獲得和維持易于在體外分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的純化或富集的哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì) ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了分離的可擴(kuò)增的人神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為祖細(xì)胞或干細(xì)胞，保持了其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，保持了其在整個(gè)后續(xù)傳代中有效分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力，并且所述細(xì)胞至少表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD133和CD140α。本發(fā)明還提供了一種在體外培養(yǎng)分離自哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可擴(kuò)增的神經(jīng)祖細(xì)胞或干細(xì)胞的方法，以及培養(yǎng)物本身，其中所述細(xì)胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力以及其有效分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力。此外，本發(fā)明還提供了治療髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細(xì)胞缺失所造成病況的方法，也提供了組合物，所述組合物包含分離的可擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞或通過本發(fā)明方法培養(yǎng)的分離的可擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞。
【專利說明】獲得和維持易于在體外分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的純
化或富集的晡乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞群和/或神經(jīng)祖細(xì)胞群的
培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般涉及神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了純化的或富集的哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞群和/或神經(jīng)祖細(xì)胞群，該細(xì)胞群易于在體外分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞(oligodendrocyte-1 ineage cells),并且該細(xì)胞群適用于生物學(xué)研究、藥物篩選和人類治療。
[0002]與相關(guān)申請的交叉引用
[0003]本申請與2011年I月12日提交的美國臨時(shí)專利申請61/431，944和2011年11月11日提交的美國臨時(shí)專利申請61/558，527相關(guān)。
[0004]關(guān)于聯(lián)邦資助的研發(fā)的說明
[0005]不適用。
【背景技術(shù)】
[0006]中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展過程中，原始、多能神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖，產(chǎn)生瞬時(shí)分裂的祖細(xì)胞，祖細(xì)胞最終分化成組成成人大腦的各種細(xì)胞類型。成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要由神經(jīng)元和包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。正在發(fā)育的腦中，(最終分化為)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞順序地從神經(jīng)干細(xì)胞中產(chǎn)生(見圖1)。神經(jīng)元祖細(xì)胞首先形成并分化成多種類型的神經(jīng)元。然后星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)展并發(fā)揮支持神經(jīng)元存活的功能。最后，少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞開始出現(xiàn)并在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中遷移。然后，他們分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，這些成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生正常的神經(jīng)功能所必需的髓磷脂。
[0007]由于少突膠質(zhì)細(xì)胞在支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，純化或富集的少突膠質(zhì)細(xì)胞群或其前體細(xì)胞(即少突膠質(zhì)細(xì)胞前祖細(xì)胞和/或少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞)群可用作細(xì)胞治療和再生藥物，例如治療神經(jīng)疾病，包括先天性脫髓鞘疾病(例如，克拉貝氏(Krabbe)病或佩-梅(Pelizaeus-Merzbacher)病)、脊髓損傷和其它源于隔離神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘的缺陷導(dǎo)致的疾病。這些細(xì)胞也可以用于研究和確定用于治療許多神經(jīng)疾病如多發(fā)性硬化和精神分裂癥的新藥物。
[0008]成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞不增殖，培養(yǎng)中也不易存活，從組織樣本中直接獲得數(shù)量上足夠用于研究或人類治療的少突膠質(zhì)細(xì)胞是非常困難的。因此，用于這些目的的少突膠質(zhì)細(xì)胞的使用受限于這些細(xì)胞的缺少。
[0009]針對這個(gè)問題 的一種解決方案是從組織中獲得神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)增殖以獲得足夠大量的后續(xù)可分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞。分化可在體外或體內(nèi)發(fā)生，例如在移植的情況下。這種方法能夠產(chǎn)生大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞或其祖細(xì)胞或前細(xì)胞用于研究和人類治療。
[0010]然而，研究人員一直在努力確定允許少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞或前祖細(xì)胞--尤其是來自人類或非人靈長類動(dòng)物的此類細(xì)胞一長期培養(yǎng)和大量擴(kuò)增的培養(yǎng)條件，其中產(chǎn)生的擴(kuò)增的細(xì)胞群主要由保留了分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞組成。
[0011]有些科學(xué)家報(bào)道了從大鼠上獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(Raff等在1983年J.Neurosci 雜志 3: 1289 ；Raff 等在 1983 年 Nature 雜志 303:390 ；Espinosa de 1sMonteros 等 1993 年在 Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,90:50)。這些增殖性的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞由于具有在體外分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞或2型星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力而稱為0-2A祖細(xì)胞。其他科學(xué)家也在原代培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了大鼠或小鼠的少突膠質(zhì)細(xì)胞前祖細(xì)胞(Gallo，Armstrong RC 在 1995 年 J.Neurosci 雜志 15:394, Grinspan, Franceschini B 在 1995 年J.Neurosc1.Res 雜志 41:540,Decker 等在 2000 年 Mol.Cell.Neurosci 雜志 16:422)。這些細(xì)胞被認(rèn)為是少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的前體，由于其與少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞相比具有更高的遷移能力，因此預(yù)期這些細(xì)胞在細(xì)胞治療中更加有益。不幸的是，科學(xué)家們一直無法在體外長期有效增殖這些細(xì)胞。相反的，科學(xué)家們報(bào)道了使用B104條件培養(yǎng)基或生長因子組合培養(yǎng)源于大鼠視神經(jīng)或脊髓的02A祖細(xì)胞，所述生長因子組合例如(i)血小板衍生生長因子AA (PDGF-AA)與堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF或堿性FGF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子_3 (NT-3)，或(ii)H)GF-AA與睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和NT-3。但是，尚未有人成功地使用這些生長因子從靈長類動(dòng)物組織大量擴(kuò)增這些細(xì)胞類型。
[0012]因此，從哺乳動(dòng)物而非大鼠或小鼠獲得和擴(kuò)增純化的或富集的少突膠質(zhì)細(xì)胞群和/或其前體細(xì)胞群仍然是很困難的。從人類和非人靈長類動(dòng)物獲得和擴(kuò)增這些細(xì)胞尤其困難。因此，非常需要用于產(chǎn)生純化或富集的哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞群或祖細(xì)胞群的方法，所述細(xì)胞群易于在體外分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。
發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明涉及分離 的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是祖細(xì)胞或干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，其中所述細(xì)胞保持其在整個(gè)后續(xù)(多次)傳代中有效分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力，并且所述細(xì)胞至少表達(dá)細(xì)胞表面抗原⑶133和⑶140 α。
[0014]本發(fā)明還涉及體外培養(yǎng)可擴(kuò)增的神經(jīng)細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的祖細(xì)胞或干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞保持了其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力以及其有效地分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力，其中所述方法包括從人胎兒神經(jīng)組織分離和離解(dissociating)至少一個(gè)細(xì)胞；在溫度為37°C，含有1-20%的O2和5% CO2的氣體環(huán)境下，和化學(xué)定義的(chemically defined)無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基包含至少5ng/ml的TOGF-AA，至少0.5ng/ml的bFGF，和至少ΙΟμΜ的1-硫代甘油；以及傳代所述細(xì)胞以獲得可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療由髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細(xì)胞缺失而導(dǎo)致的病況的方法，包括給予受試者治療有效量的組合物，該組合物含有分離的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，所述人神經(jīng)細(xì)胞能夠保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，其中所述細(xì)胞保持其在隨后傳代期間有效地分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力，并且其中所述細(xì)胞至少表達(dá)細(xì)胞表面抗原⑶133和⑶140 α。
[0016]本發(fā)明還涉及體外培養(yǎng)物，其包含至少一個(gè)從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得的分離的神經(jīng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞浸沒在化學(xué)定義的無血清培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基具有至少5ng/mlPDGF-AA，至少5ng/ml bFGF，和至少10 μ Ml-硫代甘油。
[0017]本發(fā)明還涉及神經(jīng)干細(xì)胞藥物組合物，其包含分離的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞。
[0018]另外，本發(fā)明還涉及神經(jīng)干細(xì)胞藥物組合物在用于治療病況的藥物中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明還涉及體外培養(yǎng)和擴(kuò)增從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，其中所述培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞保持其分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力。本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)物是貼附培養(yǎng)物。
[0020]本發(fā)明還涉及分離的純化或富集的可擴(kuò)增哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞群和/或神經(jīng)祖細(xì)胞群，所述細(xì)胞群易于在體外分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞(即，如圖7和圖15所示的蜘蛛網(wǎng)形態(tài)的04-陽性細(xì)胞)。
[0021]本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，所述細(xì)胞通過從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增和分化而獲得。
[0022]附圖概述
[0023]圖1顯示了神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)育為腦中三種主要的細(xì)胞類型-神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；
[0024]圖2顯示了各種CNS細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)比較；
[0025]圖3在微縮圖(SlideS)A-F顯示了人類胚胎干細(xì)胞(克隆#2b)的相差圖象；
[0026]圖4顯示了 HFSC細(xì)`胞(克隆#2b)在不同生長因子組合中的擴(kuò)增率；
[0027]圖5顯示了高劑量的roGF-AA(100ng/ml)和1-硫代甘油對HFSC細(xì)胞(克隆#2b)增殖的影響；
[0028]圖6顯示了 HFSC細(xì)胞(克隆#2b)的生長曲線；
[0029]圖7在微縮圖A-F顯示了 HFSC細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的自發(fā)分化；
[0030]圖8是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示HFSC細(xì)胞(克隆#3)在不同代的形態(tài)；
[0031]圖9顯示了 HFSC細(xì)胞(克隆#3)的生長曲線；
[0032]圖10，微縮圖A-F為倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示了 HFSC細(xì)胞(克隆4A和4B)在不同代的形態(tài)；
[0033]圖11顯示了 HFSC細(xì)胞(克隆#4A和4B)的生長曲線；
[0034]圖12微縮圖A-S顯示了未分化的HFSC細(xì)胞的免疫表型；
[0035]圖13，微縮圖A-H顯示了流式細(xì)胞儀檢測數(shù)據(jù)，說明未分化的HFSC細(xì)胞(克隆#2b，13代)的比例；
[0036]圖14顯示了分化的HFSC細(xì)胞(克隆#3，15代)的免疫表型；
[0037]圖15，微縮圖A-E顯示了 HFSC細(xì)胞(克隆#2b，15代)的分化潛能。
[0038]附圖詳述
[0039]圖1描述了神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)育為腦中三種主要的細(xì)胞類型-神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。帶箭頭的實(shí)線表示一種細(xì)胞類型到另一種的進(jìn)展。從HFSC細(xì)胞到神經(jīng)元限制性前體細(xì)胞(NRP)的虛線表示HFSC細(xì)胞具有較低的最終變成神經(jīng)元細(xì)胞的傾向。從HFSC細(xì)胞到02A細(xì)胞的粗線表示HFSC細(xì)胞具有較大的產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的傾向。如實(shí)施例7中所示(參見圖14)多能HFSC細(xì)胞分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)施例2中(參見圖7)和實(shí)施例8 (參見圖15)顯示了 HFSC細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的傾向。
[0040]圖2顯示了各種CNS細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)比較。本發(fā)明在實(shí)施例7 (參考附圖12和13)公開了 HFSC細(xì)胞的表型，并在該圖中進(jìn)行了概括。如下將要討論的，HFSC細(xì)胞，與其他細(xì)胞類型都不相同，具有神經(jīng)干細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞2型星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(02A)兩種特點(diǎn)。
[0041]圖3在微縮圖A-F顯示了人類胚胎干細(xì)胞(克隆#2b)相差圖像。圖3中，微縮圖A表示倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示HFSC細(xì)胞(克隆#2b)，所述細(xì)胞在DMEM/F12和 20ng/ml PDGF-AA 和 10ng/ml bFGF 中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱保持 37 °C，5 % 02，5 % C02，DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES并添加有B27添加劑(Invitrogen?)，非必需氨基酸(NEAA)(Invitrogen?), 1.5mM 的丙麗酸(Invitrogen?), 55 μ M 的 β-疏基乙醇(Invitrogen?),和ImM N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma)(下文將該組合稱為“HFSCM1培養(yǎng)基”)。所顯示的細(xì)胞來自O(shè)代，第7天。細(xì)胞形成球體，這些球體直接接種到聚鳥氨酸涂層培養(yǎng)板上，在I代沒有分離球體。[0042]在圖3中，微縮圖B、C為倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示了如上文圖3微縮圖A所述培養(yǎng)的HFSC細(xì)胞(克隆#2b)。所示分別細(xì)胞來自于I代，第I天和2代，第14天。直接接種到聚鳥氨酸涂層培養(yǎng)板的細(xì)胞貼附并從球體擴(kuò)增開來(圖3，微縮圖B)。傳代的細(xì)胞能夠在此培養(yǎng)條件下在后續(xù)傳代中成功地?cái)U(kuò)增(圖3，微縮圖C)。
[0043]圖3中，微縮圖D-F為倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示了在具有100ng/mlPDGF-AAU0ng/ml bFGFU0ng/ml IGF-1 和 50 μ Ml-硫代甘油的 HFSCMl 培養(yǎng)基在 37 °C、5% 02和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和多次傳代后的HFSC細(xì)胞(克隆#2b)。大多數(shù)HFSC細(xì)胞是與周圍的細(xì)胞成群的暗相細(xì)胞。從集群分離的分散細(xì)胞傾向于自發(fā)分化成帶突起的(process-bearing)多極細(xì)胞(所謂的“蜘蛛網(wǎng)狀”形態(tài))，這是前_成少突膠質(zhì)細(xì)胞和未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞(如圖3微縮圖D和E的白色箭頭所示)的特點(diǎn),但它們的出現(xiàn)頻率通常低于I %。圖3微縮圖D、E、和F所示的細(xì)胞分別來自8代，第8天；11代，第11天和19代，第11天。
[0044]圖4顯示了 HFSC細(xì)胞(克隆#2b)在不同的生長因子組合存在下的擴(kuò)增率:(I):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF ； (2):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+5ng/ml NT-3 ；
(3):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+lOng/ml IGF-1 ； (4):20ng/ml PDGF-AA+1Ong/mlbFGF+5ng/ml NT-3+10ng/ml IGF-1.。在3代的第11天(P3D11)收集細(xì)胞，并對每種條件下的活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后，在相同細(xì)胞密度，在與3代中使用的相同條件下進(jìn)行傳代。在4代第8天(P4D8)收集細(xì)胞并對每個(gè)條件中的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(在細(xì)胞因?yàn)殚_始形成球體而亞融合前收獲這些細(xì)胞)。在3代，條件(4)是最有效的，但在4代并非如此。在兩個(gè)代中，條件(3)都是有效的。
[0045]圖5顯示了高劑量的TOGF-AA (100ng/ml)和1-硫代甘油對HFSC細(xì)胞(克隆#2b)增殖的影響，在存在以下生長因子組合的HFSCMl培養(yǎng)基中培養(yǎng):(1):20ng/ml PDGF-AA+1Ong/ml bFGF+10ng/ml IGF-1 ； (2):20ng/mlPDGF-AA+10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-l+50yMl-硫代甘油；(3):100ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF+1 Ong/ml IGF-1 ；
(4):100ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF+1 Ong/ml IGF-1+50 μ Ml-硫代甘油；(5):100ng/mlPDGF-AA+lOng/ml bFGF+50 μ Ml-硫代甘油。在5代的第7天收集細(xì)胞(如4代，在細(xì)胞因?yàn)殚_始形成球體而分匯合前收獲這些細(xì)胞)，并對每種條件下的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。還測試了 20ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF的組合，但回收的細(xì)胞數(shù)太低無法評估(小于I X IO4個(gè)細(xì)胞，低于計(jì)數(shù)范圍)，從該圖中去除了這一數(shù)據(jù)。條件(I)可以在3代擴(kuò)增細(xì)胞，但不能在5代擴(kuò)增細(xì)胞。加入50 μ M的1-硫代甘油[條件(2)]或提高TOGF-AA濃度到IOOng/ml [條件(3)]對擴(kuò)增速率的積極影響非常小。當(dāng)加入50 μ M的1-硫代甘油和提高TOGF-AA濃度到100ng/ml組合時(shí)[條件(4)],細(xì)胞擴(kuò)增速率顯著提高,細(xì)胞可被成功擴(kuò)增。當(dāng)從該條件中消除IGF-1時(shí)[條件(5)]，擴(kuò)增率降低至小于1，表明IGF-1也促進(jìn)了 HFSC細(xì)胞的增殖和/或存活。
[0046]圖6顯示了人HFSC細(xì)胞(克隆#2b)的生長曲線(黑線空心圓圈)。HFSC細(xì)胞(克隆#2b)在10ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF存在下開始培養(yǎng)。從第3代加入IOng/ml IGF-1。從第6代TOGF-AA的濃度從20ng/ml提高到100ng/ml。然而，它們對細(xì)胞的擴(kuò)增率影響很小或無影響。從第7代加入50 μ M的1-硫代甘油。在存在100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF，10ng/mlIGF-l和50μMl-硫代甘油下HFSC細(xì)胞(克隆#2b)開始迅速生長。第17代加入10ng/ml NT_3。NT-3略微增強(qiáng)了細(xì)胞生長但一代后作用消失。此圖還顯示在10代第6天(虛線空心圓圈)和11代第11天(點(diǎn)線空心圓圈)冷凍的人HFSC細(xì)胞(克隆#2b)的生長曲線。冷凍細(xì)胞解凍后能夠以類似速率擴(kuò)增。
[0047]圖7在微縮圖A-F中顯示了在無血清培養(yǎng)基中HFSC細(xì)胞自發(fā)分化。微縮圖A和B是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示在12代、第9天(圖7，微縮圖A和B)，經(jīng)過補(bǔ)充有20ng/ml PDGF-AA, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1 和 δΟ μ Ml-硫代甘油(圖 7，微縮圖 Α)或不具有1-硫代甘油(圖7，微縮 圖B)的HFSCMl培養(yǎng)基培養(yǎng)的HFSC細(xì)胞(克隆#2b)的形態(tài)變化。在更換培養(yǎng)基時(shí)不補(bǔ)充bFGF，HFSC細(xì)胞自發(fā)分化。即使在相同的條件下，如果每天補(bǔ)充bFGF, HFSC細(xì)胞不分化并且看起來增長緩慢。此外,使用40ng/ml或更高濃度的PDGF-AA時(shí)，HFSC分化被阻斷并形成集群。通過將I3DGF-AA濃度從100ng/ml降低到20ng/ml并且不補(bǔ)充bFGF，細(xì)胞可自發(fā)地分化成具有蛛網(wǎng)狀形態(tài)的帶突起的多極細(xì)胞，其表達(dá)04抗原(圖7，微縮圖C和D)和/或GalC抗原(圖7中，微縮圖E和F)，這是少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞[即，前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞(04陽性和GalC陰性)，未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(04陽性和GalC陽性)]的決定性特征。
[0048]圖8是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示不同代的HFSC細(xì)胞(克隆#3)的形態(tài)。常規(guī)的神經(jīng)干細(xì)胞最初在bFGF和EGF存在下擴(kuò)增15天(參見圖8，微縮圖A，O代，第15天)。在這之后，細(xì)胞在具有20ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF的HFSCMl培養(yǎng)基，37°C、5% O2,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第4代，PDGF-AA濃度增加至100ng/ml并加入10ng/ml的IGF-1 (參見圖9)。從第8代加入50 μ M的1-硫代甘油(參見圖9)。在經(jīng)過若干代后形態(tài)變得與克隆#2b幾乎相同。
[0049]圖9顯示了人類HFSC細(xì)胞(克隆#3)(黑線的空心圓圈)的生長曲線。HFSC細(xì)胞(克隆#3)最初在10ng/ml的EGF和10ng/ml的bFGF存在下培養(yǎng)以擴(kuò)增常規(guī)的神經(jīng)干細(xì)胞。然后，從第I代，生長因子組合變?yōu)?0ng/ml的TOGF-AA和10ng/ml的bFGF。從第2代加入10ng/ml的IGF-1和10ng/ml的NT-3。在圖4所示數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，從第4代除去NT-3，PDGF-AA濃度從20ng/ml增加到100ng/ml。然而，如克隆#2b所示，它們對細(xì)胞擴(kuò)增速率影響甚微或無影響。從第5代加入50μΜ的1-硫代甘油，和克隆#2b—樣，HFSC細(xì)胞(克隆 #3)開始在 100ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1 和 50 μ Ml-硫代甘油存在下迅速生長。此圖還包括在第10代第7天(第10代，第7天:虛線空心圓)冷凍的人類HFSC細(xì)胞(克隆#3)的生長曲線。冷凍細(xì)胞解凍后，能夠以類似的速度擴(kuò)增。
[0050]圖10是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，在微縮圖A-F顯示了不同代數(shù)下的HFSC細(xì)胞(克隆4A和4B)的形態(tài)。在37°C，5% 02，5% 0)2培養(yǎng)箱中，在具有20ng/ml的PDGF-AA，20ng/ml bFGF和 20ng/ml 的 IGF-1 (克隆 #4A)或 100ng/ml PDGF-AA, 20ng/ml bFGF和 20ng/ml的IGF-1 (克隆#4B)的HFSCMl培養(yǎng)基和50 μ Ml-硫代甘油中培養(yǎng)細(xì)胞?？寺?4Α開始比克隆#4Β擴(kuò)增速度低，但從第2代幾乎以相同速度增長。經(jīng)過3代后它們變?yōu)閹缀跏蔷|(zhì)的(homogeneous),它們的形態(tài)變?yōu)榕c克隆#2b或#3幾乎相同。
[0051]圖11顯示了人類HFSC細(xì)胞(克隆#4A:虛線空心正方形和#4B:黑線空心圓圈)的生長曲線。HFSC 細(xì)胞(克隆 #4A)在 20ng/ml 的 PDGF-AA，20ng/ml bFGF, 20ng/ml, IGF-1和50 μ Ml-硫代甘油存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0052]HFSC 細(xì)胞(克隆 #4B)在 100ng/ml 的 PDGF-AA，20ng/ml bFGF 和 20ng/mlIGF_l 以及50 μ Ml-硫代甘油存在下進(jìn)行培養(yǎng)。首先兩個(gè)克隆的細(xì)胞數(shù)量急劇下降，這種下降在克隆#4Α更為突出。細(xì)胞數(shù)量最初下降后，它們開始迅速擴(kuò)增。此圖還包括在第5代第6天(第5代第6天:虛線空心圓)冷凍的人類HFSC細(xì)胞(克隆#4Β)的生長曲線。
[0053]圖12在微縮圖A-S顯示了未分化的HFSC細(xì)胞的免疫表型；(克隆#2b，12-16代)在 100ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1，和 50 μ Ml-硫代甘油存在下培養(yǎng)，對CD133、Sox2、巢蛋白(Nestin)、01ig2、PDGF-Rα、NG2、Α2Β5、PSA-NCAM、GFAP 或波形蛋白(Vimentin)染色呈陽性。使用DAPI復(fù)染細(xì)胞的細(xì)胞核。這些圖顯示，至少90%的細(xì)胞為CD133，Sox2，巢蛋白，01ig2, PDGF-R α，NG2, Α2Β5和波形蛋白陽性，但沒有GFAP陽性的細(xì)胞。PSA-NCAM染色稍微弱，但仍有超過90%的細(xì)胞顯示PSA-NCAM陽性。
[0054]圖13，微縮圖Α-Η，顯示了流式細(xì)胞儀檢測數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示未分化的HFSC細(xì)胞(克隆#2b,13代)的比例。黑線柱(histograms)代表同種型對照,灰色填充柱代表每個(gè)測試抗原。此數(shù)據(jù)表明，大部分HFSC細(xì)胞為⑶133陽性(圖13，微縮圖A)，⑶9陽性(圖13，微縮圖B)，CD140a陽性(圖13，微縮圖C)，NG2陽性(圖13，微縮圖D) ,A2B5陽性(圖13，微縮圖E)，04陽性(圖13，微縮圖F) ,PSA-NCAM陽性(圖13，微縮圖G)。進(jìn)行的免疫細(xì)胞化學(xué)(數(shù)據(jù)未示出)測試，顯示CD44陰性(圖13，微縮圖H)。
[0055]圖14顯示培養(yǎng)在含有血清的培養(yǎng)基中31天的分化的HFSC細(xì)胞(克隆#3，15代)的免疫表型，并用識別神經(jīng)元(β III微管蛋白，神經(jīng)絲蛋白-L和ΜΑΡ2)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(04，MBP)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)的抗體染色，然后是熒光二抗。使用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。HFSC細(xì)胞能夠分化成對每種標(biāo)志物陽性的細(xì)胞。為了評估共定位的神經(jīng)元軸突和髓磷脂，細(xì)胞與抗-β III微管蛋白抗體和抗-MBP抗體(圖14，微縮圖A-C)，抗-神經(jīng)絲蛋白-L抗體和抗-MBP抗體(圖14，微縮圖D-F)，抗-ΜΑΡ2抗體和抗-MBP抗體(圖14，微縮圖G-1)共染色。只有少數(shù)神經(jīng)元軸突和髓磷脂共定位。為了評估04抗原和MBP的共定位，細(xì)胞與04抗體和抗-MBP抗體共染色(圖14，微縮圖J-L)。大多數(shù)MBP信號與04抗原信號共定位。HFSC細(xì)胞也可以分化成GFAP抗原陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖14，微縮圖Μ-0)。此外，許多細(xì)胞對在上皮細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的波形蛋白呈陽性。此外，未分化的細(xì)胞也對波形蛋白呈陽性(數(shù)據(jù)未示出)。[0056]圖15在微縮圖A-E顯示了 HFSC細(xì)胞(克隆#2b，15代)的分化潛能。細(xì)胞在DMEM/F12中分化，DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES，并補(bǔ)充有B27添加劑，N2添加劑和50 μ M 的 1-硫代甘油與 10ng/ml 的 PDGF-AA, 100ng/ml 的 IGF-1,10ng/ml 的 BDNF 和 100 μ M的pCPT-cAMP。分化4天后，細(xì)胞用抗-GD3抗體和04抗體染色，然后用熒光二抗染色。未分化的細(xì)胞表達(dá)⑶3要強(qiáng)于少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，04反之(圖15的箭頭，微縮圖A，B和C顯示未分化的細(xì)胞)。大多數(shù)分化細(xì)胞呈現(xiàn)多極化形態(tài)，具有微弱的GD3信號和較強(qiáng)的04信號，表明其為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞或前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞。其他細(xì)胞類型(如星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元)定義為GD3陰性和04陰性細(xì)胞。圖15，微縮圖D從分化細(xì)胞的10個(gè)不同圖像顯示每個(gè)細(xì)胞群體的比率。細(xì)胞總數(shù)的70%以上分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(75.8%±2.09% )。超過總數(shù)20%的細(xì)胞仍然是未分化的細(xì)胞(23.5% ±2.03% )。其他細(xì)胞類型均少于細(xì)胞總數(shù)的1% (0.7% ±0.41%)。計(jì)算少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和其他細(xì)胞類型占分化的細(xì)胞(少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞加其它細(xì)胞類型)的比例，并示于圖15，微縮圖E。少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞占分化細(xì)胞的99.1% ±0.56%，而其他細(xì)胞類型占分化細(xì)胞的0.9%+ 0.56 % ο
[0057]本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式詳述
[0058]本發(fā)明提供了一種方法，該方法用于培養(yǎng)和擴(kuò)增從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出的神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞以產(chǎn)生純化或富集的神經(jīng)干細(xì)胞群或神經(jīng)祖細(xì)胞群，所述細(xì)胞群具有體外分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力。神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生的后代都或?yàn)樯窠?jīng)元細(xì)胞(如神經(jīng)元祖細(xì)胞或成熟神經(jīng)元)或?yàn)榘ㄐ切文z質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。雖然神經(jīng)干細(xì)胞是可自我再生的(即能無限增殖)，神經(jīng)祖細(xì)胞可能、但不必定，能夠自我再生。本發(fā)明的培養(yǎng)方法能夠產(chǎn)生擴(kuò)增的細(xì)胞群，該細(xì)胞群可分化成占分化細(xì)胞至少70 %，80 %，90 %或95 %的少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞，即少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。
[0059]如下縮寫和定義貫穿在本申請全文:
[0060]術(shù)語“HFSC細(xì)胞”或人類胚胎脊髓源細(xì)胞，是指本發(fā)明中描述的純化或富集的細(xì)胞群，所述細(xì)胞是擴(kuò)增的哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞。
[0061]術(shù)語“HFSCM1培養(yǎng)基”是指DMEM/F12，在組合中包含谷氨酰胺和HEPES并補(bǔ)充有B27添加劑(Invitrogen?),非必需氨基酸(NEAA) (Invitrogen?), 1.5mM的丙酮酸(Invitrogen?), 55 μ M 的 β-巰基乙醇(Invitrogen?),和 ImM N-乙酰基-L-半胱氨酸(Sigma)。
[0062]術(shù)語“神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞”是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非神經(jīng)元細(xì)胞，包括成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、和這些細(xì)胞類型的一種或兩種的定向祖細(xì)胞。
[0063]術(shù)語“專能(multipotent)祖細(xì)胞”指的神經(jīng)祖細(xì)胞，其具有產(chǎn)生多個(gè)、但數(shù)量有限的譜系的細(xì)胞的潛能。
[0064]“多能性(pluripotency)”(源自拉丁文“plurimus”或“非常多”和“潛在的”或“動(dòng)力”)是指有潛力分化成三個(gè)胚層的任意層的干細(xì)胞，所述三個(gè)胚層為:內(nèi)胚層(胃內(nèi)粘膜(interior stomach lining),胃腸道,肺)，中胚層(肌肉，骨骼,血液,泌尿生殖)，或外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。神經(jīng)干細(xì)胞是專能而不是多能。胚胎干細(xì)胞是多能而不是#倉泛。[0065]定向祖細(xì)胞是定向或確定會成為特定類型成熟細(xì)胞的祖細(xì)胞。與之相反，專能或多能祖細(xì)胞具有變?yōu)閮煞N或更多種類型的成熟細(xì)胞中的一種的潛能(如基于時(shí)間和環(huán)境因素，0-2A祖細(xì)胞可以成為少突膠質(zhì)細(xì)胞或2型星形膠質(zhì)細(xì)胞)。
[0066]“少突膠質(zhì)細(xì)胞’是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其主要功能是在一些脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中隔離神經(jīng)細(xì)胞軸突。
[0067]術(shù)語“少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞”是指少突膠質(zhì)細(xì)胞，前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(例如02A祖細(xì)胞)。此術(shù)語不包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞限制性前體或神經(jīng)干細(xì)胞。
[0068]術(shù)語“少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cells)”和“少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligodendrocyte progenitors) ”在整個(gè)申請中互換使用，該術(shù)語指的是相對于(形成)神經(jīng)元或非神經(jīng)組織，這種細(xì)胞優(yōu)先定向形成的祖細(xì)胞和/或后代更多的是少突膠質(zhì)細(xì)胞。除非另有規(guī)定，它們可以、但不必定，有生成其他類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(如2型星形膠質(zhì)細(xì)胞)的能力。這里所用的此術(shù)語不包括少突膠質(zhì)細(xì)胞的前祖細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞限制性前體(參見圖1)。
[0069]“少突膠質(zhì)細(xì)胞前祖細(xì)胞”是少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的前體細(xì)胞。
[0070]“前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞”是有絲分裂后少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞。
[0071]通過培養(yǎng)“擴(kuò)增”細(xì)胞指的是在培養(yǎng)基存在下增加細(xì)胞數(shù)量，所述培養(yǎng)基含有刺激細(xì)胞增殖的添加物。
[0072]“細(xì)胞擴(kuò)增 率”是指特定日期的細(xì)胞數(shù)除以初始培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞數(shù)。
[0073]“擴(kuò)增的”神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞此處指的是從分離的神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞，所述分離的神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞是體外增殖的，所述“擴(kuò)增的”神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生擴(kuò)增的細(xì)胞群。
[0074]“傳代”細(xì)胞(也稱為“繼代培養(yǎng)”或“分裂”細(xì)胞)指的是一種技術(shù)，該技術(shù)通過將細(xì)胞彼此分離(用酶，如胰蛋白酶或膠原酶)然后將一小部分?jǐn)?shù)目的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中，而使細(xì)胞在較長的時(shí)間段內(nèi)在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下保持存活并生長。如果以規(guī)律的時(shí)間間隔傳代，由于避免了長時(shí)間高細(xì)胞密度相關(guān)聯(lián)的早衰，細(xì)胞可以培養(yǎng)更長的時(shí)間。
[0075]生長環(huán)境是指細(xì)胞在體外增殖、分化和/或成熟的環(huán)境。環(huán)境的特點(diǎn)包括培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，可能存在的生長因子或分化誘導(dǎo)因子，可存在的支撐結(jié)構(gòu)(如在固體表面上的基板)。
[0076]通用技術(shù)
[0077]生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、抗體技術(shù)的一般方法可以在《蛋白質(zhì)化學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作手冊》(Current Protocols in Protein Science) (Wiley&Sons 出版，J.E.Colligan 等主編)，《細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作手冊》(Current Protocols in Cell Biology) (Wiley&Sons出版，J.S.Bonifacino 等主編)，《免疫學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作手冊》(Current Protocols in Immunology)(ffiley&Sons出版，J.E.Colligan等主編)中得知。細(xì)胞培養(yǎng)方法在當(dāng)前版本的《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng):基本技術(shù)手冊》(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)(ffily&Sons出版，R.1.Freshney等主編)，《細(xì)胞培養(yǎng)的普通技術(shù)》(General Techniquesof Cell Culture) (Cambridge Univ.Press 出版，M.A.Harrison&1.F.Rae 主編)等中記
載。組織培養(yǎng)耗材和試劑可以從Chemicon' MilUpore.'R&D Systems' Invitrogen?,Nalgene-Nunc? International, Sigma-Aldrich?,和 ScienCell 等商業(yè)廠商獲得。[0078]與本發(fā)明公開相關(guān)的專業(yè)參考書包括《神經(jīng)科學(xué)原理》(Principles ofNeuroscience),第四版，Kandel等主編，McGraw-Hill2000年出版；《中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生:基礎(chǔ)科學(xué)和臨床進(jìn)展》(CNS Regeneration:Basic Science and Clinical Advances),Μ.H.Tuszynski& 和 J.H Kordower 編，Academic Pressl999 年出版；《神經(jīng)兀:細(xì)胞和分子生物學(xué)》(The Neuron:Cell and Molecular Biology),第三版，1.B.Levitan 和L.K.Kaczmarek編，Oxford U.Press2001年出版；《神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞:它們在行為中的作用》(Glial Cells:Their Role in Behavior), PR Laming 等合編，Cambridge U.Pressl998年出版；《神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在健康與疾病中的功能角色》(The Functional Roles ofGlialCells in Health and Disease), Matsas 與 Tsacopoulos 合編，Plenum Pub.Corp, 1999 年出版:《神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育》(Glial Cell Development)，Jessen 與 Richardson 編，OxfordU.Press2001 出版；《鋼鐵之人》(Man of Steel), Adrian Hill，1996 年。
[0079]在細(xì)胞個(gè)體發(fā)生的背景下，形容詞“分化的”是一個(gè)相對術(shù)語。分化的細(xì)胞是比正在和它比較的細(xì)胞在發(fā)育途徑上已經(jīng)發(fā)展得更遠(yuǎn)的細(xì)胞。因此，神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為細(xì)胞譜系限制性祖細(xì)胞。這些繼而可以分化成沿著分化途徑更遠(yuǎn)的細(xì)胞或分化成末期分化的細(xì)胞，如成熟的神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細(xì)胞。
[0080]本發(fā)明的分化的細(xì)胞可根據(jù)它們是否表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞特征性表型標(biāo)志物來表征。取決于細(xì)胞群的成熟程度，這些細(xì)胞可能存在的典型的免疫組化標(biāo)志物有以下幾種:
[0081]Sox2:多能干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物；
[0082]巢蛋白，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物；
[0083]⑶133:神經(jīng) 干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物；
[0084]TOGF-受體a (PDGF-Ra):血小板衍生生長因子受體的α鏈。少突膠質(zhì)細(xì)胞和其祖細(xì)胞的標(biāo)志物；
[0085]CD 140a:與I3DGF-Ra相同。CD140a抗體識別I3DGF-R a的胞外區(qū)。少突膠質(zhì)細(xì)胞和其祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物；
[0086]⑶9:細(xì)胞表面糖蛋白，已知和整聯(lián)蛋白以及其他跨膜的4個(gè)超家族蛋白復(fù)合。生殖干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物；
[0087]PSA-NCAM:唾液酸神經(jīng)細(xì)胞黏附分子。神經(jīng)元限制性前體(NRP)、神經(jīng)元祖細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物。此標(biāo)志物在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞限制性前體(GRP)中為陰性。
[0088]A2B5:神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞限制性前體(GRP)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(OPC)以及2型星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。該細(xì)胞表面標(biāo)志物在神經(jīng)元限制性前體(NRP)中為陰性。
[0089]NG2:硫酸軟骨素蛋白多糖。巨噬細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。
[0090]GD3:神經(jīng)節(jié)苷脂GD3。少突膠質(zhì)細(xì)胞前祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的標(biāo)志物。
[0091]04:少突膠質(zhì)細(xì)胞及其祖細(xì)胞的標(biāo)志物。
[0092]半乳糖腦苷C(GalC):未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。
[0093]髓鞘堿性蛋白(MBP):成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。
[0094]⑶44:細(xì)胞表面糖蛋白，參與細(xì)胞-細(xì)胞相互作用以及細(xì)胞粘附和遷移，透明質(zhì)酸的受體。一些上皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。[0095]膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP):星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。
[0096]β III微管蛋白:神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)元的標(biāo)志物。
[0097]神經(jīng)絲蛋白-L:成熟神經(jīng)元標(biāo)志物。
[0098]微管相關(guān)蛋白2(ΜΑΡ2):成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物。
[0099]組織特異性標(biāo)志物可以使用任何適當(dāng)?shù)拿庖邔W(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測，如細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式免疫組化，或細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)志物免疫組化(例如，固定的細(xì)胞或組織切片)。流式細(xì)胞儀詳細(xì)分析方法在Gallacher等，BLOOD雜志，2000年96:1740有記載。如果在標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化或流式細(xì)胞儀測定中，任選將細(xì)胞固定以后，并任選使用標(biāo)記的二抗或其他耦合物來放大標(biāo)記，可檢測到大量的抗體結(jié)合于抗原，則將細(xì)胞表面抗原的表達(dá)定義為陽性。為了便于在研究或治療中使用，最大限度地提高具有少突膠質(zhì)細(xì)胞或其祖細(xì)胞的特征的細(xì)胞在細(xì)胞群中的比例常常是有利的。有可能獲得至少50 %，60 %，70 %，90 %或95 %為特定譜系細(xì)胞的細(xì)胞群，所述特定譜系的細(xì)胞鑒定為對這些細(xì)胞的特征性表型標(biāo)志物是陽性的。
[0100]對于與神經(jīng)功能重建相關(guān)的治療性應(yīng)用，往往希望將細(xì)胞群形成其他細(xì)胞類型尤其是未分化的干細(xì)胞和非外胚層譜系細(xì)胞的能力最小化。根據(jù)(具體)應(yīng)用，將神經(jīng)元譜系細(xì)胞和其定向祖細(xì)胞、或星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系的細(xì)胞和其定向祖細(xì)胞的比例最小化可能是有利的。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞群的污染具有少于30 %，20 %，10 %或5 %這些其他類型細(xì)胞的污染。
[0101 ] 本發(fā)明的方法不能導(dǎo)致整個(gè)人機(jī)體的發(fā)育。
[0102]本發(fā)明的方法涉及在定義的(defined)培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分離的神經(jīng)干細(xì)胞和/或神`經(jīng)祖細(xì)胞，所述培養(yǎng)基允許所述細(xì)胞通過多次傳代而擴(kuò)增。本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞在整個(gè)擴(kuò)增中保持其分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力。本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞可以傳代多于6次，擴(kuò)增超過1000倍，而保持其分化為少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞的能力。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明培養(yǎng)方法得到的擴(kuò)增的細(xì)胞群含有或可在無血清培養(yǎng)條件下分化成至少30 %，50 %，70 %或80 %的分化細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的細(xì)胞群。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，采用本發(fā)明培養(yǎng)方法得到的擴(kuò)增細(xì)胞培養(yǎng)物群體在分化的細(xì)胞中包括至少90%的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，擴(kuò)增的細(xì)胞是專能的。在一些實(shí)施方式中，大部分的擴(kuò)增細(xì)胞在降低I3DGF-AA的培養(yǎng)基(即20ng/ml的H)GF-AA，優(yōu)選用10ng/ml bFGF,有或沒有50 μ M的1-硫代甘油，和任選至少10ng/ml的IGF-1)中培養(yǎng)、在更換培養(yǎng)基的中間不補(bǔ)充bFGF的情況下，能夠分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，大部分的擴(kuò)增的細(xì)胞在包含谷氨酰胺和HEPES并補(bǔ)充有B27添加劑、N2添加劑和50 μ Ml-硫代甘油的DMEM/F12中培養(yǎng)后能夠分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，所述 DMEM/F12 含有 10ng/ml 的 PDGF-AA，100ng/ml IGF-1,100 μ M pCPT-cAMP 和 IOng/ml BDNF。
[0103]本發(fā)明中所用的分離的哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞，可以從哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長類動(dòng)物，例如但不限于人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得。少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞和前祖細(xì)胞已知存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)中。因此，分離用于本發(fā)明所用細(xì)胞的適合來源包括，但不限于，視神經(jīng)，胼胝體和脊髓。此外，使用本領(lǐng)域中已知的方法，可從哺乳動(dòng)物胎兒，優(yōu)選靈長類動(dòng)物的胎兒，例如，但不限于人的胎兒來衍生分離的干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，分離的干細(xì)胞從獲得自人胎兒脊柱的人胎兒脊髓組織制備。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明使用的分離的細(xì)胞從8-24周孕齡，優(yōu)選為12-18周孕齡的胎兒脊髓獲得。例如，通過商業(yè)公司，如先進(jìn)生物科技資源公司(Advanced Bioscience Resources, Inc.)(美國，加利福尼亞州，阿拉美達(dá))，具有IRB許可和捐贈(zèng)者的知情同意后，可以得到人類胎兒脊柱?？梢詫⒓顾杞M織從脊柱分割下來，除去腦膜和外周神經(jīng)。然后分離、洗滌組織并放置在包含允許細(xì)胞增殖的生長培養(yǎng)基的培 養(yǎng)容器中。
[0104]合適的培養(yǎng)容器包括但不限于，培養(yǎng)容器的表面具有一種多氨基酸或多氨基酸組合(例如，聚賴氨酸和/或聚鳥氨酸)，用層粘連蛋白、玻連蛋白或纖維連接蛋白處理的組織培養(yǎng)塑料和表面。細(xì)胞接種的密度范圍為IO4至IO5個(gè)細(xì)胞/平方厘米，優(yōu)選密度為約3X 104-5X 104個(gè)細(xì)胞/平方厘米。根據(jù)已有的研究(Raff等，J.Neurosci雜志，3:1289，1983 ;Raff 等，Nature 雜志，303:390,1983 ;神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)手冊，第三版，Humana Press, Inc出版)，聚鳥氨酸或聚賴氨酸可用于涂覆培養(yǎng)容器。可涂覆1_40μ g/ml，優(yōu)選2-20μ g/ml，更優(yōu)選為5至15 μ g/ml聚鳥氨酸到培養(yǎng)容器。細(xì)胞粘附強(qiáng)度可能不同，這取決于培養(yǎng)容器的提供商、表面改良、樣式(format)和具體批號。對于每個(gè)來源的培養(yǎng)容器，可使用本領(lǐng)域中已知的方法確定涂層材料的最佳濃度。在一些實(shí)施方式中，與10yg/ml的聚鳥氨酸或聚賴氨酸孵育兩小時(shí)來涂覆容器，容器例如來自BD Falcon公司(美國，馬里蘭州，Sparks市)。在一些實(shí)施方式中，可與聚鳥氨酸或聚賴氨酸孵育30分鐘來涂覆容器，容器例如來自Nalgen Nunc International公司(美國，紐約州，羅切斯特市)。
[0105]從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞在化學(xué)上確定的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基允許細(xì)胞擴(kuò)增，不促進(jìn)細(xì)胞分化(例如，分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞)。所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如，但不限于，Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12，I: I (DMEM/F12) (Invitrogen公司)(例如，Iscove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基,RPM1-1640和Neurobasal)?；A(chǔ)培養(yǎng)基可補(bǔ)充各種成分以支持細(xì)胞健康和生存。這樣的成分可包括，但不限于，至少0.25%非必需氨基酸[NEAA(Invitrogen?) -1 %溶液，含有100 μ M L-丙氨酸，L-天冬酰胺h2o，L-天門冬氨酸，L-谷氨酸，甘氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸]，至少1.0mM的谷氨酰胺，至少0.5mM的丙酮酸，至少1%的B27補(bǔ)充物(Invitrogen公司? ),至少0.1mM的N-乙酰半胱氨酸和/或至少10 μ M的巰基乙醇。在一些實(shí)施方式中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以包括NS21 (Y.Chen等在J.Neurosc1.Methods.，171:239,2008公開的方法)代替B27添加劑。B27添加劑含有牛血清白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素，孕酮，皮質(zhì)酮，三碘-L-甲狀腺原氨酸，視黃醇醋酸酯，DL-生育酚，DL-生育酚醋酸酯，生物素，亞油酸，亞麻酸，乙醇胺，亞硒酸鈉，左旋肉堿，還原型谷胱甘肽，過氧化氫酶，超氧化物歧化酶，D-半乳糖和腐胺。Invitrogen公司已披露其成分,但并未透露它們的濃度。但是，原來的配方，B18添加劑，各成分的濃度已經(jīng)公開。NS21是基于此信息開發(fā)的，并且公開了各梯度的濃度。在神經(jīng)元培養(yǎng)中，它與B27添加劑一樣好。此外，NS21可用于培養(yǎng)來自于人類胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞。因此，該添加劑被視為替代B27添加劑的良好候選物。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包括DMEM/F12，添加有l(wèi)_4mM，更優(yōu)選為2.5mM的谷氨酰胺；10-25mM，更優(yōu)選為15mM的HEPES ；0.5-2.0mM,更優(yōu)選為ImM丙酮酸；1_4%，更優(yōu)選為2%的B27添加劑；0.25-3%，更優(yōu)選為1% NEAA ; 1-200 μ M，更優(yōu)選為50 μ Ml-硫代甘油；0.l-3mM,更優(yōu)選為ImM的N-乙酰半胱氨酸和/或10-100 μ M，更優(yōu)選為55μΜ的β-巰基乙醇。
[0106]此外，氧氣可促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的分化。因此，為了減少細(xì)胞分化，細(xì)胞可培養(yǎng)在1-20 % O2的生長環(huán)境。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中，置于提供37°C、1-10%更優(yōu)選5%的02、5% CO2的生長環(huán)境的培養(yǎng)箱中。建立HFSC細(xì)胞后，評估氧氣濃度的影響，但與擴(kuò)增HFSC細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中5% O2的條件相比，20% O2條件下分化的細(xì)胞并沒有增加。HFSC細(xì)胞在5% O2條件下的增長稍微快于20% O2條件。氧氣可引起氧化應(yīng)激并已知在嚙齒類細(xì)胞中誘導(dǎo)p53突變。為了減少突變的風(fēng)險(xiǎn)，我們保持在5% O2條件下培養(yǎng)HFSC細(xì)胞。
[0107]神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞在還含有促進(jìn)增殖的生長因子的培養(yǎng)基中中培養(yǎng)，以分離細(xì)胞。培養(yǎng)基中可包含至少5，10，20或40ng/ml血小板衍生生長因子-AA(TOGF-AA)，至少2.5，5或10ng/ml的堿性FGF (bFGF)，和/或至少為10，25或50 μ M的1-硫代甘油以分離細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中還包括至少1，5或10ng/ml的胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)。在一些實(shí)施方式中，PDGF-AA 可替換為 PDGF-BB，PDGF-AB, PDGF-CC,或PDGF-DD0在一些實(shí)施方式中，bFGF可替換為成纖維細(xì)胞生長因子的其它成員(如FGF-4或FGF-9)。在一些實(shí)施方式中，IGF-1可替換為IGF-2。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中包括 40-60 μ Ml-硫代甘油，40-200ng/ml 的 PDGF-AA，5-100ng/ml 的 bFGF，和 5-100ng/ml 的IGF-1以分離細(xì)胞。
[0108]分離的神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞在還含有生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以在分離細(xì)胞后刺激增殖。培養(yǎng)基中可含有至少為1，2，或5ng/ml的血小板衍生生長因子-AA (PDGF-AA)，至少為 0.5，I 或 5ng/ml 的堿性 FGF (bFGF)和 / 或至少 10，25 或 50 μ M 的1-硫代甘油以擴(kuò)增細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基中還包括至少為1，2或5ng/ml的胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中包括40-60μΜ的1_硫代甘油，5-100ng/ml 的 PDGF- AA，l_50ng/ml 的 bFGF，和 5-100ng/ml 的 IGF-1 以在 HFSC 細(xì)胞分離后擴(kuò)增細(xì)胞。
[0109]在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下生長的分離的神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞顯示出倍增時(shí)間為50-120小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，倍增時(shí)間為約60-100小時(shí)。細(xì)胞可以在至少8，11，14或17代中保持此增殖率。這些細(xì)胞每月可擴(kuò)增至少100，250，或優(yōu)選為至少500倍。在優(yōu)選實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)胞在多于18代中顯示擴(kuò)增率> I。
實(shí)施例
[0110]實(shí)施例1-HFSC細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增；基礎(chǔ)培養(yǎng)基和生長因子的確定
[0111]使用來自人類12周胎兒脊髓的HFSC細(xì)胞，該脊髓在得到捐贈(zèng)者知情同意后從Advanced Bioscience Resources, Inc.(美國，加利福尼亞州，阿拉美達(dá))獲得，在初步實(shí)驗(yàn)中測試幾種培養(yǎng)基和添加劑。將細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM:F-12(1: I) (DMEM/F12)中(Invitrogen?,美國，加州，卡爾斯巴德)，最初添加有2mM谷氨酰胺(Invitrogen?), ImM的丙酮酸(Invitrogen?)和2%B27添加劑(Invitrogen?)。檢測各種生長因子是否能刺激HFSC細(xì)胞增長。最有效的生長因子是I3DGF-AA和bFGF的組合。在TOGF-AA和bFGF存在下，細(xì)胞可以生長但顯示空泡而且看起來不健康。測試若干添加劑并觀察到添加I % NEAA以及2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸鹽和2% B27添加劑的DMEM/F12可降低空泡和稍微增加細(xì)胞數(shù)目(數(shù)據(jù)未示出)。其他添加劑包括ImM N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich?，美國，密蘇里州，圣路易斯)和55 μ Μβ-巰基乙醇(Invitrogen?)似乎改善細(xì)胞的狀態(tài)，但改善并不像添加NEAA那樣突出(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸、2% B27添加劑、I % NEAA, ImM的N-乙酰基半胱氨酸和55 μ M β -巰基乙醇的DMEM/F12確定為最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并用于其后的HFSC細(xì)胞培養(yǎng)。
[0112]從脊柱分割15周人胎兒脊髓，除去腦膜和外周神經(jīng)。然后用Accutase離解組織并洗滌，從人胎兒脊髓獲得的細(xì)胞在含有以下生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng):DMEM/F12，含有 2.5mM 谷氨酰胺和 15mM 的 HEPES，2 % B27 添加劑(Invitrogen?)，I % NEAA, 1.5mM的丙酮酸(Invitrogen?), 55 μ Μβ -巰基乙醇(Invitrogen?), ImM N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich?), 20ng/ml PDGF-AA (R&D Systems公司，美國明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯)和10ng/ml bFGF(R&D Systems公司)。然后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，保持在37°C，5% O2和5%C02。每天向培養(yǎng)基中加入bFGF(10ng/ml)。在傳代中每2_3天更換培養(yǎng)基。根據(jù)這些初步實(shí)驗(yàn)，在I3DGF-AA和bFGF存在下，生長的細(xì)胞并不多，許多細(xì)胞停止增殖或幾周內(nèi)死亡。這個(gè)結(jié)果似乎是合理的，因?yàn)楸磉_(dá)TOGF-Ra的細(xì)胞通常少于細(xì)胞的5%。為了去除不響應(yīng)I3DGF-AA和bFGF的細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)在超低粘附培養(yǎng)板(Coming Inc.，美國紐約州康寧)。響應(yīng)TOGF-AA和bFGF的細(xì)胞成為球形(參考圖3，微縮圖A)，不響應(yīng)的細(xì)胞不形成球體。對于更換培養(yǎng)基和傳代，將球體在較低速度離心收集(300rpm收集球體，I, OOOrpm收集單個(gè)細(xì)胞)。9天后，收獲細(xì)胞并傳代到聚鳥氨酸涂層的培養(yǎng)容器。該階段之后，每7-14天傳代細(xì)胞。在這些早期階段細(xì)胞顯示異質(zhì)形態(tài)(見圖3，微縮圖B和C)，許多細(xì)胞一個(gè)月內(nèi)停止增殖。增殖率隨著時(shí)間的推移越來越慢，細(xì)胞最終沒有擴(kuò)增。此外，細(xì)胞開始不健康，在其細(xì)胞質(zhì)中形成空泡。
[0113]實(shí)施例2-HSCF細(xì)胞擴(kuò)增的最佳生長條件的確定
[0114]如實(shí)施例1中提到，在培養(yǎng)基中加入TOGF-AA和bFGF能支持HFSC細(xì)胞最初足夠的生長，但2次傳代后的擴(kuò)散速率減慢。對NT-3 (R&D Systems公司)和IGF-1 (Sigma-Aldrich?)進(jìn)行了測試以確定它們是否可以提高HFSC細(xì)胞增殖。20ng/ml的TOGF-AA和10ng/ml的bFGF不足以刺激細(xì)胞增殖率(擴(kuò)增率為< I)(參見圖4)。隨后加入5ng/ml的NT-3和/或10ng/ml的IGF-1增強(qiáng)了增殖率(擴(kuò)增率變?yōu)?gt; I)。NT-3和IGF-1的組合在第3代最有效。每個(gè)條件中獲得的細(xì)胞進(jìn)一步傳代以確認(rèn)其效果。提前收獲細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞開始形成球體。在第4代，NT-3和IGF-1的組合恢復(fù)的增殖率下降，單獨(dú)添加IGF-1在第4代最有效。NT-3和IGF-1的組合可能會導(dǎo)致細(xì)胞分化或形成更多的球體而在更換培養(yǎng)基時(shí)丟失。因此，添加IGF-1被確定為最有效的存活因子并用于隨后的HFSC細(xì)胞培養(yǎng)。然而，HFSC細(xì)胞的增殖率在第4代的末期再次開始減緩，與接種細(xì)胞數(shù)相比細(xì)胞數(shù)減少。因此，測試另一種添加劑，1-硫代甘油是否能夠提高HFSC細(xì)胞在第5代的增殖。
[0115]圖5顯示了 1-硫代甘油在HFSC細(xì)胞增殖上的效果。初始生長因子組合(20ng/mlPDGF-AA+1 Ong/ml bFGF)完全不能擴(kuò)增細(xì)胞(圖中未示出這一數(shù)據(jù)，因?yàn)槠涞陀诳捎?jì)數(shù)范圍)。從第3代開始使用的生長因子組合(20ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF+10ng/ml IGF-1)比這一組合(20ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF)更有效，但無法刺激第4代后的HFSC細(xì)胞增殖(圖4)。許多與脂肪酸和相關(guān)的長鏈烴類的生物合成和降解相關(guān)的輔因子具有硫醇。接下來在HFSC細(xì)胞上測試1-硫代甘油，因?yàn)樗且环N硫醇系抗氧化劑，已有報(bào)道顯示其刺激某些細(xì)胞增殖(如小鼠胚胎皮層和海馬神經(jīng)元，小鼠骨髓肥大細(xì)胞，人B細(xì)胞系)。此外，也測試了更高劑量的TOGF-AA(100ng/ml)是否能夠彌補(bǔ)對生長因子反應(yīng)性的下降。
[0116]在20ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF 和 I Ong/ml IGF-1 存在下加入 50 μ Ml-硫代甘油輕微刺激了細(xì)胞增殖，但細(xì)胞數(shù)目仍然下降(擴(kuò)增率< I)。此結(jié)果與1-硫代甘油不存在時(shí)，在存在10ng/ml bFGF+1 Ong/ml IGF-1的情況下I3DGF-AA濃度增大到100ng/ml結(jié)果類似。然而，當(dāng)50 μ Ml-硫代甘油和提高的TOGF-AA (100ng/ml)都包含在培養(yǎng)基中(依然有10ng/ml的bFGF和10ng/ml的IGF-1)，這兩種成分似乎協(xié)同作用，顯著增加了細(xì)胞數(shù)(擴(kuò)增率> I)。當(dāng)IGF-1從此添加物組合中消除(即總添加物為100ng/ml的TOGF-AA+1 Ong/ml的bFGF+50 μ Ml-硫代甘油)，擴(kuò)增率減少到< 1，表明IGF-1也促進(jìn)HFSC細(xì)胞增殖和/或存活。但是，如果HFSC細(xì)胞在此條件下進(jìn)行培養(yǎng)更長時(shí)間，HFSC細(xì)胞即使在這種狀態(tài)下也可能擴(kuò)增。此數(shù)據(jù)表明，加入50μ M的1-硫代甘油和I3DGF-AA濃度增加到100ng/ml加入到10ng/ml的bFGF+1 Ong/ml的IGF-1中對細(xì)胞擴(kuò)增是重要的。此外，IGF-1的添加可能不是必須的，但即使在50 μ M的1-硫代甘油和100ng/ml的TOGF-AA存在下仍然能有效增加擴(kuò)增率。5(^]?1-硫代甘油和100叩/1111?06?-44的組合以及101^/1111 bFGF+1 Ong/ml IGF-1用于隨后的HFSC細(xì)胞培養(yǎng)。
[0117]在100ng/ml 的 PDGF-AA，10ng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1 和 50 μ M 的 1-硫代甘油存在下，HFSC細(xì)胞在第6代以后進(jìn)一步擴(kuò)增。傳代后在這些條件下細(xì)胞開始更迅速地增殖，在一個(gè)星期之內(nèi)擴(kuò)增了 3-4倍。在這種情況下倍增時(shí)間約60-100小時(shí)。即使在8代(圖3，微縮圖D)、ll代(圖3，微縮圖E)和19代(圖3，微縮圖F)之后，HFSC細(xì)胞仍然能夠保持這種增殖狀態(tài)。因此，含有 100ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1 和 50 μ M的1-硫代甘油的確定的培養(yǎng)基被鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞長期擴(kuò)增的最佳培養(yǎng)條件。
[0118]實(shí)施例3-HSCF細(xì)胞的自發(fā)分化技術(shù)
`[0119]測試各種培養(yǎng)條件時(shí)，觀察到當(dāng)HFSC細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)從培養(yǎng)基移除bFGF，許多細(xì)胞似乎分化為兩極或多極細(xì)胞(指示少突膠質(zhì)細(xì)胞)并很快死亡。為了避免這些細(xì)胞死亡，開發(fā)了自發(fā)分化技術(shù)。
[0120]培養(yǎng)基通常是每2天更換以擴(kuò)增HFSC細(xì)胞，認(rèn)為這對保持HFSC細(xì)胞在增殖狀態(tài)是非常重要的。為加強(qiáng)細(xì)胞分化，本實(shí)驗(yàn)每3天或4天更換培養(yǎng)基。堿性FGF和高濃度的TOGF-AA被認(rèn)為阻止HFSC細(xì)胞分化，但其對HFSC細(xì)胞生存也很重要。因此，在存在IOng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1和具有50 μ Ml-硫代甘油或不具有1-硫代甘油的情況下，PDGF-AA濃度從100減少到20ng/ml。如果移除bFGF，HFSC細(xì)胞無法很好地生存。通常情況下，每天補(bǔ)充bFGF以保持HFSC細(xì)胞增殖狀態(tài)。當(dāng)停止補(bǔ)充bFGF，許多HFSC細(xì)胞從其集群分離，并形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀突起(指示前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞)并良好存活，如圖7，微縮圖A和B所示。
[0121]如圖7的微縮圖C-F所示,這些具有蛛網(wǎng)狀形態(tài)的process-bearing細(xì)胞對04抗原和/或GalC抗原呈陽性，因此，認(rèn)為這些細(xì)胞是前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞(04陽性和GalC陰性)或未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞(04陽性和GalC陽性)。即使在1-硫代甘油的存在下，HFSC細(xì)胞也可以分化，但當(dāng)培養(yǎng)基中存在1-硫代甘油時(shí)過程的復(fù)雜程度看起來更簡單，如圖7中微縮圖A和B所示。此外，其它細(xì)胞類型(如星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元)很少觀察到，HFSC細(xì)胞被認(rèn)為容易僅分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。這種技術(shù)使得能夠觀察到處于健康狀態(tài)的分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。
[0122]這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，由于大部分的分化細(xì)胞表現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的特征和類似于少突膠質(zhì)細(xì)胞或前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞，本發(fā)明的培養(yǎng)條件尤其可用于擴(kuò)增容易分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離的神經(jīng)干細(xì)胞和/或神經(jīng)祖細(xì)胞。
[0123]實(shí)施例4-從常規(guī)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)HFSC細(xì)胞
[0124]如圖1所示，傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞被認(rèn)為是HFSC細(xì)胞的前身。為確認(rèn)此關(guān)系，檢測了是否如先前報(bào)道的能從常規(guī)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)HFSC細(xì)胞。源于人胎兒脊髓(11孕周)第二個(gè)組織樣本的細(xì)胞最初在10ng/ml的EGF和10ng/ml的bFGF的存在下培養(yǎng)于DMEM/F12中15天以擴(kuò)增傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞，DMEM/F12中含有2.5mM谷氨酰胺，15mM的HEPES，2%的B27添加劑，I % NEAA, 1.5mM的丙酮酸，55 μ Μβ -巰基乙醇，ImM的N-乙酰-L-半胱氨酸。最初存在許多不同類型的細(xì)胞，但在原代培養(yǎng)末期時(shí)，得到一些可擴(kuò)增的細(xì)胞群。這些結(jié)果示于圖8，微縮圖Α，0代第15天。第1次傳代之后，在與克隆#2b相同的條件下(即，含有10ng/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1,100ng/ml PDGF-AA 和 50 μ Ml-硫代甘油的 HFSCMl 培養(yǎng)基)培養(yǎng)細(xì)胞至15代。
[0125]原代培養(yǎng)末期時(shí)獲得的可擴(kuò)增細(xì)胞群中的細(xì)胞形態(tài)在約第5代變得同質(zhì)，細(xì)胞傾向于形成集群和球體，與克隆#2形成的類似(參見圖8，微縮圖B-F)。此外，該克隆可自發(fā)分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)，顯示與克隆#2b相同的免疫表型(數(shù)據(jù)未示出)以及如實(shí)施例7所述通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到顯示相同的標(biāo)志物表達(dá)模式。冷凍來自于該克隆的細(xì)胞用于進(jìn)一步的測試(如圖12)。該數(shù)據(jù)表明，HFSC細(xì)胞可以從傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)，傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞被認(rèn)為是HFSC細(xì)胞的前身。
[0126]認(rèn)為TOGF-AA通過TOGF受體α起作用。已知這種受體被所有TOGF家族成員(PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC 和 PDGF-DD)激活。利用細(xì)胞克隆 #2h 和克隆 #3，使用I3DGF-BB來研究I3DGF-BB是否可以替換H)GF-AA。I3DGF-BB在除I3DGF-AA外的相同條件下可擴(kuò)增兩個(gè)克隆，證明TOGF-AA可成功地被其它TOGF家族成員替換。
[0127]實(shí)施例5-最佳細(xì)胞培養(yǎng)成分的確定
[0128]當(dāng)本申請發(fā)明人測試HFSC細(xì)胞(克隆#2b)建立后的不同的培養(yǎng)條件時(shí)，發(fā)明人注意到對各生長因子的劑量響應(yīng)已經(jīng)變化。為了分離HFSC細(xì)胞(克隆#2b)，除了 50μΜ的1-硫代甘油外，較高濃度的roGF-AA(100ng/ml)是必要的。該克隆變?yōu)槌掷m(xù)增殖后，不再需要高濃度的I3DGF-AA(100ng/ml)來擴(kuò)增克隆。擴(kuò)增率在約10_20ng/ml TOGF-AA時(shí)飽和，更高濃度的TOGF-AA(100ng/ml)對克隆增長并無額外效果。這可能是因?yàn)殚L期培養(yǎng)或連續(xù)使用1-硫代甘油。為了建立HFSC細(xì)胞克隆#2b和克隆#3，幾代后使用1-硫代甘油。為了研究較高濃度的I3DGF-AA的效果，在1-硫代甘油的存在下，從初始培養(yǎng)建立了新的克隆。此外，對bFGF和IGF-1的響應(yīng)似乎分別在20ng/ml和40ng/ml飽和。當(dāng)使用較高濃度的IGF-1 (50-500ng/ml)時(shí)，可以看到更多的分化細(xì)胞(看起來1%左右)。因此，認(rèn)為20ng/ml IGF-1對于擴(kuò)增HFSC細(xì)胞是優(yōu)選的。使用20ng/ml的bFGF和20ng/ml的IGF-1，與使用10ng/ml的bFGF和10ng/ml的IGF-1相比，擴(kuò)增率提高了 5%至10%。因此，本實(shí)驗(yàn)使用了 20ng/ml 的 bFGF 和 20ng/ml 的 IGF-1。
[0129]來自第三個(gè)樣品(12孕周)的HFSC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以研究在鑒定出的最佳培養(yǎng)基成分中是否需要較高濃度的TOGF-AA，以及它們是否能在另一批次的細(xì)胞中提供類似的生長特性。細(xì)胞在與克隆#2b和#3相同的培養(yǎng)基(即HFSCMl培養(yǎng)基和50 μ M的1-硫代甘油)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有20ng/ml (克隆#4A)或100ng/ml (克隆#4B) TOGF-AA以及20ng/ml的bFGF和20ng/ml的IGF-1。在第I代末期，克隆MA細(xì)胞數(shù)少于克隆#4B的三分之一(圖11,微縮圖A和B)。然而,在第I代后，克隆#4A開始以與克隆#4B類似的速度增殖，即使其I3DGF-AA濃度低于克隆#4B。在第3代細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榫|(zhì)，細(xì)胞傾向于形成集群和球體，與克隆#2b或克隆#3形成的類似(參見圖10，微縮圖C-F)。此外，與克隆#2B和#3 —樣，這些細(xì)胞可以自發(fā)地分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。這一結(jié)果表明，對于分離HFSC細(xì)胞，較高濃度的I3DGF-AA不是必須的(mandatory)，但是優(yōu)選的，而且一旦HFSC細(xì)胞建立，較高濃度的I3DGF-AA不是必要的(necessary)。此外，這種培養(yǎng)方法可以在另一批次細(xì)胞中提供相似的生長特性，確認(rèn)了此過程是可重復(fù)的。冷凍來自該克隆的細(xì)胞用于進(jìn)一步的測試。
[0130]實(shí)施例6-凍融循環(huán)后擴(kuò)增的HFSC細(xì)胞恢復(fù)和生長的能力
[0131]克隆#2b的細(xì)胞在10、11、12代在8% DMSO存在下冷凍保存。11代冷凍的HFSC細(xì)胞(克隆#2B)已保藏在ATCC (保藏編號PTA-12291，保藏日期:2011年11月30日，保藏單位:美國典型培養(yǎng)物保藏中心)?？寺?3的細(xì)胞在9代和10代也在8% DMSO的存在下冷凍保存?？寺?4A和#4B的細(xì)胞增長快于克隆#2b或#3，因此它們在相同狀態(tài)下在4代和5代(克隆#4A)或3代、4代和5代(克隆#4B)在8% DMSO存在下冷凍保存。用于培養(yǎng)HFSC細(xì)胞的培養(yǎng)基(HFSCM1培養(yǎng)基和50 μ M的1-硫代甘油)同樣用于冷凍HFSC細(xì)胞。其后解凍細(xì)胞并在具有IOng / ml的bFGF，IOng / ml的IGF-1，IOOng / ml的TOGF-AA或20ng / ml 的 bFGF，20ng / ml 的 IGF-1, 20ng / ml PDGF-AA 的上述無血清 HFSCMl 培養(yǎng)基和50μΜ的1-硫代甘油中培養(yǎng)細(xì)胞。觀察這些細(xì)胞發(fā)現(xiàn)以與冷凍前相似的速度增殖(圖6，圖9和圖11)。冷凍的細(xì)胞用于圖12-15中所示的接下來的實(shí)驗(yàn)。
[0132]實(shí)施例7-擴(kuò)增的和未分化的HFSC細(xì)胞的表征
[0133]當(dāng)實(shí)施例2 的 HFSC 細(xì)胞在` 100ng/ml PDGF-AA, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1 和50 μ Ml-硫代甘油存在下培養(yǎng)，它們生長為集群和/或球體，如圖3，微縮圖D-F所示。從集群中分離出來的分散的細(xì)胞，具有分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的趨勢，如在圖3，微縮圖D和E所示。即使在單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行細(xì)胞傳代，它們最終開始聚集并再次形成集群。他們在增殖狀態(tài)的形狀與少突膠質(zhì)細(xì)胞前祖細(xì)胞類似(Ben-Hur等，J.Neurosci雜志，18:5777，1998 ；Gago等，Mol.Cell.Neurosci雜志,22:162,2003),但并不像生長成雙極形態(tài)不形成任何集群的0-2A祖細(xì)胞。雖然大鼠少突膠質(zhì)前祖細(xì)胞很久以前就被報(bào)道過，但在人類中對應(yīng)的細(xì)胞尚未見報(bào)道。然而，確定擴(kuò)增的細(xì)胞培養(yǎng)物中少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的精確階段是不必要的，因?yàn)椴还苋绾嗡鼈儽３至似浞只缮偻荒z質(zhì)細(xì)胞的能力(如下所示)。
[0134]為了表征未分化HFSC細(xì)胞的免疫表型，用Accutase(創(chuàng)新細(xì)胞技術(shù)公司(Innovative Cell Technologies),美國加州圣迭戈)把11_15代的細(xì)胞離解成單細(xì)胞狀態(tài)并在聚鳥氨酸包被的24孔培養(yǎng)板生長，在存在100ng/ml PDGF-AA, 10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和50 μ Ml-硫代甘油情況下培養(yǎng)3-7天。隨后將細(xì)胞用4 %多聚甲醛固定，然后用PBS洗滌。為了染色表面抗原如CD133，PDGF-Ra，NG2, A2B5, 04，01，GalC和PSA-NCAM，細(xì)胞用含3%正常山羊(gout)血清(NGS)的PBS封閉并用抗體染色。對于染色細(xì)胞內(nèi)抗原如Sox2，巢蛋白，01ig2，髓鞘堿性蛋白(MBP)，波形蛋白，GFAP，β III微管蛋白，神經(jīng)絲蛋白-L和ΜΑΡ2，在封閉前將細(xì)胞用0.1%的Triton X-100在冰冷的PBS中通透。在含有 3% NGS 的 PBS 中，以 I: 300(CD133/1)，I: 300 (PDGF-R α )，I: 600 (NG2)，I: 1000 (PSA-NCAM)，I: 1000 (Α2Β5), I: 1000(04),I: 1000(01),I: 1000(Sox2),I: 200(巢蛋白)，1: 200(01ig2), I: 100 (GalC)，I: 50 (MBP)，I: 500(波形蛋白)，I: 1000 (GFAP)，I: 100 (β III 微管蛋白)，I: 200 (神經(jīng)絲蛋白-L)，I: 1000 (MAP2,多克隆)或1: 200(MAP2，單克隆)，使用⑶133/1小鼠IgGl單克隆抗體(克隆AC133，Miltenyi生物技術(shù)公司)，抗TOGF-Ra的兔多克隆抗體(Upstate公司)，抗NG2的兔多克隆抗體(Millipore公司)，抗PSA-NCAM小鼠IgM單克隆抗體(Millipore公司)，A2B5小鼠IgM的單克隆抗體(Millipore公司)，04小鼠IgM單克隆抗體(R&D系統(tǒng)公司)，01小鼠IgM單克隆抗體(Millipore公司)，抗_Sox2的兔多克隆抗體(Millipore公司)，抗-巢蛋白的小鼠IgGl單克隆抗體(Millipore公司)，抗_01ig2小鼠單克隆IgG2a抗體，抗GalC的單克隆IgG3抗體(Millipore公司)，抗-MBP大鼠單克隆IgG2a抗體(Millipore公司)，抗波形蛋白的小鼠IgGl單克隆抗體(Santa Cruz公司)，抗GFAP兔多克隆抗體(Millipore公司)，抗β III微管蛋白的單克隆小鼠IgGl抗體(Millipore公司),抗神經(jīng)絲蛋白-L的小鼠單克隆IgGl抗體(Cell Signaling公司)，抗MAP2的兔多克隆抗體(Millipore公司)和抗MAP2小鼠IgGl單克隆抗體(Millipore公司)。在4°C過夜培養(yǎng)后，更換含3% NGS的PBS3次以清洗孔。在一些情況下，使用對于某些細(xì)胞表面抗原(NG2，A2B5，04，01和⑶3)染色的活細(xì)胞以減少非特異性信號。在這種情況下，不封閉，在固定前將細(xì)胞用各一抗染色。在含有 0.5% BSA 的 PBS 中，以 I: 150 (NG2), I: 100 (A2B5), I: 200 (04)，I: 100(01)和1: 200 (⑶3)，使用抗NG2的兔多克隆抗體，A2B5小鼠IgM單克隆抗體，04小鼠IgM單克隆抗體，01小鼠IgM單克隆抗體，和抗-雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD3小鼠單克隆IgG3抗體(Millipore公司)。在室溫下孵育30分鐘后，更換含有0.5% BSA的PBS3次以清洗孔。二抗，DyLight488-稱合的AffiniPure山羊抗兔IgG (Fe Y片段特異性)，DyLight488_ f禹合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG (Fe Y片段特異性),DyLight488_稱合的AffiniPure山羊抗兔 IgG (H+L), DyLight488- f禹合的 AffiniPure 山羊抗大鼠 IgG (H+L), DyLight594_ f禹合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L),和/或DyLight594_ i禹合的Aff iniPure山羊抗小鼠IgM(μ鏈特異性)(所有二抗均購自杰克遜免疫研究實(shí)驗(yàn)室公司)以1: 500稀釋在室溫下使用I小時(shí)。然后用PBS清洗細(xì)胞2次。使用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。然后用帶有落射熒光設(shè)備的Olympus 1X81觀察細(xì)胞。
[0135]大多數(shù)HFSC細(xì)胞為CD 133陽性(圖12，微縮圖A和B)，Sox2陽性(圖12，微縮圖C和D)和巢蛋白陽性(圖12，微縮圖E和F)，指示它們是神經(jīng)干細(xì)胞。大多數(shù)HFSC細(xì)胞為01ig2陽性(通常指示運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞)(圖12，微縮圖G和H)，PDGF-Ra陽性(通常指示少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞)(圖12，微縮圖1和J)，A2B5陽性(A2B5通常不存在于神經(jīng)干細(xì)胞，通常見于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和2型星形膠質(zhì)細(xì)胞上)(圖12，微縮圖M和N)，指示少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞。大多數(shù)的HFSC細(xì)胞PSA-NCAM陽性(圖12，微縮圖O和P)，但其表達(dá)水平有變化(PSA-NCAM通常不存在于神經(jīng)干細(xì)胞，通常見于神經(jīng)元祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的前祖細(xì)胞上)。未見到GFAP陽性細(xì)胞， 但大部分是波形蛋白陽性(參見圖12，微縮圖Q和S)。至少90%的HFSC細(xì)胞對上述除GFAP外的標(biāo)志物是陽性的，但精確計(jì)數(shù)是非常困難的，因?yàn)镠FSC細(xì)胞往往形成集群，在固定和染色中也可以很容易地脫離培養(yǎng)容器。為了量化其純度，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果如圖13中所示。
[0136]此外，通過免疫組化，未分化的HFSC細(xì)胞與04抗體染色較弱，該抗體是前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞(04陽性，GalC陰性)和未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞(04陽性，GalC陽性)的標(biāo)志物，但很難區(qū)分弱染色和非特異性染色。在該細(xì)胞培養(yǎng)物中可以觀察到一些對04抗體呈強(qiáng)陽性的形態(tài)多極化的前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞，但其出現(xiàn)頻率少于細(xì)胞總數(shù)的I %。
[0137]另外，未分化的HFSC細(xì)胞對抗-MAP2抗體弱染色，但它們的形態(tài)不像神經(jīng)元。當(dāng)抗體用于在血清存在下分化的細(xì)胞時(shí)，以強(qiáng)烈的信號和神經(jīng)元形態(tài)鑒定到神經(jīng)元(參見圖14中的微縮圖H)。沒有在未分化的HFSC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這種與MAP2的強(qiáng)烈信號以及神經(jīng)元形態(tài)。細(xì)胞分化后微弱信號消失，所以這種染色似乎是特異的，未分化的HFSC細(xì)胞可能不是非特異性染色。
[0138]總體上說，HFSC細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物(⑶133，Sox2和巢蛋白)和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的特異性標(biāo)志物(01ig2，NG2, A2B5，和04)。這些數(shù)據(jù)表明HFSC細(xì)胞可能是神經(jīng)干細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞之間的中間細(xì)胞。另外，除上述抗原外，HFSC細(xì)胞表達(dá)PSA-NCAM，指示是大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞前祖細(xì)胞的人類對應(yīng)物。
[0139]PSA-NCAM中的聚唾液酸(PSA)是長的、帶負(fù)電荷、細(xì)胞表面的聚糖，具有大量水合容量來調(diào)節(jié)細(xì)胞間的距離。PSA參與成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一些與可塑性相關(guān)的反應(yīng)，包括晝夜和激素模式的變化，痛苦和壓力適應(yīng)，以及學(xué)習(xí)和記憶方面(RutishauserNat等，Rev.Neurosci雜志，9:26，2008)。PSA在新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)的功能之一是少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的遷移。在創(chuàng)傷模型中，當(dāng)PSA從遷移中的02A祖細(xì)胞移除時(shí)，02A祖細(xì)胞的遷移被抑制(Barral-Moran 等，J.Neurosc1.Res 雜志，72 =679,2003)。PSA 另一個(gè)作用是控制細(xì)胞的分化時(shí)間。PSA在發(fā)育中的軸突 和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體中都有表達(dá)，在這些細(xì)胞上的表達(dá)下調(diào)與髓鞘化的啟動(dòng)相關(guān)。PSA也與成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與可塑性相關(guān)的反應(yīng)有關(guān)。由于PSA能夠調(diào)節(jié)發(fā)育和成人可塑性，因此考慮到表達(dá)PSA的細(xì)胞可在由于受傷或疾病而使組織受到了損害的情況中具有治療價(jià)值。在創(chuàng)傷模型中通過疤痕觀察到PSA表達(dá)區(qū)的軸突再生(在疤痕中或在嫁接的Schwann細(xì)胞上工程化的PSA表達(dá))。HFSC細(xì)胞是內(nèi)源性表達(dá)PSA的細(xì)胞，將對治療創(chuàng)傷如腦損傷或脊髓損傷治療具有同樣的效果。
[0140]為了進(jìn)一步表征HFSC細(xì)胞(克隆#2B)，解凍在11代冷凍的細(xì)胞，在上述生長條件下培養(yǎng)，每7-9天傳代。然后將在13代培養(yǎng)9天的細(xì)胞使用以下抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù):PE耦合的抗-CD133/1小鼠IgGl單克隆抗體(克隆AC133，Miltenyi生物技術(shù)公司)，PE耦合的⑶140a小鼠IgG2a單克隆抗體(克隆a Rl，BD Pharmingen公司)，PE耦合的⑶9小鼠IgGl單克隆抗體(克隆M-L13，BD Pharmingen公司)，PE耦合的CD44小鼠IgG2b單克隆抗體(克隆G44-26，BD Pharmingen公司)，PE耦合的抗-PSA-NCAM小鼠IgM單克隆抗體(2-2B,Miltenyi生物技術(shù)公司)，PE耦合的A2B5小鼠IgM單克隆抗體(克隆105HB29,Miltenyi生物技術(shù)公司)，PEf禹合的04小鼠IgM單克隆抗體(克隆04,MiItenyi生物技術(shù)公司)，和PE耦合的抗-NG2小鼠IgGl單克隆抗體(R&D系統(tǒng)公司)。簡單地說，用Accutase離解之后，將細(xì)胞洗滌，重懸在冰冷的具有2mM EDTA和0.5% BSA的PBS中并保存在冰上。計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量后，使用冰冷的具有2mM EDTA和0.5% BSA的PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為IxlO7個(gè)細(xì)胞/ml。25 μ I細(xì)胞懸浮液(250，OOO個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到每個(gè)1.5毫升管。然后一抗按照制造商的建議分別加入到各管中，用每個(gè)抗體的PE耦合的同種型對照來設(shè)置適當(dāng)?shù)拈T。在冰上孵育20分鐘后，用冰冷的具有2mM EDTA和0.5% BSA的PBS洗滌細(xì)胞，并重新懸浮在固定緩沖液(BD Bioscience公司)。在冰上固定20分鐘后，將細(xì)胞洗滌，再懸浮在冰冷的具有2mM EDTA 和 0.5% BSA 的 PBS 中。使用 FACS Canto II (BD Bioscience 公司)測量細(xì)胞的突光，使用 Gatelogic 軟件(Inivai Technologies Pty Ltd.)分析每個(gè)數(shù)據(jù)。
[0141]如圖13所示，所有或大多數(shù)的HFSC細(xì)胞(克隆#2b)為⑶133陽性(100%的細(xì)胞)，CD9陽性(100%的細(xì)胞)，CD140a陽性(98.8%的細(xì)胞)，NG2陽性(89.8%的細(xì)胞)，A2B5陽性(99.9%的細(xì)胞)，04陽性(94.6 %的細(xì)胞)，PSA-NCAM陽性(68.9%的細(xì)胞)，⑶44陰性(0.4%的細(xì)胞呈陽性)。通過免疫組化，04信號幾乎不能和非特異性染色區(qū)別開，并且遠(yuǎn)弱于前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的04信號。從流式細(xì)胞儀結(jié)果可以看至lj，HFSC細(xì)胞(克隆#2b)的04信號能夠與同種型對照組分開，HFSC細(xì)胞(克隆#2b)對04抗原呈現(xiàn)弱陽性。HFSC細(xì)胞(克隆#3)通過流式細(xì)胞儀顯示出幾乎相同的表型。這些細(xì)胞為⑶133陽性(98.4%的細(xì)胞)，⑶9陽性(99.4%的細(xì)胞)，⑶140 α陽性(91.5%的細(xì)胞)，NG2陽性(63.4%的細(xì)胞)，A2B5陽性(99.8%的細(xì)胞)，04陽性(71.6%的細(xì)胞)，PSA-NCAM陽性(74.7%的細(xì)胞)，⑶44陰性(0.3%的細(xì)胞為陽性)。
[0142]實(shí)施例8-擴(kuò)增的HFSC細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中的分化潛力
[0143]為了測試擴(kuò)增的細(xì)胞的分化潛能，將HFSC細(xì)胞(克隆#3)傳代到分離/單細(xì)胞階段，并在含血清的培養(yǎng)基[少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞分化培養(yǎng)基(OPCDM)] (ScienCe 11?研究實(shí)驗(yàn)室)中培養(yǎng)以刺激分化。然后細(xì)胞用抗體染色，這些抗體識別神經(jīng)元(抗_β III微管蛋白抗體，抗-神經(jīng)絲蛋白-L抗體和抗-ΜΑΡ2抗體)，少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[04抗體，01抗體抗-GalC抗體和抗-髓鞘堿性蛋白(MBP)抗體]，和星形膠質(zhì)細(xì)胞(抗-GFAP抗體)，然后使用熒光染料耦合的二抗(DyLight488，或DyLight594，JacksonImmunoResearch公司)。使用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。
[0144]在經(jīng)過處理以刺激HFSC細(xì)胞分化之后，觀察到了所有三種主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)表型。當(dāng)HFSC細(xì)胞培養(yǎng)在含血清的培養(yǎng)基時(shí)，檢測到β III微管蛋白陽性細(xì)胞、神經(jīng)絲蛋白-L陽性細(xì)胞、和ΜΑΡ-2陽性細(xì)胞(指示神經(jīng)元)。大量β III微管蛋白陽性細(xì)胞(圖14中，微縮圖B)，少量細(xì)胞是神經(jīng)絲蛋白-L(圖14中，微縮圖Ε)或ΜΑΡ2(圖14中，微縮圖H)陽性。這一結(jié)果表明，其中許多是未成熟的神經(jīng)元。HFSC細(xì)胞也可以分化成MBP-陽性細(xì)胞。MBP是髓磷脂的主要組分，只在成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。此數(shù)據(jù)表明，HFSC細(xì)胞有能力分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。評價(jià)了 MBP和上述神經(jīng)元標(biāo)志物的共定位，但僅可看到少數(shù)共定位(圖14中的微縮圖C，F(xiàn)，I)。這可能是由于神經(jīng)元不成熟，因?yàn)樗枨什粫话谖闯墒斓纳窠?jīng)元軸突上。還評價(jià)了 MBP和04抗原的共定位(圖14，微縮圖J-L)。大多數(shù)MBP信號與04抗原信號共定位，但只有一半的04抗原信號與MBP信號共定位。這個(gè)結(jié)果是合理的，因?yàn)?4抗原在少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞、不成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，而MBP只在成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。這些細(xì)胞對GalC抗原也為陽性(數(shù)據(jù)未示出),GalC抗原是不成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。如圖14,微縮圖M-O所示,還檢測了 GFAP陽性細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞)和波形蛋白陽性細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)顯示，擴(kuò)增的HFSC細(xì)胞是專能的，并且，因此它們可能是神經(jīng)干細(xì)胞，因?yàn)槿Q于環(huán)境，它們能夠產(chǎn)生三種主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞表型。HFSC細(xì)胞(克隆#2b)在相同條件下進(jìn)行了測試，顯示了與HFSC細(xì)胞(克隆#3)同樣的專能性。
[0145]實(shí)施例9-擴(kuò)增的HFSC細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的分化潛力
[0146]如圖5所示，在不補(bǔ)充bFGF的情況下通過降低I3DGF-AA濃度，HFSC細(xì)胞表現(xiàn)出良好的分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能。然而，分化的細(xì)胞少于細(xì)胞總數(shù)的一半。如果在沒有bFGF，有10ng/ml PDGF-AA和100ng/ml IGF-1的情況下，以很低的密度接種HFSC細(xì)胞(< 0.5 X IO4個(gè)細(xì)胞/平方厘米)，大多數(shù)細(xì)胞看起來都分化，但在一天之內(nèi)消失。為了檢驗(yàn)它們再分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，認(rèn)為誘導(dǎo)分化和長期細(xì)胞存活是非常重要的。已知環(huán)狀A(yù)MP(cAMP)誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型的分化。PCPT-cAMP是一種可滲透細(xì)胞的cAMP類似物，測試了其是否能夠在HFSC細(xì)胞誘導(dǎo)分化。100 μ M的pCPT-cAMP能夠誘導(dǎo)高密度HFSC細(xì)胞(3 X IO4個(gè)細(xì)胞/平方厘米)分化，但細(xì)胞無法良好生存，即使存在100ng/ml的IGF-1。有報(bào)道顯示BDNF能夠增強(qiáng)少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞分化和支持分化的細(xì)胞的細(xì)胞生存。當(dāng)HFSC細(xì)胞在存在 10ng/ml 的 PDGF-AA，100ng/ml 的 IGF-1，100 μ M 的 pCPT-cAMP 和 10ng/ml 的BDNF的DMEM/F12中分化時(shí)，至少多于一半的HFSC細(xì)胞分化成process-bearing細(xì)胞,所述DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES，并補(bǔ)充有B27添加劑，N2添加劑和50 μ M的1-硫代甘油。由于HFSC細(xì)胞表達(dá)幾種少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如04或NG2，因此需要一種區(qū)分HFSC細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的新方法。根據(jù)幾次試驗(yàn)，發(fā)明人注意到，未分化的細(xì)胞表達(dá)GD3要強(qiáng)于少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，04反之(圖11，微縮圖B和微縮圖<?的箭頭)。當(dāng)用⑶3和04染色細(xì)胞時(shí)，少突膠質(zhì)細(xì)胞可以通過染色模式和它們的形態(tài)而區(qū)分出來。此外，其他類型的細(xì)胞， 如神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞也可以被識別，因?yàn)樗鼈儾槐磉_(dá)GD3或04抗原。圖15，微縮圖D顯示了不同細(xì)胞類型的比例。未分化細(xì)胞占總細(xì)胞的23.5% ±2.0%。少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞占總細(xì)胞的75.8% ±2.1%。其他類型的細(xì)胞僅為0.9% ±0.6%。如上所述，少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞相對于分化的細(xì)胞(少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞加上其它細(xì)胞類型)的比率為分化的細(xì)胞的99.1% ±0.56%，而其他類型的細(xì)胞為分化細(xì)胞的0.9% ±0.56%。此數(shù)據(jù)表明，HFSC細(xì)胞具有分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的高潛能。
[0147]實(shí)施例10-通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)法或磁性分選法富集或選擇HFSC細(xì)胞
[0148]本發(fā)明公開了 HFSC細(xì)胞的表型為⑶133陽性，⑶140a陽性，⑶9陽性，⑶44陰性，PSA-NCAM陽性，A2B5陽性，04陽性和NG2陽性。此信息可用來選擇或富集HFSC細(xì)胞而不用培養(yǎng)。CD133是神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物，在祖細(xì)胞或前體細(xì)胞中不表達(dá)。CD9也用作神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物，但已知有些少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)⑶9。PSA-NCAM和A2B5用于檢測神經(jīng)元限制性前體細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞。認(rèn)為大多數(shù)神經(jīng)前體細(xì)胞和祖細(xì)胞表達(dá)PSA-NCAM和A2B5或者PSA-NCAM或A2B5，應(yīng)用它們富集HFSC細(xì)胞效果不怎么好，尤其是在第一和第二個(gè)三個(gè)月(trimester)。CD140a，NG2，A2B5和04用作少突膠質(zhì)前體細(xì)胞、前-少突膠質(zhì)細(xì)胞(pro-oligodendroglia)和少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。在HFSC細(xì)胞中Q)140a和NG2的表達(dá)水平比在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞、前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞、或少突膠質(zhì)細(xì)胞更高，而A2B5和04在HFSC細(xì)胞中的表達(dá)水平比在少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞、前-成少突膠質(zhì)細(xì)胞、或少突膠質(zhì)細(xì)胞少。認(rèn)為應(yīng)用CD140a和NG2更適合富集HFSC細(xì)胞?；诒景l(fā)明上述所述信息和數(shù)據(jù)，每個(gè)標(biāo)志物用來富集HFSC細(xì)胞的有效性為⑶140a > NG2 >⑶9 >⑶133 > A2B5 > 04，PSA-NCAM,但這個(gè)順序?qū)⒁蛟兄芏淖?。[0149]然而，單一的標(biāo)志物并不足以選擇HFSC細(xì)胞，兩個(gè)標(biāo)志物的組合可以更特異地選擇HFSC細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(⑶133或⑶9)之一和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系標(biāo)志物(⑶140a，NG2)之一的結(jié)合對選擇HFSC細(xì)胞是非常有效的。基于上述信息，在這些組合中對選擇HFSC細(xì)胞最高效的標(biāo)志物組合是CD133和CD140a，但其它組合也應(yīng)該比用單一標(biāo)志物選擇更有效。
[0150]⑶133或⑶140a的出現(xiàn)頻率通常較低(小于5% )，⑶140a的出現(xiàn)比⑶133更晚(從大約第8孕周開始表達(dá)，到大約18孕周最大)。因此，取決于孕周，既表達(dá)CD133又表達(dá)CD140a的細(xì)胞非常少(小于總細(xì)胞的1% )。如果細(xì)胞來源于15孕周或更早期的人胎兒組織，大多數(shù)⑶133陽性細(xì)胞可能不表達(dá)⑶140a。由于⑶133陽性和⑶140a陰性的細(xì)胞將在更晚表達(dá)⑶140a，因此在⑶133陽性細(xì)胞最初富集后，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)HFSC細(xì)胞的相同條件下培養(yǎng)時(shí)，可獲得HFSC 細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.一種分離的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為祖細(xì)胞或干細(xì)胞， 其中所述細(xì)胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，其中所述細(xì)胞保持其在整個(gè)后續(xù)傳代中有效分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力， 其中所述細(xì)胞至少表達(dá)細(xì)胞表面抗原⑶133和⑶140 α。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的可擴(kuò)增的入神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞已在ATCC保藏，保藏號為ΡΤΑ-12291。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞來自于人胎兒神經(jīng)組織，所述神經(jīng)組織選自脊髓、大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、基底前腦、腹側(cè)中腦、藍(lán)斑核、下丘腦、小腦、胼胝體和視神經(jīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述神經(jīng)組織從8-24孕周的人脊髓分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞已在有效富集可擴(kuò)增的神經(jīng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)，所述條件包括，含有有效量的生長添加劑、兩種生長因子和一種存活因子的培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述生長添加劑為1-硫代甘油，培養(yǎng)基中生長添加劑的有效量為至少IOyM的1-硫代甘油以分離HFSC細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述兩種生長因子是血小板衍生生長因子O3DGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，存在的濃度為至少5ng/ml的TOGF和至少2.5ng/ml的bFGF以分離HFSC細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度為約40ng/ml到約200ng/ml, bFGF存在的濃度為約5ng/ml到約40ng/ml以分離HFSC細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度為約100ng/ml，bFGF存在的濃度為約20ng/ml以分離HFSC細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度至少為lng/ml，bFGF存在的濃度至少為0.5ng/ml,以在細(xì)胞系建立后擴(kuò)增HFSC細(xì)胞并維持細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF,F1DGF存在的濃度為約5ng/ml到約100ng/ml,bFGF存在的濃度為約lng/ml到約50ng/ml,以在HFSC細(xì)胞建立后使其擴(kuò)增。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的入神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度為約20ng/ml，bFGF存在的濃度為約20ng/ml，以在HFSC細(xì)胞建立后使其擴(kuò)增。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述一種存活因子為胰島素樣生長因子(IGF)，存在濃度至少為lng/ml的IGF。
14.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述一種存活因子為胰島素樣生長因子IGF，存在濃度為約5ng/ml到約100ng/ml的IGF。
15.根據(jù)權(quán)利要求5的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述一種存活因子為IGF，存在濃度為約20ng/ml的IGF。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞可以冷凍和解凍而不失去其在整個(gè)后續(xù)傳代中分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，以及其至少表達(dá)細(xì)胞表面抗原⑶133和⑶140 α的能力。
17.一種體外培養(yǎng)可擴(kuò)增的神經(jīng)細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞是分離自哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的祖細(xì)胞或干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力以及其有效分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的能力，所述方法包括: a)從人胎兒神經(jīng)組織分離和離解至少一個(gè)細(xì)胞， b)在溫度為37°C，含有1-20%O2和5% CO2的氣體環(huán)境中，化學(xué)定義的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含: -至少 5ng/ml PDGF-AA -至少 0.5ng/ml bFGF,和 -至少ΙΟμΜ的1-硫代甘油， c)從b)傳代細(xì)胞以獲得所述可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基還包含至少1.0ng/ml的IGF-1。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于所述神經(jīng)組織選自脊髓、大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、基底前腦、腹側(cè)中腦、藍(lán)斑核、下丘腦、小腦、胼胝體和視神經(jīng)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于在步驟a)，所述神經(jīng)組織來自8-24孕周的人胎兒脊髓。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于在步驟a)，通過使用熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)或免疫抗體包被篩選法中的至少一種的分離方法來進(jìn)行所述分離。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-40-200ng/ml PDGF-AA,
-5-100ng/ml bFGF, -10-100 μ Ml-硫代甘油，和 -5-100ng/ml IGF-10
23.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-約 100ng/ml PDGF-AA,
-約 20ng/ml bFGF, -約50 μ Ml-硫代甘油，和 -約 20ng/ml IGF-10
24.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-5-100ng/ml PDGF-AA,
-l-50ng/ml bFGF, -10-100 μ Ml-硫代甘油，和 -5-100ng/ml IGF-10
25.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-約 20ng/ml PDGF-AA,
-約 20ng/ml bFGF, -約50 μ Ml-硫代甘油，和-約 20ng/ml IGF-10
26.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)步驟發(fā)生在涂有聚鳥氨酸或聚賴氨酸的培養(yǎng)容器中。
27.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述化學(xué)定義的無血清培養(yǎng)基包含DMEM/F12，所述DMEM/F12添加有非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸、B27、N-乙酰半胱氨酸和β-巰基乙醇。
28.體外培養(yǎng)物，其包含從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得的至少一個(gè)分離的神經(jīng)細(xì)胞，其中所述分離的細(xì)胞浸沒在化學(xué)定義的無血清培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含:
-至少 5ng/ml 的 F1DGF-AA, -至少5ng/ml的bFGF,和 -至少10 μ M的1-硫代甘油。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的體外培養(yǎng)物，還包含至少1.0ng/ml IGF-1。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述細(xì)胞從人胎兒脊髓獲得。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述體外培養(yǎng)物在涂有聚鳥氨酸或聚賴氨酸的培養(yǎng)容器中。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述化學(xué)定義的無血清培養(yǎng)基還包含DMEM/F12，所述DMEM/F12添加有非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸、B27、N_乙酰半胱氨酸和β-巰基乙醇。`
33.根據(jù)權(quán)利要求30的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述神經(jīng)細(xì)胞為CD133陽性和CD140 α 陽性。
34.治療由髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細(xì)胞缺失而導(dǎo)致的病況的方法，包括: 給予受試者治療有效量的組合物，該組合物包含權(quán)利要求1所述的分離的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于所述病況為脫髓鞘疾病或神經(jīng)變性疾病。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其特征在于所述脫髓鞘疾病選自脊髓損傷(SCI)、多發(fā)性硬化(MS)、遺傳性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、橫貫性脊髓病/脊髓炎、漸進(jìn)多焦點(diǎn)灶性白質(zhì)腦病和其他先天性脫髓鞘疾病。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其特征在于所述神經(jīng)變性疾病選自阿爾茨海默氏病、阿爾茨海默型老年癡呆癥(SDAT)、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、局部缺血、失明和由具髓鞘神經(jīng)元損害導(dǎo)致的神經(jīng)變性疾病。
38.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其特征在于所述給藥步驟包括注射所述可擴(kuò)增的入神經(jīng)細(xì)胞到受脫髓鞘疾病或神經(jīng)變性疾病影響的神經(jīng)組織或側(cè)腦室。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其特征在于所述神經(jīng)組織選自脊髓、腦室下區(qū)、胼胝體、小腦、基底神經(jīng)節(jié)、基底核和黑質(zhì)。
40.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其特征在于所述給藥步驟包括通過選自經(jīng)子宮的胎兒腦室注射、腦室內(nèi)注射、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射、玻璃體內(nèi)注射和靜脈給藥的方法將所述可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞注射到所述受試者中。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，還包括在所述給藥步驟前分化可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞的步驟。
42.神經(jīng)干細(xì)胞藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的分離的可擴(kuò)增的人神經(jīng)細(xì)胞。
43.神經(jīng)干細(xì)胞藥物組合物，其包含可擴(kuò)增的神經(jīng)細(xì)胞，所述可擴(kuò)增的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)權(quán)利要求17的方法在體外培養(yǎng)。
44.權(quán)利要求42或43的藥物組合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細(xì)胞 缺失所導(dǎo)致的病況。
【文檔編號】C12N5/0797GK103687941SQ201280004915
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月12日
【發(fā)明者】城戶常雄 申請人:城戶常雄