專利名稱：泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白在泛素化蛋白質(zhì)的檢測和分離中的應(yīng)用的制作方法
泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白在泛素化蛋白質(zhì)的檢測和分離中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)研究及醫(yī)學(xué)診斷中的泛素化蛋白的檢測和分離。本發(fā)明具體涉及到利用含有親和標(biāo)簽(Affinity Tag)和泛素結(jié)合域(Ubiquitin-binding domain, UBD)的融合蛋白以及相類似的方法去檢測和分離泛素化蛋白。
發(fā)明背景
蛋白泛素化是生物細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號傳導(dǎo)途徑。最近的研究表明，泛素化不僅參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解，同時在膜轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白質(zhì)識別，病毒出芽，DNA復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯中起重要作用。泛素是一個具有76個氨基酸的多肽，廣泛存在于生物細(xì)胞中。泛素化是將泛素共價連接到目標(biāo)蛋白的生化過程。催化蛋白質(zhì)泛素化的復(fù)合酶體含有三種酶泛素激活酶(E1)，泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)。泛素激活酶El首先與泛素的 G76形成硫醇酯鍵；E1將泛素轉(zhuǎn)移到E2形成泛硫酯鍵；然后E3通過連接G76殘基到底物蛋白的賴氨酸殘基或其他泛素的賴氨酸殘基，將泛素從E2轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物或另一個泛素上。E3是泛素與蛋白質(zhì)底物之間的酶。
泛素化蛋白中的泛素成分作為與其他蛋白相互識別的位點(diǎn)，如蛋白體的蛋白酶， 膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)吞調(diào)控蛋白，泛素結(jié)合酶E2，DNA修復(fù)蛋白，以及去泛素化酶。這些與泛素相互作用的蛋白通常包含一個或多個泛素結(jié)合域。
由于蛋白泛素化調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞過程，分離和檢測泛素化蛋白是研究和確定這些細(xì)胞過程的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前檢測泛素化蛋白的方法通常是先將目標(biāo)蛋白用抗體免疫沉淀分離出來，然后用抗泛素抗體免疫印跡來測定泛素化。然而這一方法對蛋白質(zhì)泛素化的檢測敏感度不高，尤其是對低豐度的內(nèi)源性蛋白的泛素化檢測效果很差。而本發(fā)明用泛素結(jié)合域融合蛋白可有效地分離和測定低豐度泛素化蛋白，使泛素化測定敏感度大幅度提聞。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)對蛋白質(zhì)泛素化的檢測敏感度不高，尤其是對低豐度的內(nèi)源性蛋白的泛素化檢測效果很差的問題，本發(fā)明利用泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin-binding domains, UBDs)融合蛋白來分離泛素化的蛋白，同時用抗體免疫印跡法定量測定泛素化蛋白，有效地提聞了蛋白質(zhì)泛素化的檢測敏感度。
本發(fā)明所述泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白的構(gòu)造,包括親和標(biāo)簽(Affinity Tag)和一個泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。親和標(biāo)簽是用于親和純化融合蛋白，泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域則用于結(jié)合泛素。
親和標(biāo)簽包括(但不限于)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽，麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)標(biāo)簽，hexahistidine (His標(biāo)簽)，T7標(biāo)簽，泛素標(biāo)簽，F(xiàn)lag標(biāo)簽，Myc標(biāo)簽，HA標(biāo)簽， 聚精氨酸標(biāo)簽，polycysteine標(biāo)簽，polyphenylalanine標(biāo)簽，BTag標(biāo)簽,半乳糖結(jié)合域標(biāo)簽，纖維素結(jié)合域(CBD)標(biāo)簽，thioredoxin標(biāo)簽,金黃色葡萄球菌蛋白標(biāo)簽,鏈球菌G蛋白標(biāo)簽，鈣調(diào)蛋白標(biāo)簽，β_半乳糖苷酶標(biāo)簽，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，S-肽標(biāo)簽，生物素標(biāo)簽，advidin標(biāo)簽，streptavidin標(biāo)簽以及鏈球菌標(biāo)簽。
泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括(但不限于):Uba (泛素結(jié)合結(jié)構(gòu))，ΠΜ (泛素相互作用序列)， DUIM (雙面ΠΜ)，Μ υ (泛素互動結(jié)構(gòu)域)，(現(xiàn)，641'，皿2，皿(，詘￥，服1，似？，皿？21^，42021^， GLUE, Jabl/MPN 和 PFU。
本發(fā)明中的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白包括兩種結(jié)構(gòu)即親和標(biāo)簽位于融合蛋白 N-端UBA位于融合蛋白C-末端，以及親和標(biāo)簽位于融合蛋白的C-末端而UBA位于N-端。
本發(fā)明的融合蛋白還可以包括親和標(biāo)簽和UBA之間的一個鏈接(Linker)。鏈接可設(shè)計(jì)成能由肽序列特異性蛋白酶切割的序列。肽序列特異性蛋白酶的例子包括(但不限于): 凝血酶和TEV蛋白酶。
本發(fā)明還公開了一種檢測泛素化蛋白的方法，包括以下步驟
(I)將權(quán)利要求1所述泛素結(jié)合域融合蛋白固定到親和標(biāo)簽配體；
(2)將固定的泛素結(jié)合域融合蛋白與泛素化蛋白樣品共育；
(3)鑒別泛素化蛋白質(zhì)。
將泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域克隆到GST融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建一個GST泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白。融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后用谷胱甘肽瓊脂糖珠進(jìn)行純化。結(jié)合在谷胱甘肽瓊脂糖珠上的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白可與細(xì)胞或組織裂解液混合，結(jié)合并沉淀泛素化蛋白，從而分離和檢測特異蛋白質(zhì)的泛素化。
在GST泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白沉淀檢測法中，可通過使用大容量的細(xì)胞或組織裂解液，來增加低豐度泛素化蛋白的數(shù)量，從而提高檢測的效率。由于GST泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白可以在細(xì)菌中過量表達(dá)并可用谷胱甘肽瓊脂糖珠純化，因此GST泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域沉淀檢測法比目前的抗體免疫沉淀檢測法具有更高的檢測容量和靈敏度。此外，從經(jīng)濟(jì)效益角度相比，GST泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白檢測法的費(fèi)用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于昂貴的抗體免疫沉淀法。


圖1A和IB示例用GST-ACKlUba沉淀法來檢測泛素化的表皮生長因子受體和ACK。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例使用GST-ACKlUba的融合蛋白分離和檢測泛素化蛋白質(zhì)。
1.表達(dá)和純化GST-ACKlUba融合蛋白。
ACKl (Activated Cdc42_associated Kinasel,也稱 Tnk2)是一種非受體酪氨酸激酶，其羧基末端包含一個UBA域。將ACK1UBA域克隆到GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX4T3 (GE生命科學(xué))，獲得質(zhì)粒pGEX4T3-GST-ACKlUba。經(jīng)DNA測序證實(shí)了該融合蛋白cDNA質(zhì)粒的序列。將pGEX4T3-GST-ACKlUba轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中以用于表達(dá)融合蛋白。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌在37° C下用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)到A600 (600nm的光吸收)為1. O的密度，然后加入 1/1000IPTG (O. 5mM)去誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)3_5個小時。融合蛋白表達(dá)后的細(xì)菌則用離心機(jī) 8000rpm離心10分鐘沉淀收集。
沉淀后的細(xì)菌重 懸于細(xì)菌裂解液(40mM Tris-HCI，pH8. 0，IOOmM氯化鈉，O. 5%的TritonX-100，ImM EDTA, ImM EGTA，10微克/毫升亮肽素和抑肽酶)。每500毫升的細(xì)菌沉淀，用細(xì)菌裂解液10毫升重懸。然后加入溶菌酶(50微克/毫升)和DNase I (10微克/ 毫升)，在4° C下旋轉(zhuǎn)培育I小時。之后用超聲儀在能量水平3. 5下超聲裂解3X30秒加2 秒間隔。裂解液在4° C下15000rpm離心10分鐘，將其上清液轉(zhuǎn)移到15毫升錐形管。在上清液中加入谷胱甘肽瓊脂糖珠(200 μ L1: 1)，并在4° C下滾動培育2-3小時。瓊脂糖珠用細(xì)菌裂解液清洗3次(每次10毫升裂解液)，最終懸浮在300 μ L的細(xì)菌裂解液中以準(zhǔn)備用于沉淀檢測。取少量樣品(10μ I)用SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳分析，用考馬斯亮藍(lán)染色來確定瓊脂糖珠上的GST-ACKlUba融合蛋白含量及純度。
2. GST-ACKlUba的沉淀法分離和檢測泛素化蛋白質(zhì)。
細(xì)胞裂解液的制備在哺乳動物細(xì)胞中加入預(yù)冷的哺乳動物細(xì)胞裂解緩沖液 RIPAbuffer (40mMHEPES, pH7. 4,1% Triton X-100,0. 5% sodium deoxylcholate, O. 1% SDS,IOOmM NaCl,ImM EDTA,25mM □ beta-glycerolphosphate,ImM Na-orthovanadate, 1(^8/!^組亮肽素和抑肽酶)，在4° C下?lián)u動裂解30分鐘。將裂解后的細(xì)胞裂解液在4° C 下14，OOOrpm離心10分鐘以清除細(xì)胞殘?jiān)x心后的細(xì)胞裂解液上清則用來分離泛素化蛋白。
分離和檢測泛素蛋白細(xì)胞裂解液上清(I毫克)與GST-ACKlUba (15-20微克融合蛋白)瓊脂糖珠在4° C旋轉(zhuǎn)培育2-3小時后，瓊脂糖珠用離心沉淀并用RIPA緩沖液清洗三次，然后重懸在SDS-PAGE電泳樣品緩沖液中。GST-ACKlUba瓊脂糖珠沉淀的泛素化蛋白樣品經(jīng)8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后用抗體免疫印跡法進(jìn)行測定。
3.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
表皮生長因子受體(EGFR)和ACKl泛素檢測GST-ACKlUba的沉淀檢測，如圖1所/Jn ο
圖1A =HeLa細(xì)胞在0.1 %胎牛血清培養(yǎng)基中饑餓過夜(12小時)，在EGF刺激前30 分鐘用MG-132 (IOyM)處理細(xì)胞。加EGF刺激一定的時間后裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解液(I 毫克)和GST-ACK1UBA谷胱甘肽瓊脂糖珠(15-20微克)共育沉淀泛素化蛋白。泛素化的表皮生長因子受體(Top panel)或 ACKl (Second top panel)用抗 EGFR (1005)或抗-ACK (All)抗體進(jìn)行免疫印跡檢測。細(xì)胞裂解液中的表皮生長因子受體和ACKl則通過抗EGFR (1005)和抗-ACK (All)抗體免疫印跡法直接在細(xì)胞裂解液樣品中進(jìn)行測定(見圖中底部的兩個panels)。表皮生長因子刺激細(xì)胞10分鐘后，表皮生長因子受體及ACKl的泛素化即可檢測到(見圖)。
圖1B :將HA標(biāo)簽的NEDD4-1，NEDD4-2或空載體與Myc標(biāo)簽的ACKl在HEK-293細(xì)胞中共表達(dá)。ACKl的泛素化水平用GST-ACKlUba沉淀后用抗ACK抗體(AlI)免疫印跡檢測(Top panel)。ACKl或NEDD4表達(dá)水平則顯示在底部的兩個panels。第2膠道2微克 NEDD4-1 轉(zhuǎn)染;第 3 道，I 毫克 NEDD4-1;第 4 道，2 毫克 NEDD4-2。雖然 NEDD4-1 和 NEDD4-2 都能與ACKl結(jié)合，但對AC Kl的泛素化有顯著差異。使用GST-ACKlUba沉淀檢測，我們發(fā)現(xiàn)與NEDD4-1共同表達(dá)的ACKl的泛素化(2_4道)比與NEDD4-2共同表達(dá)的高出10倍以上。
以上幾個實(shí)例的描述是用來說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)例范圍以及實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。對于那些精于相關(guān)技能的人來說，對這些實(shí)例實(shí)驗(yàn)的修改是很容易的。所以，本發(fā)明所具有的廣泛性并不限制在具體的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，儀器和方法，以及所列舉的實(shí)例。與此相應(yīng)，本發(fā)明所包括的是申請人發(fā)明構(gòu)思的普遍 范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于泛素化蛋白質(zhì)的檢測和分離的泛素結(jié)合域融合蛋白，其特征在于，該泛素結(jié)合域融合蛋白由親和標(biāo)簽、泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；或者是由親和標(biāo)簽、泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和它們之間的鏈接構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，親和標(biāo)簽是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，麥牙糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽，His標(biāo)簽，T7標(biāo)簽，泛素標(biāo)簽，F(xiàn)lag標(biāo)簽，Myc標(biāo)簽，HA標(biāo)簽，聚精氨酸標(biāo)簽，polycysteine標(biāo)簽,polyphenylalanine標(biāo)簽,BTag標(biāo)簽,半乳糖結(jié)合域標(biāo)簽， 纖維素結(jié)合域標(biāo)簽，thioredoxin標(biāo)簽,金黃色葡萄球菌蛋白標(biāo)簽,鏈球菌G蛋白標(biāo)簽,I丐調(diào)蛋白標(biāo)簽，半乳糖苷酶標(biāo)簽，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，S-肽標(biāo)簽，生物素標(biāo)簽，advidin 標(biāo)簽，streptavidin標(biāo)簽或鏈球菌標(biāo)簽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)，泛素相互作用序列，雙面泛素相互作用序列，泛素互動結(jié)構(gòu)域，CUF, GAT, UBZ, UBC, UEV， UBM, NZF, UBPZnF, A20ZnF, GLUE, Jabl/MPN 或 PFU。
4.檢測泛素化蛋白的方法，包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1所述泛素結(jié)合域融合蛋白固定到親和標(biāo)簽配體；(2)將固定的泛素結(jié)合域融合蛋白與泛素化蛋白樣品共育；(3)鑒別泛素化蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測泛素化蛋白的方法，其特征在于，親和標(biāo)簽是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽，His標(biāo)簽，T7標(biāo)簽，泛素標(biāo)簽，F(xiàn)lag標(biāo)簽，Myc 標(biāo)簽,HA標(biāo)簽,聚精氨酸標(biāo)簽，polycysteine標(biāo)簽,polyphenylalanine標(biāo)簽,BTag標(biāo)簽,半乳糖結(jié)合域標(biāo)簽，纖維素結(jié)合域標(biāo)簽，thioredoxin標(biāo)簽,金黃色葡萄球菌蛋白標(biāo)簽,鏈球菌 G蛋白標(biāo)簽，鈣調(diào)蛋白標(biāo)簽，半乳糖苷酶標(biāo)簽，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，S-肽標(biāo)簽，生物素標(biāo)簽，advidin標(biāo)簽，streptavidin標(biāo)簽或鏈球菌標(biāo)簽。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測泛素化蛋白的方法，其特征在于所述泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)，泛素相互作用序列，雙面泛素相互作用序列，泛素互動結(jié)構(gòu)域，CUF, GAT, UBZ, UBC, UEV，UBM, NZF, UBPZnF, A20ZnF, GLUE, Jabl/MPN 或 PFU。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測泛素化蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中所述泛素化蛋白的樣品是細(xì)胞裂解液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測泛素化蛋白的方法，其特征在于步驟(3)中泛素化蛋白的測定是用抗體免疫印跡法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin-bindingdomain，UBD)融合蛋白分離和檢測泛素化蛋白的方法。其原理是用一個親和標(biāo)簽與一個泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建一個融合蛋白。該融合蛋白可在大腸桿菌中表達(dá)并通過其親和標(biāo)簽的配體進(jìn)行純化及固定在凝膠顆粒上。帶有泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白的凝膠顆粒與細(xì)胞或組織的裂解液共育，可將裂解液中的泛素化蛋白通過沉淀分離出來。本發(fā)明在檢測泛素化蛋白上比目前的抗體免疫沉淀檢測法具有更高的效率，檢測容量和靈敏度。此外，從經(jīng)濟(jì)效益角度相比，本發(fā)明檢測泛素化蛋白的費(fèi)用遠(yuǎn)低于昂貴的抗體免疫沉淀法；可應(yīng)用于蛋白泛素化的基礎(chǔ)研究及醫(yī)療診斷化驗(yàn)中的泛素化蛋白的測定。
文檔編號C12N9/38GK103059141SQ201210533058
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者林瓊 申請人:江蘇大學(xué)