/或不含有sRNA sgrS結(jié)合位點(diǎn)和/或基因sgrS缺失和/或基因sgrT缺失和/或基因dgsA缺失 ；
[0082]b)基因 metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP> metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*和pyc的表達(dá)增強(qiáng)；和
[0083]c)基因 metj、pykA、pykF、purU 和 yncA 的表達(dá)減弱。
[0084]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，并從所述培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
[0085]本領(lǐng)域技術(shù)人員能限定用于依照本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)條件。優(yōu)選地，在20°C至55°C，優(yōu)選25°C至40°C，且更具體地約37°C (對(duì)于大腸桿菌)的溫度發(fā)酵微生物。
[0086]發(fā)酵一般在發(fā)酵罐與無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)基具有已知的、限定的、適應(yīng)于使用的微生物的組成，其含有至少一種簡(jiǎn)單碳源，且若需要的話還含有產(chǎn)生代謝物所需的共-底物。具體地，用于大腸桿菌的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基可具有與M9培養(yǎng)基(Anderson，1946)、M63 培養(yǎng)基(Miller, 1992)或如 Schaefer 等(1999, Anal.Biochem.270:88-96)限定的培養(yǎng)基相同或相似的組成。
[0087]術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵的碳源”指任何能由微生物代謝的碳源，其中底物含有至少一個(gè)碳原子。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，碳源源自可再生原料。可再生原料定義為特定工業(yè)工藝所需要的原材料，其可在短暫延遲中以充足量再生以允許其轉(zhuǎn)化成期望的產(chǎn)物。
[0088]依照本發(fā)明，所述碳源含有葡萄糖。
[0089]在發(fā)酵后，可從培養(yǎng)基回收(且若需要地，純化)甲硫氨酸或其甲硫氨酸衍生物。從培養(yǎng)基回收和純化化合物如甲硫氨酸和甲硫氨酸衍生物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0090]甲硫氨酸衍生物起源于甲硫氨酸轉(zhuǎn)化和/或降解途徑。具體地，這些產(chǎn)物是S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)和N-乙酰甲硫氨酸(NAM)。具體地，NAM是容易回收的甲硫氨酸衍生物，其可分離并通過(guò)脫酰轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸。因此，短語(yǔ)“從培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物”指回收甲硫氨酸、SAM、NAM和所有其他可能有用的衍生物的行為。
[0091]附圖簡(jiǎn)述
[0092]圖1:在菌株I和2的培養(yǎng)期間以g/L計(jì)的剩余葡萄糖濃度。
[0093](?):菌株I稱為Ref菌株；(▲):條件20/20的IPTG濃度中的菌株2，和(.):條件20/80的IPTG濃度中的菌株2。
實(shí)施例
[0094]方案
[0095]已使用數(shù)種方案來(lái)構(gòu)建以下實(shí)施例中描述的產(chǎn)生甲硫氨酸的菌株。
[0096]方案1:通過(guò)同源重組進(jìn)行染色體修飾并選擇重組體(Datsenko&Wanner, (2000))。
[0097]通過(guò)如Datsenko&Wanner (2000)描述的同源重組實(shí)施在指定染色體基因座中的等位基因替換或基因破壞。通過(guò)分別使用PKD3或pKD4質(zhì)粒作為模板的PCR擴(kuò)增由Flp識(shí)別位點(diǎn)包夾的氯霉素(Cm)抗性cat，或卡那霉素(Km)抗性kan。將所得PCR產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化受體大腸桿菌菌株，其攜帶表達(dá)XRed(Y、β、θχο)重組酶的質(zhì)粒pKD46。然后選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化體，并通過(guò)PCR分析使用下表1所列的合適引物來(lái)驗(yàn)證突變基因座的染色體結(jié)構(gòu)。
[0098]所述cat抗性基因可通過(guò)使用攜帶編碼Flp重組酶的基因的質(zhì)粒pCP20(如Datsenko&Wanner (2000)描述的)和攜帶kan基因的質(zhì)粒pKD4交換成kan抗性基因。將PCP20和pKD4質(zhì)粒導(dǎo)入合適的菌株，并將轉(zhuǎn)化體鋪在用卡那霉素補(bǔ)充的37°C LB上來(lái)用以表達(dá)f lp基因，然后通過(guò)使用表1所列寡核苷酸的PCR來(lái)驗(yàn)證生長(zhǎng)的克隆。
[0099]通過(guò)使用質(zhì)粒pCP20如Datsenk0.&ffanner (2000)描述的除去抗性基因。簡(jiǎn)言之，將攜帶PCP20質(zhì)粒的克隆在37°C在LB上培養(yǎng)，然后在30°C測(cè)試抗生素抗性的喪失。接著，通過(guò)使用表1所列引物的PCR來(lái)驗(yàn)證抗生素敏感性的克隆。[0100]方案2:噬菌體Pl的轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0101]通過(guò)Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)將染色體修飾轉(zhuǎn)移至給定的大腸桿菌受體菌株。該方案包括兩個(gè)步驟:(i)在含有抗性有關(guān)的染色體修飾的供體菌株上制備噬菌體裂解物，和(ii)通過(guò)此噬菌體裂解物感染受體菌株。
[0102]制各噬菌體裂解物
[0103]-將100μ I的具有感興趣染色體修飾的菌株MG1655的過(guò)夜培養(yǎng)物接種到IOmlLB+Cm30 μ g/ml 或 Km50 μ g/ml+ 葡萄糖 0.2%+CaCl25mM 中。
[0104]-在37°C伴隨搖動(dòng)溫育30min。 [0105]-加入在供體菌株MG1655上制備的100μ I Pl噬菌體裂解物(約IxlO9噬菌體/ml) ο
[0106]-在37°C搖動(dòng)3小時(shí)直至細(xì)胞完全裂解。
[0107]-添加200μ I氯仿，并渦旋離心。
[0108]-在4500g離心IOmin以除去細(xì)胞碎片。
[0109]-將上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌管。
[0110]-將裂解物保存在4V。
[0111]輊昱
[0112]-將在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的5ml大腸桿菌受體菌株過(guò)夜培養(yǎng)物在1500g離心lOmin。
[0113]-將細(xì)胞沉淀懸浮于2.5ml of MgSO4IOmM, CaCl25mM。
[0114]-用染色體上有修飾的菌株MG1655的100μ I Pl噬菌體來(lái)感染100 μ I細(xì)胞(測(cè)試管)，且作為對(duì)照管的是沒(méi)有Pi噬菌體的100 μ I細(xì)胞和沒(méi)有細(xì)胞的100 μ I Pl噬菌體。
[0115]-在30°C溫育30min，無(wú)搖動(dòng)。
[0116]-向每個(gè)管添加100μ I檸檬酸鈉1Μ，并渦旋離心。
[0117]-添加Iml LB。
[0118]-在37°C伴隨搖動(dòng)溫育I小時(shí)。
[0119]-在7000rpm 離心 3min。
[0120]-鋪板于LB+Cm30 μ g/ml 或 Km50 μ g/ml。
[0121]-37 °C過(guò)夜溫育。
[0122]復(fù)1:以下實(shí)施例中使用的寡核苷酸。
[0123]
【權(quán)利要求】
1.一種用于改進(jìn)的甲硫氨酸產(chǎn)生的重組微生物,其包含: a)通過(guò)發(fā)酵從作為主要碳源的葡萄糖產(chǎn)生甲硫氨酸的修飾，和 b)改進(jìn)葡萄糖輸入的修飾,其中通過(guò)修飾至少一種選自ptsG、sgrT、sgrS或dgsA的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入。
2.權(quán)利要求1的微生物，其中基因PtsG的表達(dá)得到增強(qiáng)。
3.權(quán)利要求2的微生物，其中基因ptsG在可誘導(dǎo)或組成型啟動(dòng)子的調(diào)控下過(guò)表達(dá)。
4.權(quán)利要求2或3的微生物，其中所述基因ptsG不含針對(duì)小RNAsgrS的結(jié)合位點(diǎn)的序列。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的微生物，其中基因sgrS和/或SgrT和/或dgsA的表達(dá)減弱。
6.權(quán)利要求5的微生物,其中基因sgrS和/或SgrT和/或dgsA缺失。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的微生物，其中至少一種以下基因的表達(dá)增強(qiáng):pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、thrA、編碼具有降低的對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸反饋敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)、或編碼具有降低的對(duì)蘇氨酸反饋抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)。
8.權(quán)利要求7的微生物，其中所述至少一種基因在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的調(diào)控下。``
9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的微生物,其中至少一種以下基因的表達(dá)減弱:metj、pykA、pykF、purU、yncA、或 udhA。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的微生物，其中: d)基因pstG過(guò)表達(dá)和/或不含有sRNAsgrS結(jié)合位點(diǎn)和/或基因sgrS缺失和/或基因SgrT缺失和/或基因dgsA缺失； e)基因metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*和pyc的表達(dá)增強(qiáng)；和 f)所述基因metj、pykA、pykF、purU和yncA的表達(dá)減弱。
11.權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物來(lái)自細(xì)菌科腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)。
12.權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌(Escherichiacoli)。
13.一種用于發(fā)酵性產(chǎn)生甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的方法，包括以下步驟: a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的重組微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，并 b)從所述培養(yǎng)基回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
14.一種用于發(fā)酵性產(chǎn)生甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的方法，包括以下步驟: a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物，所述培養(yǎng)基包含含有葡萄糖的可發(fā)酵碳源和硫源，其中所述微生物包含: ` 1.通過(guò)發(fā)酵從作為主要碳源的葡萄糖產(chǎn)生甲硫氨酸的修飾，和 i1.改進(jìn)葡萄糖輸入的修飾，其中通過(guò)修飾至少一種選自ptsG、sgrT>sgrS或dgsA的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)葡萄糖輸入，并b)從所述培養(yǎng)基回收甲 硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
【文檔編號(hào)】C12P13/12GK103781913SQ201280042510
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月29日
【發(fā)明者】W.迪斯徹特, R.菲格 申請(qǐng)人:代謝探索者公司