用以檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的專一性a1at單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】在此揭示一種可以高親和性方式與甲1型-胰蛋白酶(alpha?1-antitrypsin，A1AT)的同形異構(gòu)物結(jié)合的單克隆抗體，制造此單克隆抗體的融合瘤細(xì)胞(hybridoma?cells)，以及以此單克隆抗體對(duì)疑似患有子宮內(nèi)膜異位的個(gè)體或接受健康檢查的個(gè)體，檢驗(yàn)和/或檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位。
【專利說明】用以檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的專一性A1AT單克隆抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本揭示內(nèi)容是有關(guān)于檢驗(yàn)和/或檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的【技術(shù)領(lǐng)域】。特別是，本揭示內(nèi)容是指可辨識(shí)甲I型-胰蛋白酶(alphal-antitrypsin, A1AT)的單克隆抗體、產(chǎn)生此單克隆抗體的融合瘤，以及此單克隆抗體于個(gè)體的血清樣品內(nèi)檢驗(yàn)和/或檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的用途。
【背景技術(shù)】 [0002]子宮內(nèi)膜異位的疾病特征在于子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮以外的區(qū)域，例如，原本應(yīng)該生長(zhǎng)在子宮內(nèi)部的腺體和間質(zhì)細(xì)胞，卻生長(zhǎng)于子宮外部區(qū)域，同時(shí)仍然保有與正常子宮內(nèi)膜相同的生理形式。
[0003]子宮內(nèi)膜異位不易察覺，往往要到患者在生理期出現(xiàn)疼痛或發(fā)燒癥狀，才會(huì)借由實(shí)際檢查患者腹腔而發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)子宮內(nèi)膜異位的存在。由于患者經(jīng)常輕忽子宮內(nèi)膜異位所產(chǎn)生的癥狀，因而延遲醫(yī)生檢驗(yàn)的時(shí)機(jī)，造成病況復(fù)雜。盡管目前有數(shù)種方法可用來檢驗(yàn)子宮內(nèi)膜異位，然而，病人對(duì)于某些檢測(cè)方法接受度低、或部分方法對(duì)于檢測(cè)特定類型子宮內(nèi)膜異位的敏感度不足。舉例來說，雖然以腹腔鏡來檢驗(yàn)及判斷子宮內(nèi)膜異位相當(dāng)可靠，但是患者對(duì)于此種侵入性檢測(cè)方法的接受度并不高。諸如陰道超音波(Vaginal ultrasonic)或核磁共振檢查(nuclear resonance imaging, MRI)之類的其它方法，則僅能檢測(cè)大于2公分的類纖維瘤(fibroid)或巧克力囊腫(chocolatecyst),且其敏感度尚不足以用來檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位。此外，雖然已知可用一種血清生物標(biāo)記，CA125，來檢驗(yàn)子宮內(nèi)膜異位(Barbieri R.L.,Fertil.Steril.45:767-769, 1986)，然而其檢測(cè)敏感度僅有 15%。
[0004]在2008年7月15日核準(zhǔn)的楊等人的美國(guó)專利第7，399，598號(hào)，揭示一種借由檢測(cè)一群18至40歲女性血清樣品內(nèi)甲I型-胰蛋白酶和/或其片段的含量，來檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的方法。然而，此專利所揭示的檢測(cè)方法是利用熟知的免疫墨點(diǎn)分析來進(jìn)行。有鑒于此，本領(lǐng)域亟需一種具有足夠敏感度、且能以可信賴的方式及早檢測(cè)出子宮內(nèi)膜異位的改良方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本揭示內(nèi)容為一種可辨識(shí)甲I型-抗胰蛋白酶的單克隆抗體、生產(chǎn)此抗體的融合瘤，以及其在生物樣品中(例如，一個(gè)體的血清樣品)檢驗(yàn)和/或檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的用途。
[0006]本揭示內(nèi)容的一方式是可專一性地與AlAT同形異構(gòu)物結(jié)合的單克隆抗體。
[0007]依據(jù)其它實(shí)施方式，提供分別可與AATl和AAT2結(jié)合的2A7和2C8單克隆抗體。此AATl和AAT2兩者皆為AlAT的同形異構(gòu)物，且AATl和AAT2兩者在一個(gè)體的一生物性樣品中的分子量分別約為72和58千道爾頓(kDa)。所述2A7或2C8單克隆抗體，皆可被AlAT的一抗原表位(epitope)所辨識(shí),該抗原表位具有一與SEQ ID NO:3的序列至少90%相同的氨基酸序列；較佳是，此2A7或2C8單克隆抗體可被具有一 SEQ ID NO ,21的氨基酸序列的AlAT抗原表位所辨識(shí)。所述單克隆抗體2A7或2C8分別為IgGl。
[0008]依據(jù)一較佳實(shí)施方式,上述生物性樣品可以是活組織切片樣品(biopsy sample)、全血樣品(whole blood sample)、血衆(zhòng)樣品(plasma sample)、血清樣品(serum sample)、腹腔液(peritoneal fluid)、或上述經(jīng)過純化或過濾后的樣品形式。在一較佳實(shí)施例中,所述生物性樣品是血清樣品。
[0009]本揭示內(nèi)容的另一方式為提供一種可生產(chǎn)前述單克隆抗體2A7的融合瘤(hybridoma)細(xì)胞，其已于2012年I月5日寄存于我國(guó)生物資源保存及研究中心(新竹市，臺(tái)灣)，編號(hào)為:BCRC960440。
[0010]本揭示內(nèi)容的再一方式為提供一種可生產(chǎn)前述單克隆抗體2C8的融合瘤細(xì)胞，其已于2012年I月5日寄存于我國(guó)生物資源保存及研究中心(新竹市，臺(tái)灣)，編號(hào)為:BCRC960441。
[0011]依據(jù)本揭示內(nèi)容的其它方式，提供一種上述單克隆抗體的用途，包括在一個(gè)體的生物樣品中檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的方法和/或套組。
[0012]根據(jù)本揭示內(nèi)容的一實(shí)施方式，提供一種使用本揭示內(nèi)容的抗體來檢驗(yàn)子宮內(nèi)膜異位的方法。此方法包括以下步驟:采取一個(gè)體的一生物性樣品；讓該生物性樣品與一 2A7或2C9單克隆 抗體接觸；以及檢測(cè)個(gè)別與AATl或AAT2結(jié)合的2A7或2C8單克隆抗體；其中該2A7或2C8單克隆抗體，可分別被具有一 SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的AlAT抗原表位所辨識(shí)；此外，在生物性樣品中該AATl和AAT2的分子量分別約72和58kDa。
[0013]所述生物性樣品可以是活組織切片樣品、全血樣品、血漿樣品、血清樣品、腹腔液或上述經(jīng)過純化或過濾后的樣品形式。在一較佳的實(shí)施例中，所述生物性樣品是血清樣品。
[0014]本揭示內(nèi)容的范疇亦涵蓋于個(gè)體的生物性樣品中檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的檢測(cè)套組。
[0015]依據(jù)一實(shí)施方式，此套組包含至少一種本發(fā)明的單克隆抗體；至少一試劑，其適用于個(gè)體的生物樣品中檢測(cè)與AATl或AAT2結(jié)合的2A7或2C8單克隆抗體；以及與套組相關(guān)的說明書，其指示如何使用該套組；其中所述的2A7或2C8單克隆抗體，可以被一 AlAT抗原表位所辨識(shí)，此AlAT抗原表位具有一與SEQ ID NO: 3序列90%相同的氨基酸序列，較佳是此AlAT抗原表位具有一 SEQ ID N0:27的氨基酸序列。此外，此AlAT同形異構(gòu)物，即AATl與AAT2，其分子量分別為約72和58kDa。
[0016]透過以下的詳細(xì)說明與附隨的權(quán)利要求將可更了解本揭示內(nèi)容的這些及其它特征。需知以上的概述及以下的詳細(xì)說明僅為例示，用來闡述本揭示內(nèi)容，而非用以限制本揭示內(nèi)容的范疇。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]為讓本揭示內(nèi)容的上述和其它目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，所附圖式的說明如下:
[0018]圖1顯示出依據(jù)本揭示內(nèi)容的一實(shí)施方式，以西方墨點(diǎn)分析，自健康女性或患有子宮內(nèi)膜異位女性所分離的AlAT的結(jié)果，其中AlAT是有或無經(jīng)由N-糖苷消化酶(PNGaseF)進(jìn)行前處理；此外，圖示中的“C”表示控制組；“Endo”表示其血清蛋白是采集自患有子宮內(nèi)膜異位的女性；
[0019]圖2顯示出以實(shí)施例2的(A) 2C8或(B) 2A7單克隆抗體量測(cè)一個(gè)體內(nèi)所表現(xiàn)出來的AlAT含量的免疫墨點(diǎn)分析的定量結(jié)果。這些個(gè)體被分成5組，控制組由28位未患有子宮內(nèi)膜異位癥的女性所組成；Endo(+) GnRh (-)1/11組，由89位患有輕度子宮內(nèi)膜異位的女性所組成；Endo(+)GnRh(-) III/IV組，由16位患有重度的子宮內(nèi)膜異位的女性所組成；子宮肌腺癥群組，由23位患有子宮內(nèi)膜異位且轉(zhuǎn)移至腹膜腔的女性所組成；最后，Endo (+)GnRh (+)組，由59位患有骨盆腔子宮內(nèi)膜異位且接受過GnRh治療的女性所組成。*表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性(P值< 0.05)；
[0020]圖3顯示出以CA125作為指標(biāo)測(cè)量個(gè)體內(nèi)所表現(xiàn)出來的AlAT含量的免疫墨點(diǎn)分析結(jié)果。該些個(gè)體被分成5組，控制組由28位未患有子宮內(nèi)膜異位癥的女性所組成；Ecdo (+)GnRh (-)1/11組，由81位患有輕度子宮內(nèi)膜異位的女性所組成；Ecdo (+)GnRh (-)III/IV組，由16位患有重度的子宮內(nèi)膜異位的女性所組成；子宮肌腺癥群組，由22位患有子宮內(nèi)膜異位且轉(zhuǎn)移至腹膜腔的女性所組成；最后，Endo (+)GnRh (+)組，由54位患有骨盆腔子宮內(nèi)膜異位且接受過GnRh治療的女性所組成。*表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性(P值< 0.05)；
[0021]圖4A及圖4B顯示出以2C8(A)和2A7 (B)單克隆抗體自患有子宮內(nèi)膜異位且接受過GnRh治療的女性所采集的血清樣品中檢測(cè)出其血清中AlAT的含量；
[0022]圖4C顯示出，以2C8單克隆抗體自患有子宮肌腺癥且接受過GnRh治療的女性所采集的血清樣品中檢測(cè)出血清中的AlAT含量；
[0023]圖5顯示出依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，2A7單克隆抗體對(duì)實(shí)施例6.1的AlAT合成多肽的反應(yīng)性的結(jié)果，其中以AlAT (0.5微克)and N標(biāo)準(zhǔn)蛋白(I微克)作為標(biāo)準(zhǔn)液；
[0024]圖6顯示出依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式2C8單克隆抗體對(duì)實(shí)施例6.1的AlAT合成多肽的反應(yīng)性的結(jié)果，其中以AlAT (0.5微克)and N標(biāo)準(zhǔn)蛋白(I微克)作為標(biāo)準(zhǔn)液；
[0025]圖7顯示出依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，以AlAT與合成多肽3、14或21共同競(jìng)爭(zhēng)與2A7單克隆抗體的結(jié)合的結(jié)果，其中AlAT:2A7單克隆抗體:合成多肽的摩爾比分別為1:0.5:1、1:0.5:2、1:0.5:3、1:0.5:5、1:0.5:10、1:0.5:20、1:0.5:50 以及 1:0.5:100 ;以及
[0026]圖8顯示出依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，以AlAT和合成多肽3、14或21共同競(jìng)爭(zhēng)與2C8單克隆抗體的結(jié)合結(jié)果，其中AlAT:2A7單克隆抗體:合成多肽的摩爾比例分別為1:0.5:1、1:0.5:2、1:0.5:3、1:0.5:5、1:0.5:10、1:0.5:20、1:0.5:50 以及 1:0.5:100 ；
[0027]圖9顯示出依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，2A7單克隆抗體與不同量(1、5、10或20 ii g)的合成多肽，包括多肽3、多肽21及多肽27與2A7反應(yīng)的反應(yīng)性的結(jié)果，并以PBS溶液作為控制組；
[0028]圖10顯示出依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式2C8單克隆抗體與不同量(1、5、10或20ii g)的合成多肽，包括多肽3、多肽21及多肽27與2C8反應(yīng)的反應(yīng)性的結(jié)果，并以PBS溶液作為控制組。
【具體實(shí)施方式】
[0029]所述實(shí)施方式與專有名詞是為了闡述
【發(fā)明內(nèi)容】
之用，并非用以限制本揭示內(nèi)容范疇。本揭示內(nèi)容范疇也涵蓋并未特意揭示于此，但本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀過本揭示內(nèi)容后可輕易推知的其它實(shí)施方式。
[0030]以下為本說明書中所用特定名詞的說明:[0031]本揭示內(nèi)容所使用的單數(shù)形式的“一”和“該”包含復(fù)數(shù)參照物，除非文義另有規(guī)定，此外，本揭示內(nèi)容所使用的和“一個(gè)或多個(gè)”亦包含一、二、三或以上的復(fù)數(shù)參照物。
[0032]在本揭示內(nèi)容中“抗體(antibodyor antibodies)”一詞為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的名詞，代表結(jié)合至已知抗原的分子或該些分子的活性片段，特別是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部位，即，具有一結(jié)合部位的分子，該結(jié)合部位可透過免疫專一性(immune-specifically)方式與抗原結(jié)合。依據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白可以是任一型式(即，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA 和 IgY)或任一類(即，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或任一次類的免疫球蛋白分子。
[0033]“單克隆抗體(monoclonal antibody) ” 一詞為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的名詞,代表一種于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以單一選殖株(clone)大量生產(chǎn)制造的抗體且所述抗體僅能辨識(shí)單一抗原。典型制造單克隆抗體的方式，是借由融合一正常短生命周期的抗體生產(chǎn)的B細(xì)胞和一生長(zhǎng)快速的細(xì)胞(例如，一不朽細(xì)胞(immortal cell)),其所產(chǎn)生的雜交細(xì)胞或融合瘤，可快速?gòu)?fù)制并從其中產(chǎn)生一可大量生產(chǎn)所述單克隆抗體的選殖株。[0034]以下將詳細(xì)說明本發(fā)明可辨識(shí)甲I型-抗胰蛋白酶(即，A1AT)的單克隆抗體、制造該單克隆抗體的融合瘤細(xì)胞，以及其在一生物樣品內(nèi)(如，一個(gè)體的血清樣品)檢驗(yàn)和/或檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的用途。
[0035]根據(jù)本揭示內(nèi)容的一方式，提供一種可與AlAT同形異構(gòu)物專一性結(jié)合的單克隆抗體。根據(jù)一實(shí)施方式，，可以借由內(nèi)糖苷酶(endoglycosidase)消化移除AlAT上的N-糖苷鏈(N-glycan chains)而制造出所述AlAT同形異構(gòu)物。內(nèi)糖苷酶為一種酶,其可以從糖蛋白中釋放出寡糖(oligosaccharides),或僅裂解多糖鏈的間的殘基(這些殘基并非末端殘基)。適合的內(nèi)糖苷酶包含，但不限于，內(nèi)糖苷酶D、F、F1、F2、G或H。在一實(shí)施例中，以PNGase F來釋放并移除AlAT上的N-糖苷鏈。根據(jù)一較佳實(shí)施方式，兩種AlAT的同形異構(gòu)物分子量分別為72和58kDa。分子量分別約為72和58kDa的AlAT同形異構(gòu)物，分別被命名為“AAT1”和“AAT2”，在本文中被當(dāng)作可與抗AlAT單克隆抗體結(jié)合的抗原，或用以在一個(gè)體的生物性樣品內(nèi)檢測(cè)和/或檢驗(yàn)子宮內(nèi)膜異位。
[0036]為了生產(chǎn)所需的單克隆抗體，先以一適當(dāng)劑量的AlAT對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如，小鼠(mice)、大鼠(rat)或兔子)進(jìn)行初次免疫。一般而言，當(dāng)以AlAT免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，應(yīng)先將佐劑和AlAT混合均勻再予以施用。本發(fā)明的佐劑實(shí)例包含，弗氏完全佐劑(Freund’ scomplete adjuvant) (FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant) (FIA)和氫氧化招佐劑(aluminum hydroxide adjuvant)。然而，主要是借由一靜脈注射(intravenous)、皮下注射(subcutaneous)、腹膜內(nèi)注射(intraperitoneal)或肌肉注射(intramuscular)的方式注射抗原以進(jìn)行免疫，且免疫期間，并沒有特別限制?？梢栽跀?shù)天至數(shù)周的期間內(nèi)進(jìn)行免疫，較佳為在2至3周內(nèi)，施作用I至10次，較佳為2至5次。一旦抗體效價(jià)的吸光值達(dá)到2或更高時(shí)(因免疫作用之故)，即將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靜置2至6個(gè)月，較佳為4至6個(gè)月，更佳為6個(gè)月，直至抗體效價(jià)吸光值降低至0.05-1，較佳為0.05-0.5，更佳為0.05的量為止。
[0037]接著,實(shí)施多次的重復(fù)免疫(re-1mmunization),較佳是在數(shù)周的時(shí)間內(nèi)重復(fù)刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2至5次。在最終免疫后數(shù)天內(nèi)，較佳為3至5天內(nèi)，移除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脾細(xì)胞和區(qū)域性淋巴結(jié)。并且，在開始免疫后即須定期采取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液樣品，以離心分離出血清。借由適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法測(cè)量血清內(nèi)的抗體效價(jià)，這些檢測(cè)方法包含，但不限于，酶免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、酶免疫分析(enzyme immunoassay, EIA)或放射性免疫分析(radio immunoassay, RIA)。在一較佳實(shí)施例中，是借由ELISA分析法檢測(cè)抗體的效價(jià)。接著，對(duì)那些會(huì)對(duì)AlAT同形異構(gòu)物(其是依據(jù)下述步驟制造)產(chǎn)生高抗體效價(jià)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行最終免疫。
[0038]抗體生產(chǎn)(Antibody-producing)細(xì)胞,是由上述被免疫動(dòng)物的脾臟細(xì)胞和區(qū)域性淋巴結(jié)或其類似物所制備而來。在制造抗體生產(chǎn)細(xì)胞的過程中，盡可能將組織碎片和紅血球全部移除。可以使用紅血球去除劑(erythrocyte remover)商品來達(dá)成此目的。此外，亦可使用氯化銨(ammonium chloride)及Tris緩沖液。
[0039]立即將上述制成的抗體生產(chǎn)細(xì)胞與不朽細(xì)胞(即，骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell))融合，以產(chǎn)生融合瘤細(xì)胞(hybridoma cell),其可半永恒的(sem1-eternally)持續(xù)性地增殖，同時(shí)并制造出抗體。可使用衍生自動(dòng)物(如，小鼠)的常用的細(xì)胞株來達(dá)成此一目的?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞株，應(yīng)當(dāng)無法存活于HAT選擇性培養(yǎng)基(成分包含次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧唳(thymidine)以及氨喋呤(aminopterin))中，但當(dāng)所述細(xì)胞與可生產(chǎn)抗體的細(xì)胞融合后，則應(yīng)可生長(zhǎng)于該培養(yǎng)基中。骨髓瘤細(xì)胞的實(shí)例包含，但不限于，小鼠骨髓瘤細(xì)胞株(mouse myeloma cell line)(即，骨髓瘤FO細(xì)胞(myeloma FO cells))以及人類骨髓瘤細(xì)胞株(human myeloma cell line)(即，Karpas 707H)。
[0040]細(xì)胞融合通常是在一細(xì)胞融合促進(jìn)劑(即，聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)，其平均分子量為200至20，000道爾頓(Daltons)或其類似物)存在下，將脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與一市售的骨髓瘤細(xì)胞混合?；蛘?，可在采用電流刺激(例如，電穿孔(electroporation)的市售細(xì)胞融合裝置中進(jìn)行細(xì)胞融合。待細(xì)胞融合后,將細(xì)胞稀釋且培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中。
[0041]從上述融合細(xì)胞中選出欲求的融合瘤，能夠在HAT培養(yǎng)基中存活的融合細(xì)胞將可以形成細(xì)胞群落。收集每一培養(yǎng)孔的上清液，并且檢測(cè)其中是否有AATl或AAT2(即，借由前述步驟制備而成的AlAT的同形異構(gòu)物)抗體效價(jià)?？梢岳肊LISA、EIA或RIA檢測(cè)來確認(rèn)抗體效價(jià)的方法。一旦檢測(cè)出抗體效價(jià)成陽性的培養(yǎng)孔，則將該培養(yǎng)孔內(nèi)所含細(xì)胞，培養(yǎng)于HT培養(yǎng)基(亦即，不含有氨喋呤)中。經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，再次確認(rèn)其上清液的抗體效價(jià)。將最終選定的細(xì)胞進(jìn)行選殖以取得單一細(xì)胞。將會(huì)對(duì)AATl或AAT2表現(xiàn)出高度專一性的選殖株大量增殖至一定程度以建立融合瘤。
[0042]依據(jù)本揭示內(nèi)容的較佳實(shí)施例，有三株融合瘤被選定。其中二株，可分別產(chǎn)生單克隆抗體2A7和2C8，并且分別與AATl和AAT2結(jié)合。
[0043]可以借由已知方法分離或制備出上述融合瘤所制造的單克隆抗體。舉例而言，可借由以低血清濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)融合瘤，收取其培養(yǎng)基的上清液來獲取抗體。此外,亦可以將融合瘤注入至動(dòng)物腹腔內(nèi)，然后收集動(dòng)物的腹水以制備出抗體?？山栌捎H和性管柱(affinity column)、膠體過濾色層分析(gel filtration chromatography)、離子交換樹脂(ion exchange chromatography)或其類似的方法來純化或分離抗體。此外，亦可以適當(dāng)?shù)膽?yīng)用或組合使用上述這些已知方法來獲取抗體。
[0044]根據(jù)本揭示內(nèi)容的一實(shí)施方式，由所選定選殖株產(chǎn)生的單克隆抗體是可專一性結(jié)合AAT1( 即，AlAT的同形異構(gòu)物，其分子量約72kDa)。此單克隆抗體是一種IgGl，且在本文中稱為“2A7”。
[0045]依據(jù)本揭示內(nèi)容的其它實(shí)施方式，由所選定選殖株產(chǎn)生的單克隆抗體是可專一性的結(jié)合AAT2( 即，AlAT的同形異構(gòu)物，其分子量約58kDa)。此單克隆抗體是一種IgGl，且在本文中稱為“2C8”。
[0046]由于AATl和AAT2可當(dāng)成生物標(biāo)記，用來檢測(cè)和/或檢驗(yàn)一個(gè)體的子宮內(nèi)膜異位；因此，可將本揭示內(nèi)容的單克隆抗體用于一方法或?qū)⑵浣M合成套組，以在一生物性樣品(即，該個(gè)體的一血清樣品或抹片樣品)中檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，可讓上述任一單克隆抗體與一生物性樣品反應(yīng)并測(cè)量其中的AlAT同形異構(gòu)物(即，AATl或AAT2)，并以所檢測(cè)結(jié)果作為子宮內(nèi)膜異位的檢測(cè)指標(biāo)。可使用熟知的免疫分析方法來執(zhí)行上述的檢測(cè)方法。
[0048]為了達(dá)成此目標(biāo)，可從疑似患有子宮內(nèi)膜異位的個(gè)體或進(jìn)行健康檢查的個(gè)體身上來采取生物性樣品。這些生物性樣品可以是活組織切片樣品、全血樣品、血漿樣品、血清樣品、尿液樣品、腹腔液、上述經(jīng)過純化或過濾后的樣品形式。讓上述生物性樣品與本揭示內(nèi)容的單克隆抗體反應(yīng)?？山栌梢话鉋LISA或墨點(diǎn)(dot-blot)分析來檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位或檢測(cè)生物性樣品中AATl及AAT2 的含量。
[0049]根據(jù)本揭示內(nèi)容其它實(shí)施方式，可將抗AlAT同形異構(gòu)物(如，AATl或AAT2)的抗體用于一種子宮內(nèi)膜異位檢測(cè)套組內(nèi)或作為可檢測(cè)AATl或AAT2的試劑。
[0050]因此，本案發(fā)明也涵蓋AATl或AAT2檢測(cè)套組，其能以高敏感性個(gè)別地檢測(cè)生物性樣品內(nèi)的AATl或AAT2的含量。本發(fā)明套組包含，至少一選自2A7和2C8的單克隆抗體；至少一試劑，其適用于檢測(cè)一個(gè)體生物性樣品中分別與AATl和AAT2結(jié)合的2A7和2C8 ;以及一與套組相關(guān)的說明書，用以指示如何使用該套組。所述生物性樣品包含，但不限于，活組織切片樣品、全血樣品、血漿樣品、血清樣品或上述經(jīng)過純化或過濾后的樣品形式。此套組的組件包含:一容器；2A7或2C8單克隆抗體；用以檢測(cè)生物性樣品的試劑；以及一放在該容器內(nèi)的說明，用以說明如何使用該單克隆抗體來檢測(cè)該生物樣品中的A1AT。此說明可以是錄音帶、⑶、V⑶或DVD。此套組更包含一陰性控制組，以顯示一個(gè)體中AlAT的正常含量。
[0051]為了決定出可被本發(fā)明2A7或2C8單克隆抗體辨識(shí)的AlAT抗原表位，將完整的AlAT多肽全長(zhǎng)(共具有418個(gè)氨基酸)分為26個(gè)連續(xù)性片段，且每一片段間具有重復(fù)的氨基酸殘基。每個(gè)多肽片段含有約20個(gè)人類AlAT的氨基酸殘基?？梢砸罁?jù)本領(lǐng)域熟知的任何標(biāo)準(zhǔn)多肽合成步驟合成上述這些AlAT衍生多肽。依據(jù)一實(shí)施方式，可以借由固相多月太合成器(solid-phase peptide synthesizer) (ABI433A peptide synthesizer, AppliedBiosystems Inc., Life Technologies Corp., Foster City, CA, USA)并依據(jù)制造商所提供的流程合成上述這些AlAT衍生多肽。將所合成多肽命名為P-1 (SEQ ID NO:1), P-2 (SEQID N0:2),P-3(SEQ ID NO:3),P-4(SEQ ID NO:4),P-5(SEQ ID NO:5),P-6(SEQ ID NO:6),P-7(SEQ ID N0:7)，P-8(SEQ ID NO:8)，P_9(SEQ ID NO:9),P-10(SEQ ID NO:10),P-1l(SEQID NO:11)， P-12(SEQ ID NO:12)， P_13(SEQ ID NO:13)， P_14(SEQ ID NO:14)， P_15(SEQID NO:15)，P-16(SEQ ID NO:16)，P_17(SEQ ID NO: 17)，P_18(SEQ ID NO:18)，P_19(SEQID NO:19)，P-20(SEQ ID NO:20)，P_21(SEQ ID NO:21)，P-22(SEQ ID NO:22)，P-23 (SEQID NO:23), P-24(SEQ ID NO: 24)，P-25 (SEQ ID NO:25)以及 P_26(SEQ ID NO: 26)，其詳述在實(shí)施例1的表1內(nèi)。[0052]本領(lǐng)域技術(shù)人員可借由能預(yù)測(cè)多多肽序列的改變對(duì)于其構(gòu)型的影響的方法(即，計(jì)算機(jī)仿真程序)，而來修飾上述這些合成多肽，因此基于本文揭示信息來“設(shè)計(jì)”或“修飾” AlAT的衍生多肽，并透過測(cè)試此一經(jīng)修飾后的AlAT衍生多肽，來定出哪些被修飾后的AlAT衍生多肽仍保有其預(yù)期功能或構(gòu)形?？蓪Ｒ恍缘匦揎椷@些AlAT衍生多肽來改變與其生理活性無關(guān)的多肽特征。舉例而言，可置換或刪除半胱氨酸(cystein)殘基，以避免不必要的雙硫聯(lián)結(jié)。同樣地，在此研究中，可以改變和/或刪除特定氨基酸，且此變動(dòng)不影響其多肽的生理活性(即，此多肽于免疫分析中能與單克隆抗體2A7或2C8結(jié)合的特性)。因此，本發(fā)明包括合成AlAT衍生多肽的功能性等價(jià)衍生物，包括，具有保留性置換氨基酸的多肽。保留性置換的氨基酸包含以下群組內(nèi)的氨基酸置換:(a)M、1、L、V; (b)F、Y、W; (c)K、R、H; (d):A、G; (e)S、T; (f)Q、N; (g)E、D;以及(h)C、M。
[0053]依據(jù)本發(fā)明一特定實(shí)施方式，此AlAT衍生多肽及全長(zhǎng)的AlAT會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng)，以與單克隆抗體2A7或2C8結(jié)合，因此，可決定出能被本發(fā)明單克隆抗體辨識(shí)的AI AT衍生多肽(即，AlAT抗原表位)。可以借由已知技術(shù)檢測(cè)其與抗體的結(jié)合，例如放射性免疫分析(radio immunoassay, RIA)、酶免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)、三明治免疫分析法(“sandwich” immunoassay)、原位免疫分析(insituimmunoassays)(即，利用膠質(zhì)金(colloidal gold)、酶或放射性同位素標(biāo)記(radioisotopelabels))、西方墨點(diǎn)法(western blot)、凝集分析(agglutination assay)(即，膠體凝集分析(gel agglutination assay)、血液凝集分析(hemagglutination assay)等)、補(bǔ)體結(jié)合抑制試驗(yàn)(complement fixation assay)、免疫突光分析(immunofluorescence assay)以及免疫電泳分析(immunoelectrophoresis assay)等。在一實(shí)施方式中，是借由ELISA分析來測(cè)定抗體結(jié)合。2A7和2C8單克隆抗體皆可被AlAT衍生多肽所辯識(shí)，特別是，可被AIAT合成多肽P_3(SEQ ID NO: 3)所辨 識(shí)。
[0054]較佳是，此AlAT合成多肽包含一與SEQ ID NO:3至少90%相同的氨基酸序列。更佳為，此合成的 AlAT 多肽包含一與 SEQ ID NO: 3 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%或100%相同的氨基酸序列。在一最佳實(shí)施例中，此AlAT合成多肽為一具有SEQ IDNO:27的氨基酸序列。在本文中，序列的“相同度”是指相較于具有一特定長(zhǎng)度的目標(biāo)多肽序列來說，在一多多肽的連續(xù)線性排列的序列中，相同氨基酸殘基的數(shù)目。在此所稱序列的“相同度(idemtity)”，為比較兩個(gè)各別的序列，其氨基酸殘基的相同程度。舉例而言，相同度100%意指比對(duì)兩個(gè)不同分子的20個(gè)氨基酸殘基序列，其20個(gè)殘基皆相同。
[0055]以下實(shí)施例是用來闡明本揭示內(nèi)容特定方式并幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員了解并實(shí)施本揭示內(nèi)容。但本揭示內(nèi)容范疇并不限于這些實(shí)施例中。
[0056]實(shí)施例
[0057]本揭示內(nèi)容的單克隆抗體(monoclonal antibodies, mAbs)、用以制造mAbs的融合瘤及其用途，將進(jìn)一步闡述于下列實(shí)施例當(dāng)中，但本揭示內(nèi)容范疇并不限于這些實(shí)施例中。
[0058]實(shí)施例1抗原的制備
[0059]本實(shí)施例樣品采集對(duì)象為患有子宮內(nèi)膜異位的女性，經(jīng)告知同意后采取其血清樣品。以4倍體積的冰丙酮(含10%(w/v)三氯醋酸(trichloracetic acid, TCA))沉淀血清樣品。將混合物置放于_20°C下90分鐘，接著于4°C下以轉(zhuǎn)速15，OOOxg的速度離心20分鐘，收集沉淀物。再以冰冷的丙酮清洗沉淀物，以轉(zhuǎn)速15，OOOxg的速度再次離心20分鐘。去除上清液，以復(fù)水緩沖液(rehydration buffer) (7M 尿素(urea)、4% CHAPS ([3_ (3_ 膽胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸鹽)、2M硫脲(thiourea)、0.002%溴酹藍(lán)(bromophenolblue)以及65mM 二硫赤鮮醇(dithioerythritol, DTE)將沉淀物溶解。
[0060]以PNGase F處理上述復(fù)水緩沖液內(nèi)所含的蛋白質(zhì)，以移除蛋白質(zhì)的N-糖苷鏈(N-glycan chains),再借由西方墨點(diǎn)法(Western blot)鑒定經(jīng)消化后的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)言的，以等量的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳(10% SDS-PAGE)，接著利用半干式系統(tǒng)(Bio-Radsem1-dry system)將其轉(zhuǎn)潰至PVDF膜(Minipore)上。以TBS緩沖液(含5%脫脂牛奶)(20mM Tris_base、0.5M氯化鈉以及pH 8.0)阻斷非特異性的結(jié)合，待I小時(shí)過后，以含有抗人類 1_ 抗膜蛋白酶抗體(ant1-human 1-antitrypsin antibody)(即，AAT704 抗體，Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California)的 TBS 緩沖液(含 0.1%脫脂牛奶)，于4°C下，隔夜培養(yǎng)。以TBST緩沖液(含0.1% Tween-20的TBS緩沖液)清洗10分鐘，重復(fù)清洗三次后，將其浸泡在另一溶液中，該溶液為TBS緩沖液(含0.1%脫脂牛奶)，其含有一經(jīng)適 當(dāng)溶度稀釋的堿性磷酸酶-共軛山羊抗小鼠IgG 二級(jí)抗體(alkal inephosphatase-conjugated goat ant1-mouse IgG secondary antibody)或辣根過氧化酶共輒山羊抗小鼠 IgG 抗體(horse radish peroxidase (HRP) -conjugated goat ant1-mouseIgG antibody)，于室溫下處理I小時(shí)。將轉(zhuǎn)潰膜以TBST緩沖液及TBS緩沖液大量清洗10分鐘后，再加入NBT/BCIP，其與AP相互作用或以DAB/H202處理，其可與HRP相互作用而呈色。上述結(jié)果顯示于圖1中。
[0061]圖1為在有或無可移除蛋白質(zhì)的N-聚糖鏈的N-聚糖鏈酶(PNGase F))處理后的蛋白質(zhì)抗原(其是分離自患有子宮內(nèi)膜異位的女性)的西方墨點(diǎn)法分析結(jié)果。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩種AlAT的同形異構(gòu)物的蛋白質(zhì)帶，其分子量分別為72和58kDa，并分別命名為AATl和 AAT2。
[0062]實(shí)施例2單克隆抗體的生產(chǎn)
[0063]2.1以甲I型-胰蛋白酶免疫動(dòng)物并測(cè)其抗體效價(jià)量
[0064]以甲I型-胰蛋白酶(A1AT，購(gòu)自Sigma Inc)為小鼠進(jìn)行免疫，于一段約4星期的期間內(nèi)，分別施以30微克/動(dòng)物的劑量2至6次。經(jīng)2次加強(qiáng)劑量后，每周采集小鼠的血液樣品，并立即離心分離出血清。將分離后的血清進(jìn)行系列稀釋，接著以西方墨點(diǎn)法(WesternBlot)測(cè)量其抗體效價(jià)。
[0065]2.2制備抗體生產(chǎn)細(xì)胞
[0066]挑選具有欲求抗體效價(jià)的實(shí)施例2.1的動(dòng)物(即，于西方墨點(diǎn)法中，血清樣品的稀釋濃度為1:5，000，呈現(xiàn)陽性反應(yīng))進(jìn)行融合由脾臟細(xì)胞、免疫動(dòng)物的區(qū)域性淋巴結(jié)中制備出抗體生產(chǎn)細(xì)胞，并且依據(jù)洪等人所述的步驟(J Immunol Methodsl20:151-157 (1989))融合抗體生產(chǎn)細(xì)胞和骨髓瘤FO細(xì)胞株，而產(chǎn)生融合瘤。簡(jiǎn)言之，以無血清的PM1-1640培養(yǎng)基(含有聚乙二醇(PEG)(分子量約1，500Da))，混合IxlO6細(xì)胞/毫升的脾臟細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與2xl06細(xì)胞/毫升的融合瘤細(xì)胞。待融合后，以習(xí)知的方式(如，利用限制稀釋)復(fù)制該些雜交細(xì)胞。
[0067]2.3建立融合瘤
[0068]于細(xì)胞融合后的10-14天，依據(jù)實(shí)施例2.2所述的步驟讓所選取的細(xì)胞形成細(xì)胞群落。收集每一培養(yǎng)皿上群落-陽性(colony-positve)孔的上清液,并且以ELISA測(cè)定實(shí)施例I的AATl或AAT2抗體效價(jià)是否存在。當(dāng)抗體-陽性孔經(jīng)確認(rèn)過后，將該些細(xì)胞移至24-孔或12-孔盤并且以HT培養(yǎng)基(即，不含有氨喋呤成份的HAT培養(yǎng)基，稱為HT培養(yǎng)基)
置換原培養(yǎng)基。
[0069]取該些最終選定培養(yǎng)孔中所含的細(xì)胞，進(jìn)行選殖以得到單一細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，以含有20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞上清液，以約0.5-2細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度，接種至96-孔盤中。以越低的細(xì)胞量接種至96-孔盤，其接種單一細(xì)胞至單孔內(nèi)的機(jī)率就越高。在接種后7-10天，收集培養(yǎng)皿的上清液并且測(cè)定其抗體效價(jià)。此外，所選定的選殖株，其對(duì)于AATl或AAT2具有高度專一性，相對(duì)的對(duì)于AATl或AAT2的類似物則具有低度的交叉反應(yīng)，并進(jìn)一步的將所述選殖株進(jìn)行一定程度的增殖以形成融合瘤。易言之，選定及培養(yǎng)3株可生產(chǎn)所需單克隆抗體的選殖株，其中兩株所生產(chǎn)的抗體可以高親和性方式專一性地與AAT2結(jié)合，已將其中一株選殖株寄存于我國(guó)生物資源保存及研究中心(新竹市，臺(tái)灣)，編號(hào)為:BCRC960440 ;另一株融合瘤所生產(chǎn)的抗體可以高親和性方式專一性地與AATl結(jié)合，同樣的，此株融合瘤亦已寄存于我國(guó)生物資源保存及研究中心(新竹市，臺(tái)灣)，編號(hào)為:BCRC960441。
[0070]2.4制造單克隆抗體
[0071]借由下述方法從實(shí)施例2.3所建立的融合瘤中純化及制造對(duì)AATl或AAT2具有專一性的單克隆抗體。將約IO6至IO7的融合瘤細(xì)胞注射至小鼠腹腔內(nèi)以大量擴(kuò)增融合瘤細(xì)胞。經(jīng)I至2周后，采集每一只小鼠的腹水以收集單克隆抗體。借由G蛋白質(zhì)(protein G)純化，輔以硫酸銨(NH4)2SO4沉淀而取得IgG抗體。
[0072]經(jīng)上述方式制成的 單克隆抗體對(duì)于AATl以及AAT2具有高親和力，且其分別為IgGl的同形異構(gòu)物，分別命名為2C8以及2A7。
[0073]實(shí)施例3利用實(shí)施例2的單克隆抗體檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位
[0074]以免疫墨點(diǎn)法分析實(shí)施例2的單克隆抗體2A7和2C8的專一性。
[0075]在此實(shí)施例中，血清樣品來自于受告知并經(jīng)其同意而提供樣品的235位女性。將這些受測(cè)者分成五組。其中，控制組由48位未罹患子宮內(nèi)膜異位癥的孕齡女性所組成；Endo(+)GnRh(-)I/II組，由89位患有輕度(或早期)骨盆腔子宮內(nèi)膜異位且未接受性腺刺激素釋放素(gonadotropin-releasing hormone, GnRh)治療的女性所組成；Endo (+)GnRh (-) III/IV組，由16位患有重度骨盆腔子宮內(nèi)膜異位且未接受GnRH治療的女性所組成；子宮肌腺癥群，由23位患有子宮肌腺癥(adenomyosis)的女性所組成；最后，Endo (+)GnRh (+)組，由59位患有骨盆腔子宮內(nèi)膜異位且接受過GnRh治療的女性所組成。
[0076]為進(jìn)行墨點(diǎn)分析，將5ng血清(是來自于上述女性受測(cè)者的樣品)轉(zhuǎn)潰至PVDF膜上，接著以5%脫脂牛奶進(jìn)行阻斷作用，于4°C，放置隔夜，加入小鼠單株抗AlAT抗體(實(shí)施例2的2A7或2C8) (1:1000稀釋)至PVDF膜上，于室溫下，培養(yǎng)I小時(shí)。以TBST緩沖液大量沖洗，接著加入含有色素源用以呈色的DAB溶液(包含10毫升PBS、0.5毫升氯化鎳(NiCl2)、10微升過氧化氫(H2O2)以及0.2毫克DAB粉末)。反應(yīng)點(diǎn)的強(qiáng)度可用來反映由所示AlAT抗體檢測(cè)到的AlAT的含量多寡。此外，可將不同含量的AlAT轉(zhuǎn)潰至膜上，以作為內(nèi)部控制組。所述各點(diǎn)的強(qiáng)度是利用圖像處理軟件(Scion，USA)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示于圖2中。[0077]如圖2所示，可發(fā)現(xiàn)患有輕微或重度子宮內(nèi)膜異位及具有子宮肌腺癥的受測(cè)者體內(nèi)含有顯著量的AlAT同形異構(gòu)物。這些AlAT同形異構(gòu)物可被實(shí)施例的單克隆抗體2C8(第2A圖)和2A7 (第2B圖)檢測(cè)及辨識(shí)。
[0078]為了對(duì)照，以另一種生物標(biāo)記(即，CA125)進(jìn)行試驗(yàn)，以推知其是否可有效地檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位。如圖3所示，雖然患有重度子宮內(nèi)膜異位或子宮肌腺癥的受測(cè)者，其表現(xiàn)出高量的CA125，然而相較于控制組、患有輕微階段的子宮內(nèi)膜異位或患有骨盆腔子宮內(nèi)膜異位且接受過GnRh治療的受測(cè)者來說，患有輕微子宮內(nèi)膜異位的受測(cè)者，其CA125含量并無顯著不同。此結(jié)果顯示，對(duì)于檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位來說，相較于本發(fā)明的單克隆抗體，CA125是一種較差的生物標(biāo)記。
[0079]實(shí)施例4實(shí)施例2的單克隆抗體、CA125及已知的AlAT抗體的間的檢測(cè)效果比較
[0080]為了確認(rèn)實(shí)施例2的單克隆抗體用于早期檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位的敏感性、專一性和/或準(zhǔn)確性，特進(jìn)行實(shí)施例3的結(jié)合試驗(yàn)，并且與CA125和其它可取得的化抗AlAT抗體商品(即，AAT704,購(gòu)自于 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California, USA)互相相較。[0081]血液樣品來自于受告知并經(jīng)其同意提供樣品的女性共48位，進(jìn)一步依據(jù)個(gè)別受測(cè)者的疾病階段而分為4組，其控制組由8位健康孕齡女性組成；Endo(I/II)組為89位患有輕微(第I或II期)子宮內(nèi)膜異位的受測(cè)者；Endo(III/IV)為16位患有重度(第III或IV期)子宮內(nèi)膜異位的受測(cè)者；以及50位患有子宮肌腺癥的受測(cè)者。
[0082]每一抗體在血清樣品中檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位抗原(實(shí)施例1的AATl或AAT2)的敏感度及專一性，是依據(jù)每一墨點(diǎn)分析的接受方操作特性曲線(receiver operationcharacteristic,ROC)上的切斷值高低(cut-off level)來決定。曲線下的區(qū)域約略為被正確分類的百分比。此外，ROC曲線的切斷值是由(1-敏感性)2+(1-專一性)2的最小值來決定。
[0083]表1總結(jié)了以實(shí)施例2的單克隆抗體、CA125或AAI704用來檢驗(yàn)或檢測(cè)血清樣品(是來自于上述受測(cè)者的樣品)內(nèi)是否存有子宮內(nèi)膜異位抗原的敏感度、專一性和準(zhǔn)確度。
[0084]以實(shí)施例2的單克隆抗體來檢測(cè)各階段的子宮內(nèi)膜異位，其整體檢測(cè)敏感度遠(yuǎn)高于AAI704或CA125。關(guān)于敏感度，于各病程階段，本發(fā)明的2C8和2A7抗體敏感度皆高于90% ;至于CA125，其于診斷早期子宮內(nèi)膜異位的敏感度只有20%，然而，對(duì)診斷重度子宮內(nèi)膜異位來說，其敏感度則增加至約68%。相較于AAT704，其診斷早期子宮內(nèi)膜異位的敏感度(高于70%)高過診斷重度子宮內(nèi)膜異位(僅約13%)。有關(guān)于專一性，2C8和2A7對(duì)診斷各階段的子宮內(nèi)膜異位表現(xiàn)至少93%的專一性；然而，CA125和AAI704的專一性則分別只有約 92% 和 50-90%。
[0085]表1
[0086]
【權(quán)利要求】
1.一種單克隆抗體，其是可在一個(gè)體的一生物性樣品中專一性地結(jié)合至分子量約72kDa或58kDa的甲I型-胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin, A1AT)同形異構(gòu)物的一抗原表位，其中該抗原表位包含一 SEQ ID N0:27的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中該抗原表位具有一SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中該抗體是一種IgGl。
4.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中該生物性樣品是一活組織切片樣品(biopsysample)、一全血樣品(whole blood sample)、一血漿樣品(plasma sample)、一血清樣品(serum sample)、一腹腔液(peritoneal fluid)、一尿液(urine)或上述樣品經(jīng)過純化或過濾后的樣品形式。
5.如權(quán)利要求4所述的單克隆抗體，其中該生物性樣品是該血清樣品。
6.一種檢驗(yàn)一個(gè)體是否罹患子宮內(nèi)膜異位的方法，包含 采集該個(gè)體的一生物性樣品； 使權(quán)利要求1所述的單克隆抗體與該生物樣品接觸；以及 檢測(cè)權(quán)利要求1的單克隆抗體與該生物性樣品中分子量約72kDa或58kDa的AlAT同形異構(gòu)物的結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該生物性樣品是一活組織切片樣品、一全血樣品、一血漿樣品、一血清樣品、一腹腔液、一尿液、上述經(jīng)過純化或過濾后的樣品形式。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該生物性樣品是該血清樣品。
9.一種在一個(gè)體的一生物性樣品中檢測(cè)一分子量約72kDa或58kDa的AlAT同形異構(gòu)物的檢測(cè)套組，包含: 該權(quán)利要求1所述的單克隆抗體； 一試劑，其可用來檢測(cè)該權(quán)利要求1的單克隆抗體與該生物性樣品中分子量約72kDa或58kDa的AlAT同形異構(gòu)物的結(jié)合；以及 一說明書，用以指示如何使用該套組。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)套組，其中該生物性樣品是一活組織切片樣品、一全血樣品、一血漿樣品、一血清樣品、一腹腔液、一尿液、上述經(jīng)過純化或過濾后的樣品形式。
11.如權(quán)利要求10所述的檢測(cè)套組，其中該生物性樣品是該血清樣品。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103649327SQ201280005332
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月14日
【發(fā)明者】楊維中, 王惠鈞, 陳水聰, 呂肯奮, 彭明棋 申請(qǐng)人:臺(tái)北醫(yī)學(xué)大學(xué), 楊富量