專利名稱：存活蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)存活蛋白表達(dá)的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及與編碼人存活蛋白的核酸特異雜交的反義化合物，特別是雙鏈寡核苷酸。已證實(shí)這些寡核苷酸可調(diào)節(jié)存活蛋白的表達(dá)。
背景技術(shù)：
癌性細(xì)胞的特征性特點(diǎn)是失控性增殖。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腫瘤和正常細(xì)胞間的差異之一是對(duì)程序性細(xì)胞死亡，也稱作凋亡的過程的抗性(Ambrosini等人，Nat.Med.，1997，3，917-921)。凋亡是多細(xì)胞生物已經(jīng)演化了的用以阻止失控性細(xì)胞增殖和消滅那些呈病態(tài)、有害的或不再需要的細(xì)胞的過程。凋亡過程涉及多步驟級(jí)聯(lián)，在該級(jí)聯(lián)中通過蛋白水解酶和DNA內(nèi)切核酸酶的協(xié)調(diào)性作用從內(nèi)部降解細(xì)胞，導(dǎo)致隨后由清除細(xì)胞去除的凋亡小體形成。迄今研究已經(jīng)證明大部分細(xì)胞內(nèi)降解通過胱天蛋白酶的作用進(jìn)行，胱天蛋白酶是切割鄰近天冬氨酸殘基的蛋白水解酶家族(Cohen，Biochemistry Journal，1997，326，1-16)。
發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡過程表現(xiàn)抗性導(dǎo)致這樣的觀點(diǎn)，即以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抗性為目標(biāo)的治療策略代表阻止瘤細(xì)胞擴(kuò)散的新型手段(Ambrosini等人，Nat.Med.，1997，3，917-921)。據(jù)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞獲得對(duì)凋亡抗性的機(jī)制之一是過量表達(dá)存活蛋白，其是IAP(凋亡抑制物)胱天蛋白酶抑制物家族的一個(gè)新近描述的成員。迄今，在肺腫瘤、結(jié)腸腫瘤、胰腺腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、胃腫瘤、非霍奇金淋巴瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤中已經(jīng)檢測(cè)到存活蛋白的過量表達(dá)(Adida等人，Lancet，1998，351，882-883；Ambrosini等人，Nat.Med.，1997，3，917-921；Lu等人，Cancer Res.1998，58，1808-1812)。已經(jīng)在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中進(jìn)行了更為詳細(xì)的分析，其中發(fā)現(xiàn)存活蛋白的過量表達(dá)同已知與不良預(yù)后相關(guān)的腫瘤組織學(xué)是相互分開的(Adida等人，Lancet，1998，351，882-883)。最后，Ambrosini等人描述了用包含編碼效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1(EPR-1)的人cDNA 708核苷酸片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，所述受體的編碼序列與存活蛋白的編碼鏈互補(bǔ)(Ambrosini等人，J.Bio.Chem.，1998，273，11177-11182)。該構(gòu)建體引起細(xì)胞活力的下降。
最近發(fā)現(xiàn)存活蛋白在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。已發(fā)現(xiàn)該蛋白在細(xì)胞周期的G2/M期中以受周期調(diào)節(jié)的方式表達(dá)，并與有絲分裂紡錘體的微管結(jié)合。在有絲分裂期間，破壞這種相互作用導(dǎo)致存活蛋白抗凋亡功能的喪失并且增強(qiáng)了有絲分裂期間胱天蛋白酶3的活性。胱天蛋白酶3與凋亡性細(xì)胞死亡相關(guān)。因此認(rèn)為存活蛋白可抵消G2/M期中對(duì)凋亡的默認(rèn)誘導(dǎo)。因此認(rèn)為在癌中過量表達(dá)存活蛋白可能克服這個(gè)凋亡檢查點(diǎn)，聽任不受歡迎的癌細(xì)胞幸存和分裂。發(fā)現(xiàn)上述Ambrosini所描述的存活蛋白反義構(gòu)建體可下調(diào)Hela細(xì)胞中內(nèi)源性存活蛋白同時(shí)提高G2/M期細(xì)胞的胱天蛋白酶3依賴性凋亡，Li等人，Nature，1998，396，580-584。
在許多物種中，導(dǎo)入雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)強(qiáng)烈而特異性的基因沉默。這種現(xiàn)象在植物和動(dòng)物中均存在，并且在病毒防御和轉(zhuǎn)座子沉默機(jī)制中發(fā)揮作用(Jorgensen等人，Plant Mol.Biol.，1996，31，957-973；Napoli等人，Plant Cell，1990，2，279-289)。
dsRNA能導(dǎo)致動(dòng)物中基因沉默的第一份證據(jù)來自在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中的工作成果，其中已經(jīng)證明飼喂、浸浴或注射dsRNA(有義鏈和反義鏈的混合物)得到了比單獨(dú)注射有義鏈或反義鏈時(shí)效率高得多的沉默(Guo和Kemphues，Cell，1995，81，611-620；Fire等人，Nature 391806-811(1998)；Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9515502-15507(1998)；PCT國(guó)際公開WO99/32619；(Fire等人，Nature，1998，391，806-810；Timmons等人，Gene，2001，263，103-112；Timmons和Fire，Nature，1998，395，854)。從那以后，已在多種生物中證實(shí)了這種現(xiàn)象，所述生物包括黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(Kennerdell等人，Cell 951017-1026(1998))；和胚胎小鼠(Wianny等人，Nat.Cell Biol.270-75(2000))。
已將這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象稱為“RNA干擾(RNAi)”，并且該現(xiàn)象已開始泛指涉及dsRNA的基因沉默過程，該過程通過降解靶mRNA導(dǎo)致基因表達(dá)的序列特異性降低(Tuschl等人，Genes Dev.，1999，13，3191-3197)。
已證實(shí)具有3’突出端的21個(gè)和22個(gè)核苷酸的dsRNA片段是RNAi的經(jīng)典序列特異性中介體。這些叫做短干擾性RNA(siRNA)的片段由較長(zhǎng)dsRNA通過類RNA酶III加工反應(yīng)生成。經(jīng)化學(xué)合成的siRNA也能在位于接近siRNA引導(dǎo)鏈覆蓋區(qū)域的中心的切割位點(diǎn)介導(dǎo)高效靶RNA切割(Elbashir等人，Nature，2001，411，494-498)。已經(jīng)在包括人胚胎腎(293)和HeLa細(xì)胞的幾個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中研究了由21-23個(gè)核苷酸的siRNA引起內(nèi)源性和異源性基因表達(dá)抑制的表征(Elbashir等人，Genesand Development，2001，15，188-200)。
近來，已證實(shí)反義極性的單鏈RNA寡聚體(ssRNAi或asRNA)是基因沉默的強(qiáng)烈誘導(dǎo)物，并且單鏈寡聚體是RNAi現(xiàn)象的最終原因(Tiisterman等人，Science，2002，295，694-697)。
此處每一個(gè)引用作為參考的美國(guó)專利5,898,031和6,107,094描述了某些具有類RNA性質(zhì)的寡核苷酸。當(dāng)與RNA雜交時(shí)，這些寡核苷酸作為dsRNA酶底物并因此導(dǎo)致酶對(duì)RNA的切割(Crooke，2000；Crooke，1999)。
作為對(duì)調(diào)亡以及認(rèn)為存活蛋白表達(dá)對(duì)種類繁多的腫瘤細(xì)胞類型提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)中所發(fā)揮作用的理解的發(fā)展結(jié)果，迫切需要提供可調(diào)節(jié)存活蛋白表達(dá)的組合物。迫切需要提供在動(dòng)物中診斷和檢測(cè)編碼存活蛋白的核酸的方法。也需要提供診斷和治療源于存活蛋白表達(dá)的疾病的方法。而且，需要檢測(cè)和研究編碼存活蛋白的核酸的改進(jìn)了的研究試劑盒和試劑。因此，本發(fā)明提供一類新型存活蛋白抑制物、包含這些化合物的組合物和使用這些化合物的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及寡聚化合物，特別是單鏈和雙鏈反義化合物，這些化合物靶向編碼存活蛋白的核酸并且調(diào)節(jié)存活蛋白的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，反義化合物為寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸是RNAi寡核苷酸(其主要為RNA或類RNA)。在其它實(shí)施方案中，寡核苷酸為RNA酶H寡核苷酸(其主要為DNA或類DNA)。在另外的實(shí)施方案中，寡核苷酸可經(jīng)化學(xué)修飾。也提供包含本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和其它組合物。進(jìn)一步提供調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織中存活蛋白表達(dá)的方法，該方法包括將所述細(xì)胞或組織與一種或多種本發(fā)明的反義化合物或組合物接觸。進(jìn)一步通過施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的寡核苷酸或組合物，對(duì)患有或者傾向于患有與存活蛋白表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥的動(dòng)物，特別是人提供治療的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的化合物在制造用于治療此處所公開的任何和全部疾病的藥物的用途。
疾病或病癥可能為增殖過度性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，增殖過度性疾病為癌。
本發(fā)明的寡聚化合物是存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)的抑制物。因?yàn)檫@些化合物抑制了存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)的效果，所以這些化合物對(duì)與存活蛋白活性相關(guān)的紊亂的治療有用。因此，本發(fā)明的化合物是抗腫瘤劑。
認(rèn)為本化合物對(duì)治療癌有用，所述癌為例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤、室管膜和脈絡(luò)叢腫瘤、松果體腫瘤、神經(jīng)元腫瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、施旺細(xì)胞瘤、腦膜瘤、腦膜性肉瘤；眼腫瘤基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、橫紋肌肉瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；內(nèi)分泌腺腫瘤垂體腫瘤、甲狀腺腫瘤、腎上腺皮質(zhì)腫瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤、胃腸胰內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤、生殖腺腫瘤；頭和頸腫瘤頭頸癌、口腔、咽、喉、生牙性腫瘤；胸部腫瘤大細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胸腔腫瘤、惡性間皮瘤、胸腺瘤、胸原發(fā)生殖細(xì)胞腫瘤；消化道腫瘤食道腫瘤、胃腫瘤、肝腫瘤、膽囊腫瘤、外分泌胰腺腫瘤、小腸腫瘤、不同型闌尾和腹膜腫瘤、結(jié)腸和直腸腺瘤、肛門腫瘤；泌尿生殖道腫瘤腎細(xì)胞癌、腎盂和輸尿管腫瘤、膀胱腫瘤、尿道腫瘤、前列腺腫瘤、陰莖腫瘤、睪丸腫瘤；女性生殖器官腫瘤外陰和陰道腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮本體腺癌、卵巢癌、婦科學(xué)肉瘤、乳腺腫瘤；皮膚腫瘤基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、皮膚纖維肉瘤、梅克爾細(xì)胞腫瘤、惡性黑素瘤；骨和軟組織腫瘤成骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、尤文肉瘤、原始神經(jīng)外胚層瘤、血管肉瘤；造血系統(tǒng)腫瘤骨髓增生異常綜合征、急性粒細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、HTLV-1和T細(xì)胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多毛細(xì)胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、肥大細(xì)胞白血?。缓蛢和[瘤急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、骨腫瘤、橫紋肌肉瘤、淋巴瘤、腎腫瘤。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療敏感腫瘤的方法，該方法包括對(duì)動(dòng)物，尤其人施用針對(duì)存活蛋白的有效量的單鏈(ssRNA或ssRNAi或asRNA)或雙鏈(dsRNA或siRNA)寡核苷酸。ssRNA或dsRNA寡核苷酸可經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾。也即，本發(fā)明提供靶向存活蛋白的雙鏈RNA寡核苷酸，或其藥物組合物，用于治療敏感腫瘤。
另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)分離的雙鏈RNA寡核苷酸的化合物在制造抑制存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)的藥物中的用途。因此，本發(fā)明提靶向存活蛋白的經(jīng)分離的雙鏈RNA寡核苷酸在制造由上述方法治療敏感腫瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明的化合物尤其對(duì)胰癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、卵巢癌、腎癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤的治療有用。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療患有以凋亡減少為特征的疾病或病癥的動(dòng)物，尤其是人的方法，該方法包括對(duì)患者施用靶向編碼人存活蛋白核酸分子、長(zhǎng)度為8-80個(gè)核堿基的反義化合物的治療有效量，從而抑制存活蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)細(xì)胞中凋亡的方法，該方法包括以靶向編碼人存活蛋白的核酸分子、長(zhǎng)度為8-80個(gè)核堿基的反義化合物接觸細(xì)胞從而調(diào)節(jié)凋亡。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是調(diào)節(jié)細(xì)胞中胞質(zhì)分裂的方法，該方法包括以靶向編碼人存活蛋白核酸分子、長(zhǎng)度為8-80個(gè)核堿基的反義化合物接觸細(xì)胞從而調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂。
本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)細(xì)胞中細(xì)胞周期的方法，該方法包括將靶向編碼人存活蛋白核酸分子、長(zhǎng)度為8-80個(gè)核堿基的反義化合物接觸細(xì)胞從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。
在發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，提供抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將靶向編碼人存活蛋白核酸分子、長(zhǎng)度為8-80個(gè)核堿基的反義化合物的有效量接觸細(xì)胞，從而抑制細(xì)胞增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為癌細(xì)胞。該方法進(jìn)一步包括向患者施用化學(xué)治療劑。
在發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供調(diào)節(jié)過多增殖的細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括以有效量的靶向編碼人存活蛋白核酸分子、長(zhǎng)度為8-80個(gè)核堿基的反義化合物接觸細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為過多增殖的細(xì)胞并且用反義化合物增強(qiáng)凋亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凋亡的調(diào)節(jié)對(duì)凋亡性刺激敏感。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)亡性刺激是細(xì)胞毒性化學(xué)治療劑。該方法可進(jìn)一步包括以化學(xué)治療劑接觸細(xì)胞。
發(fā)明詳述本發(fā)明運(yùn)用雙鏈和單鏈寡聚反義化合物，特別是為RNA或類RNA的單鏈或雙鏈寡核苷酸和為DNA或類DNA的單鏈寡核苷酸，用于調(diào)節(jié)編碼存活蛋白的核酸分子的功能，最終調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的存活蛋白的量。這通過提供與一種或多種編碼存活蛋白的核酸特異雜交的反義化合物而實(shí)現(xiàn)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“靶核酸”和“編碼存活蛋白的核酸”包括編碼存活蛋白的DNA、轉(zhuǎn)錄自該DNA的RNA(包括前mRNA和mRNA或其部分)，并且也包括源于該RNA的cDNA。寡聚化合物與互補(bǔ)的有義方向的靶核酸的特異雜交干擾了靶核酸的正常功能。這種與靶核酸特異雜交的化合物對(duì)靶核酸功能的調(diào)節(jié)通常稱為“反義”，同時(shí)這種化合物可描述為處于相對(duì)于靶標(biāo)的“反義方向”。
欲干擾的DNA的功能包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。欲干擾的RNA功能包括，例如RNA至蛋白翻譯位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)、由RNA至蛋白質(zhì)的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA的RNA剪接，以及RNA參與或協(xié)助的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總體效果是在RNA和/或蛋白質(zhì)水平調(diào)節(jié)存活蛋白的表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，“調(diào)節(jié)”意為表達(dá)的提高(刺激)或降低(抑制)。在本發(fā)明上下文中，抑制是基因表達(dá)調(diào)節(jié)的所希望的形式，并且RNA以及在某些實(shí)施方案中mRNA是合適的靶標(biāo)。
反義靶向特定核酸是合適的。在本發(fā)明的上下文中，將反義化合物“靶向”特定核酸是多步驟過程。該過程通常始于鑒定將調(diào)節(jié)其功能的核酸序列。這個(gè)核酸可能是，例如細(xì)胞的基因(或自該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，其表達(dá)與特定的紊亂或疾病狀態(tài)相關(guān)，或?yàn)樵从诟腥疚锏暮怂岱肿?。在本發(fā)明中，靶標(biāo)是編碼存活蛋白的核酸分子。靶向過程也包括在這個(gè)基因中確定一個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)以便發(fā)生反義相互作用，這樣將導(dǎo)致所希望的效應(yīng)，例如，mRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)或調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的上下文中，一個(gè)基因內(nèi)位點(diǎn)是包含基因可讀框(ORF)翻譯起始或終止密碼子的區(qū)域。如本領(lǐng)域公知，翻譯起始密碼子一般為5′AUG(在已轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；相應(yīng)DNA分子中的5’ATG)，因此翻譯起始密碼子也稱作“AUG密碼子”、“起始密碼子”或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有帶有RNA序列的5’GUG、5’UUG和5’CUG的翻譯起始密碼子，而已證實(shí)翻譯起始密碼子5’AUA、5’ACG和5’CUG可在體內(nèi)發(fā)揮作用。因此，即便在每種情況中起始氨基酸一般地為甲硫氨酸(真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(原核生物中)，術(shù)語(yǔ)“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包含眾多密碼子序列。本領(lǐng)域還公知真核和原核基因可具有兩種或兩種以上的備選起始密碼子，其中任何一種可在特定細(xì)胞類型或組織，或在一組特定條件下優(yōu)先地用于翻譯起始。在本發(fā)明的上下文中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”指用于體內(nèi)(in vivo)啟動(dòng)編碼存活蛋白的基因所轉(zhuǎn)錄mRNA分子的翻譯的一種或多種密碼子，而不考慮這種密碼子的序列。
同樣為本領(lǐng)域公知，基因的翻譯終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三種序列之一，即，5′-UAA、5′-UAG或5′-UGA(對(duì)應(yīng)的DNA序列分別為5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)。術(shù)語(yǔ)“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”指mRNA或基因一部分，該部分包含在翻譯起始密碼子的任一方向(即5’或3’)上約25至約50個(gè)連續(xù)核苷酸。類似地，術(shù)語(yǔ)“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”指mRNA或基因的一部分，該部分包含從翻譯終止密碼子的任一方向(即5’或3’)上約25至約50個(gè)連續(xù)的核苷酸。
可讀框(ORF)或“編碼區(qū)”在本領(lǐng)域公知指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，也是可有效地靶向的區(qū)域。其他的靶區(qū)域包括5′非翻譯區(qū)(5′UTR)，該區(qū)域在本領(lǐng)域公知指從翻譯起始密碼子5’方向上mRNA的一部分，并且因此包括mRNA的5’帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸或基因中的對(duì)應(yīng)核苷酸，和3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，該區(qū)域在本領(lǐng)域公知指從翻譯終止密碼子3’方向上mRNA的一部分，并且因此包括mRNA的翻譯終止密碼子和3’端之間的核苷酸或基因中的對(duì)應(yīng)核苷酸。mRNA的5’帽包含通過5’-5’三磷酸酯鍵與mRNA的5’最末端殘基結(jié)合的N7甲基化鳥苷殘基。認(rèn)為mRNA的5’帽區(qū)域包括5’帽結(jié)構(gòu)本身以及相鄰該帽的前50個(gè)核苷酸。5’帽區(qū)域也可是有效的靶區(qū)域。
雖然可將某些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物直接翻譯，但是許多真核轉(zhuǎn)錄物包含一個(gè)或多個(gè)稱作“內(nèi)含子”的區(qū)域，這些區(qū)域在轉(zhuǎn)錄物翻譯之前從轉(zhuǎn)錄物切除。將剩余(并且因此為翻譯的)區(qū)域稱作“外顯子”并且外顯子經(jīng)剪接在一起形成連續(xù)mRNA序列。mRNA剪接位點(diǎn)，即內(nèi)含子-外顯子接點(diǎn)也可以是靶區(qū)域，并且在異常剪接與疾病有關(guān)，或特定mRNA剪接產(chǎn)物的過量產(chǎn)生與疾病有關(guān)的情況中特別有用。
一旦鑒定了一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)，即可選擇反義寡聚化合物，通常為反義寡核苷酸，所述反義寡聚化合物與靶標(biāo)足夠互補(bǔ)，即足夠好的雜交并具有足夠的特異性，以產(chǎn)生所希望的效果。
在本發(fā)明的上下文中，“雜交”意為氫鍵，其可為在互補(bǔ)的核苷或核苷酸堿基之間Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過形成氫鍵形成配對(duì)的互補(bǔ)核堿基。如此處所用，“互補(bǔ)”指兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果在寡核苷酸某個(gè)位置的核苷酸能與DNA或RNA分子的相同位置的核苷酸形成氫鍵，那么認(rèn)為所述寡核苷酸和該DNA或RNA在那個(gè)位置彼此互補(bǔ)。當(dāng)每個(gè)分子中足夠數(shù)目的對(duì)應(yīng)位置為彼此成氫鍵的核苷酸占據(jù)時(shí)，該核苷酸與該DNA或RNA彼此互補(bǔ)。因此，“可特異雜交的”和“互補(bǔ)的”是用來表示互補(bǔ)或精確配對(duì)至足夠的程度以至于寡核苷酸與DNA或RNA靶標(biāo)之間發(fā)生穩(wěn)定和特異結(jié)合的術(shù)語(yǔ)。本領(lǐng)域理解，反義化合物的序列無需與可特異雜交的靶核酸序列100％互補(bǔ)。當(dāng)反義化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾了靶DNA或RNA的正常功能，導(dǎo)致完全或部分功能喪失，并且在希望特異結(jié)合的條件下，即在治療性處理中的生理?xiàng)l件，或?qū)嵤w外或體內(nèi)測(cè)定的條件下，具有足夠程度的互補(bǔ)性以避免反義化合物與非靶序列結(jié)合時(shí)，反義化合物為可特異雜交的。而且，寡核苷酸可與一個(gè)或多個(gè)片段雜交，從而檢查片段之間或鄰近片段(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))不參與雜交事件。本發(fā)明的化合物包含與這些化合物靶向的靶核酸序列的靶區(qū)域的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或至少100％的序列互補(bǔ)性。例如，如果反義化合物的20個(gè)核堿基中的18個(gè)與靶區(qū)域互補(bǔ)并且因此將特異雜交，那么該反義化合物代表90％的互補(bǔ)性。在這個(gè)實(shí)例中，其余非互補(bǔ)的核堿基將聚集或散布在互補(bǔ)的核堿基內(nèi)，并且彼此間或與互補(bǔ)的核堿基間無需連續(xù)。同樣地，如果一種反義化合物長(zhǎng)度為18個(gè)核堿基，具有4(四)個(gè)非互補(bǔ)核堿基，該非互補(bǔ)核堿基的兩側(cè)有與靶核酸完全互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，那么該反義化合物將與靶核酸具有77.8％的總體互補(bǔ)性，并且將因此落入本發(fā)明的范圍。
反義化合物與靶核酸區(qū)域的互補(bǔ)百分率可常規(guī)地用本領(lǐng)域公知的BLAST程序(基本局部比對(duì)搜索工具)和Power BALST程序確定(Altschul等人，J Mol.Biol.，1990，215，403-410；Zhang和Madden，Gnome Res.，1997，7，649-656)?？赏ㄟ^例如，Gap程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Unix版本8，Genetics Computer Group，University ResearchPark，Madison WI)使用默認(rèn)設(shè)置確定同源百分率、序列同一性或互補(bǔ)性，該程序采用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約50％至60％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60％至約70％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70％至約80％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80％至約90％。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90％、約92％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％。
通常將反義化合物用作研究試劑和診斷試劑。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)常使用能夠以極強(qiáng)特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸闡明特定基因的功能。也使用反義化合物，例如，區(qū)分生物學(xué)途徑的多種成員之間的功能。因此反義調(diào)節(jié)已經(jīng)用于研究用途。
存在多種機(jī)制，通過這些機(jī)制可以用合成的短寡核苷酸調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)。通常使用的反義機(jī)制是靶定RNA的依賴RNA酶H的降解。RNA酶H是廣泛表達(dá)的內(nèi)切核酸酶，其識(shí)別反義DNA-RNA異源雙鏈體，水解RNA鏈。另一反義機(jī)制涉及使用催化切割RNA-RNA雙鏈體的酶。這些反應(yīng)由一類RNA酶催化，所述RNA酶包括但是不限于RNA酶III和RNA酶L。已知為RNA干擾(RNAi)的反義機(jī)制作用于RNA-RNA雜合體等等。
基于RNA酶H的反義(通常使用單鏈化合物)和RNA干擾(通常使用稱作siRNA的雙鏈化合物)均為反義機(jī)制，一般導(dǎo)致靶RNA功能的喪失。
就效力、最大效果、特異性和作用的持續(xù)時(shí)間而言，經(jīng)優(yōu)化的siRNA和依賴RNA酶H的寡聚化合物表現(xiàn)相似。而且，已經(jīng)證實(shí)通常dsRNA構(gòu)建體的活性與靶向同一個(gè)位點(diǎn)的依賴RNA酶H的單鏈反義化合物的活性相關(guān)。一個(gè)主要例外是依賴RNA酶H的反義化合物通常對(duì)前mRNA中的靶位點(diǎn)有活性，而siRNA對(duì)這些位點(diǎn)無活性。
這些數(shù)據(jù)表明，通常，在靶RNA上對(duì)依賴RNA酶H的寡核苷酸無活性的位點(diǎn)類似地對(duì)siRNA也非好的位點(diǎn)。反之，發(fā)現(xiàn)了活性RNA酶H寡核苷酸和siRNA之間顯著程度的相關(guān)性，提示若位點(diǎn)可用于與RNA酶H的寡核苷酸雜交，則該位點(diǎn)同樣可用于siRNA復(fù)合體的雜交和切割可獲得。因此，一旦已經(jīng)通過兩種反義方法之一確定合適的靶位點(diǎn)，即可使用這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)備選反義機(jī)制發(fā)揮作用的構(gòu)建體(Vickers等人，2003，J.Biol.Chem.278，7108)。而且，一旦證實(shí)某位點(diǎn)對(duì)RNAi或RNA酶H寡核苷酸為活性，即可設(shè)計(jì)單鏈RNAi寡核苷酸(ssRNA或asRNA)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，雙鏈反義寡核苷酸是合適的。這些雙鏈反義寡核苷酸可能是RNA或類RNA，并且可經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾，因?yàn)樗龉押塑账?，若以?jīng)修飾，則保留形成RNARNA雜合體并且募集和(激活)dsRNA酶的性質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸(ssRNAi或asRNA)可為類RNA。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，單鏈反義寡核苷酸是合適的。在一些實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸可為“類DNA”，因?yàn)楣押塑账峋哂谐浞直碚鞯慕Y(jié)構(gòu)特征，例如，許多未經(jīng)修飾的2’Hs或穩(wěn)定化的主鏈，例如硫代磷酸酯，該主鏈在結(jié)構(gòu)上適合與靶寡核苷酸相互作用和募集和(激活)RNA酶H。
寡核苷酸是反義化合物的一種形式，而本發(fā)明涵蓋其它寡聚反義化合物，包括但不限于如下描述的寡核苷酸模擬物。根據(jù)本發(fā)明的化合物可包含約8至約80個(gè)核堿基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為約10至50個(gè)核苷酸。在再一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為12至30個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為12至24個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為19至23個(gè)核苷酸。一些實(shí)施方案包含抑制存活蛋白表達(dá)的寡聚化合物序列的至少8個(gè)核堿基部分。針對(duì)存活蛋白的dsRNA或siRNA分子，及它們?cè)谝种拼婊畹鞍譵RNA表達(dá)中的用途也是本發(fā)明范圍內(nèi)的實(shí)施方案。
本發(fā)明的寡核苷酸也包括變體，該變體中在寡核苷酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置存在不同堿基例如，假設(shè)第一個(gè)堿基是腺苷，可以產(chǎn)生在此位置上含有胸腺嘧啶核苷(或若是RNA，則為尿苷)、尿苷或胞苷的變體。這可以在寡核苷酸的任意位置進(jìn)行。因此，一個(gè)20聚體可包含60種變體(20個(gè)位置×每個(gè)位置3種選擇)，在變體中所選擇的三種備選核苷酸的任何一種均可替代原始核苷酸。然后用此處所述方法測(cè)試了這些寡核苷酸以測(cè)定它們抑制存活蛋白mRNA表達(dá)的能力。
寡聚化合物在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“寡聚化合物”指能與核酸分子的區(qū)域雜交的聚合結(jié)構(gòu)。該術(shù)語(yǔ)包括寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸類似物、寡核苷酸模擬物和這些物質(zhì)的嵌合組合。寡聚化合物通?？删€性地制備但是可連接或亦可制備呈環(huán)狀，并且也可包含分支。寡聚化合物可包含諸如雙鏈構(gòu)建體，例如，經(jīng)雜交以形成雙鏈化合物的兩條鏈，或具有足夠自身互補(bǔ)性以容許雜交并且形成部分或完全雙鏈化合物的單鏈。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈反義化合物包括短干擾RNA(siRNA)。如此處所用，將術(shù)語(yǔ)“siRNA”定義為一種雙鏈化合物，該化合物具有第一和第二鏈，并且包含所述第一鏈和第二鏈之間的中央互補(bǔ)部分和所述第一鏈和第二鏈之間或靶mRNA任選互補(bǔ)的末端部分。每條鏈長(zhǎng)度可為約8至約80個(gè)核堿基，長(zhǎng)度可為10至50個(gè)核堿基，長(zhǎng)度可為12至30個(gè)核堿基，長(zhǎng)度可為12至24個(gè)核堿基或長(zhǎng)度可為19至23個(gè)核堿基。中央互補(bǔ)部分長(zhǎng)度可為約8至約80個(gè)核堿基，長(zhǎng)度可為10至50個(gè)核堿基，長(zhǎng)度可為12至30個(gè)核堿基，長(zhǎng)度可為12至24個(gè)核堿基或長(zhǎng)度可為19至23個(gè)核堿基。末端部分長(zhǎng)度可為1至6個(gè)核堿基。siRNA也可無末端部分。siRNA的兩條鏈可內(nèi)部連接，留下自由3’或5’末端或兩條鏈連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端包含突出端，產(chǎn)生延伸單鏈的特征。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈反義化合物是規(guī)范siRNA，如此處所用，將術(shù)語(yǔ)“規(guī)范siRNA”定義為一種雙鏈寡聚化合物，該寡聚化合物具有第一和第二鏈，每條鏈長(zhǎng)度為21個(gè)核堿基，以及兩條鏈在19個(gè)核堿基上互補(bǔ)，并且在每條鏈每個(gè)3’末端上具有在雙鏈化合物中充當(dāng)3’突出端的脫氧胸腺嘧啶核苷二聚體(dTdT)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈反義化合物為平端siRNA。如此處所用，將術(shù)語(yǔ)“平端siRNA”定義為無末尾突出端的siRNA。即，雙鏈化合物的至少一個(gè)末端是平端。無論是規(guī)范的或平端siRNA均引發(fā)dsRNA酶，并且啟動(dòng)RNAi反義機(jī)制的募集和激活。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，設(shè)想通過RNAi反義機(jī)制作用的單鏈RNAi(ssRNA)化合物。
對(duì)雙鏈化合物進(jìn)行了進(jìn)一步修飾，并且所述修飾可包括附著在一個(gè)末端、所選的核堿基位置、糖位置或核苷間鍵的綴合基團(tuán)?；蛘撸ㄟ^非核酸的部分或連接體基團(tuán)將兩條鏈連接起來。當(dāng)由僅一條鏈形成時(shí)，dsRNA可采用自身對(duì)折以形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式。因此，dsRNA可為完全或部分的雙鏈。當(dāng)由兩條鏈或一條采取自身對(duì)折以形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式形成時(shí)，這兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū)域)為按Watson-Crick方式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。
通常寡聚化合物包含與連接基連接的單體亞單位主鏈，主鏈中每個(gè)連接的單體亞單位直接或間接地附著于雜環(huán)堿基部分。寡聚化合物也可包含未與雜環(huán)堿基部分連接的單體亞單位，從而提供了脫堿基位點(diǎn)?？梢孕揎椊M成寡聚化合物重復(fù)單位的任一個(gè)以產(chǎn)生多種基序，包括半體(hemimer)、缺口(gapmer)聚體和嵌合體。
本領(lǐng)域公知，核苷包含附著于雜環(huán)堿基部分的糖部分。兩類最常見雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是還包括共價(jià)連接于核苷的糖部分的磷酸酯基團(tuán)的核苷。對(duì)那些包含了呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸酯基可連接在糖的2’、3’、5’羥基部分，產(chǎn)生更為常見的3’-5’核苷間鍵或不太常見的2’-5’核苷間鍵。在形成寡核苷酸時(shí)，磷酸酯基共價(jià)連接于相鄰核苷的糖部分。通過雜交或通過形成共價(jià)鍵，各自末端可連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。此外，線性化合物可具有核堿基間互補(bǔ)性，并且因此以如此方式折疊以產(chǎn)生完全或部分雙鏈的化合物。在寡核苷酸中，磷酸酯基通常指為形成核苷間鍵或與糖環(huán)連接共同形成寡核苷酸的主鏈。構(gòu)成RNA和DNA主鏈的正常核苷間鍵是3’-5’磷酸二酯鍵。然而，通常希望開放線性結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚體或聚合物。該術(shù)語(yǔ)包括由天然存在的核堿基、糖和共價(jià)核苷間鍵組成的寡核苷酸，以及具有以類似方式行使功能的一個(gè)或多個(gè)非天然存在部分的寡核苷酸類似物或經(jīng)化學(xué)修飾的寡核苷酸。經(jīng)如此修飾或經(jīng)如此取代的寡核苷酸因其所希望的性質(zhì)，例如，增強(qiáng)的細(xì)胞攝入、對(duì)核酸靶標(biāo)的增強(qiáng)的親和性和增強(qiáng)的核酸酶穩(wěn)定性而較其天然存在形式更為適合。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷”指通過不具有磷原子的核苷間鍵連接的核苷序列。該類型的核苷間鍵包括短鏈烷基、環(huán)烷基、混合的雜原子烷基、混合的雜原子環(huán)烷基、一種或多種短鏈雜原子連接體和一種或多種短鏈雜環(huán)連接體。這些核苷間鍵包括但不限于硅氧烷、硫醚、亞砜、砜、乙酰基、甲?；⒘虼柞；喖谆柞；?、硫代甲?；⑾?、氨基磺酸酯、亞甲基亞氨基、亞甲基肼基、磺酸酯、氨磺酰、酰胺及其它具有混合了N、O、S和CH2組成部分的核苷間鍵。
教導(dǎo)制備以上寡核苷的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，U.S.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，此處每個(gè)專利引用作為參考。
進(jìn)一步包含于本發(fā)明的是反義寡聚化合物，其包括反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、備選剪接子(splicer)和與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。同樣地，這些反義寡聚化合物可以單鏈的、雙鏈的、環(huán)狀或發(fā)夾狀的寡聚化合物形式導(dǎo)入，并且可含有結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部的或末端的凸起、錯(cuò)配或環(huán)。一般，可將核酸(包括寡核苷酸)描述為“類DNA”(即具有2’脫氧糖并且一般含有T而不是U)或“類RNA”(即具有2’羥基或2’修飾糖，一般為U而不是T)。一旦導(dǎo)入系統(tǒng)，本發(fā)明的寡聚化合物能引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的修飾。
根據(jù)本發(fā)明的寡聚化合物可包含約8至約80個(gè)核堿基(即約8至約80個(gè)連接的核堿基和/或單體亞單位)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解本發(fā)明體現(xiàn)了長(zhǎng)度為8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79或80個(gè)核堿基的寡聚化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的寡聚化合物長(zhǎng)度為10至50個(gè)核堿基。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解這體現(xiàn)了長(zhǎng)度為12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或50個(gè)核堿基的寡聚化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物長(zhǎng)度為12至30個(gè)核堿基。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解這體現(xiàn)了長(zhǎng)度為12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個(gè)核堿基的寡聚化合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物長(zhǎng)度為12至24個(gè)核堿基。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解這體現(xiàn)了長(zhǎng)度為12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24個(gè)核堿基的寡聚化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物長(zhǎng)度為19至23個(gè)核堿基。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解這體現(xiàn)了長(zhǎng)度為19，20，21，22或23個(gè)核堿基的寡聚化合物。
寡聚化合物的一個(gè)具體長(zhǎng)度為約12至約30個(gè)核堿基。另一個(gè)具體的長(zhǎng)度為約12至約24個(gè)核堿基。一個(gè)特別適合的長(zhǎng)度是約19至約23個(gè)核堿基。
嵌合寡聚化合物不必統(tǒng)一修飾寡聚化合物中的所有位置，并且實(shí)際上可在單個(gè)寡聚化合物中或甚至在單個(gè)單體亞單位，比如寡聚化合物的核苷中摻入不止一種前面提到的修飾。本發(fā)明還包括作為嵌合寡聚化合物的寡聚化合物。在本發(fā)明上下文中，“嵌合”寡聚化合物或“嵌合體”是寡聚化合物，該化合物包含兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)上不同的區(qū)域，每一個(gè)區(qū)域由至少一個(gè)單體單位構(gòu)成，即對(duì)于基于核酸的寡聚體為核苷酸。
嵌合寡聚化合物一般包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的區(qū)域，從而賦予增強(qiáng)的核酸酶降解抗性、增強(qiáng)的細(xì)胞攝入、電荷的改變和/或?qū)Π泻怂嵩黾拥慕Y(jié)合親合力。寡聚化合物額外的區(qū)域可作為能切割RNA:DNA或RNA:RNA雜合體的酶的底物。例如，RNA酶H是細(xì)胞的內(nèi)切核酸酶，其切割RNA:DNA雙鏈體中的RNA鏈。因此，激活RNA酶H導(dǎo)致切割RNA靶，從而大大增強(qiáng)抑止基因表達(dá)的效率。因此，與例如與相同靶區(qū)域雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸比較，當(dāng)使用嵌合體時(shí)，用較短的寡聚化合物經(jīng)常可獲得相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果?？捎媚z電泳以及根據(jù)需要，本領(lǐng)域公知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)常規(guī)地檢測(cè)RNA靶的切割。對(duì)形成RNA:RNA雜合體并且作為dsRNA酶底物的嵌合體做了類似的觀察。
本發(fā)明的嵌合寡聚化合物可形成如上所述兩種或兩種以上的寡核苷酸、寡核苷酸類似物、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。常規(guī)使用的嵌合化合物包括但不限于雜合體、半體、缺口體、倒置的缺口體和阻滯體(blockmer)，其中多種點(diǎn)修飾和/或區(qū)域選自天然的或經(jīng)修飾的DNA和RNA型單位和/或模擬類型亞單位例如，鎖定核酸(LNA)(包括如下描述的ENATM)、肽核酸、嗎啉代等。在下文描述這些化合物。教導(dǎo)制備以上雜交結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，U.S.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，每份專利此處全文引用作為參考。
寡聚體模擬物服從于本發(fā)明的另一組寡聚化合物包括寡核苷酸模擬物。應(yīng)用于寡核苷酸的術(shù)語(yǔ)模擬物意在包括寡聚化合物，其中用新的基團(tuán)替代呋喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)與核苷酸間鍵，在本領(lǐng)域內(nèi)將僅僅呋喃糖環(huán)的替代稱作為糖替代。保持雜環(huán)堿基部分或經(jīng)修飾的雜環(huán)堿基部分以便與合適的靶核酸雜交。
將這樣一種寡聚化合物——已證實(shí)具有優(yōu)良雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物稱為肽核酸(PNA)。PNA具有良好的雜交性質(zhì)，高生物學(xué)穩(wěn)定性，并且為靜電中性分子。在最近一項(xiàng)研究中，用PNA校正了轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的異常剪接(Sazani等人，Nat.Biotechnol.，2002，20，1228-1233)。在PNA寡聚化合物中，寡核苷酸的糖主鏈由含有酰胺的主鏈，特別是含有氨基乙基甘氨酸的主鏈替代。核堿基直接或間接地(如下顯示的-C(＝O)-CH2-)與主鏈酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導(dǎo)制備PNA寡聚化合物的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，U.S.5,539,082；5,714,331和5,719,262，每份專利此處引用作為參考。PNA可從Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)商業(yè)獲得。
自從在1991年由Nielsen和同事(Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500)制備PNA以來，已經(jīng)對(duì)基本PNA主鏈進(jìn)行了多種修飾。所述基本結(jié)構(gòu)如下示 其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T4為氫、氨基保護(hù)基、-C(O)R5、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C1-C10烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C2-C10鏈烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C2-C10炔基、烷基磺?；⒎蓟酋；?、化學(xué)官能團(tuán)、報(bào)告分子基團(tuán)、綴合物基、通過α羧基或任選地當(dāng)氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸時(shí)，通過ω羧基連接的D-或L-α氨基酸或者源于通過羧基連接的D、L或混合的D和L氨基酸的肽，其中取代基選自羥基、氨基、烷氧基、羧基、芐基、苯基、硝基、硫羥、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、鏈烯基和炔基；T5為-OH、-N(Z1)Z2、R5、或通過α氨基或任選地當(dāng)氨基酸是賴氨酸或鳥氨酸時(shí)，通過ω氨基連接的D-或L-α氨基酸或者源于通過氨基連接的D、L或混合的D和L氨基酸的肽、化學(xué)官能團(tuán)、報(bào)告分子基團(tuán)或綴合物基；Z1為氫、C1-C6烷基、或氨基保護(hù)基；Z2為氫、C1-C6烷基、氨基保護(hù)基、-C(＝O)-(CH2)n-J-Z3、通過α羧基或任選地當(dāng)氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸時(shí)，通過ω羧基連接的D-或L-α氨基酸或者源于通過羧基連接的D、L或混合的D和L氨基酸的肽；Z3為氫、氨基保護(hù)基、-C1-C6烷基、-C(＝O)-CH3、芐基、苯甲?；?(CH2)n-N(H)Z1；每個(gè)J為O、S或NH；R5為羰基保護(hù)基；和n為7至約79。
另一類已經(jīng)研究的寡核苷酸模擬物以具有附著于嗎啉代環(huán)的雜環(huán)堿基的連接的嗎啉代單位(嗎啉代核酸)為基礎(chǔ)。已經(jīng)報(bào)道了眾多在嗎啉代核酸中連接嗎啉代單體單位的連接基。已經(jīng)選擇了一類連接基以產(chǎn)生非離子寡聚化合物。以非離子嗎啉代為基礎(chǔ)的寡聚化合物不太可能與細(xì)胞蛋白發(fā)生不希望的相互作用。以嗎啉代為基礎(chǔ)的寡聚化合物是寡核苷酸的非離子性模擬物，其不太可能與細(xì)胞蛋白質(zhì)發(fā)生不希望的相互作用(Dwaine A.Braasch和David R.Corey，Biochemistry，2002，41(14)，4503-4510)。在斑馬魚胚胎中已經(jīng)研究了以嗎啉代為基礎(chǔ)的寡聚化合物(見Genesis，第30卷，第3期，2001和Heasman，J.，Dev.Biol.，2002，243，209-214)。已報(bào)道了以嗎啉代為基礎(chǔ)的寡聚化合物的深入研究(見Nasevicius等人，Nat.Genet.，2000，26，216-220；和Lacerra等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，9591-9596)。在1991年7月23日出版的美國(guó)專利5,034,506中公開了以嗎啉代為基礎(chǔ)的寡聚化合物。已經(jīng)制備了具有連接單體亞單位的眾多不同連接基的嗎啉代類的寡聚化合物。
已經(jīng)制備了具有連接單體亞單位的眾多不同的連接基(L2)的嗎啉代核酸?；臼饺缦率?其中T1為氫、羥基、經(jīng)保護(hù)的羥基、連接的核苷或連接的寡聚化合物；T5為氫、磷酸、磷酸衍生物、連接的核苷或連接的寡聚化合物；和L2為連接基，其可以從手性至非手性和帶電荷至中性之間改變(美國(guó)專利5,166,315公開了包括-O-P(＝O)(N(CH3)2)-O-的鍵；美國(guó)專利5,034,506公開了非手性嗎啉代間鍵例如-S(＝O)-X-其中X是NH、NCH3、O、S或CH2；-C(＝Y(jié))-O-其中Y是O或S；-S(＝O)(OH)-CH2-；-S(＝O)(OH)-N(R)-CH2-其中R是H或CH3；美國(guó)專利5,185,444公開了含磷的手性嗎啉代間鍵例如-P(＝O)(-X)-O-其中X是F、CH2R、S-CH2R或NR1R2，并且每個(gè)R、R1、R2是H、CH3或者某些其它不干擾堿基特異性氫鍵的部分；并且n為7至約79。
另一類寡核苷酸模擬物稱作環(huán)己烯基核酸(CeNA)。用環(huán)己烯基環(huán)替代了通常存在于DNA/RNA分子中的呋喃糖環(huán)。已經(jīng)制備了經(jīng)CeNADMT保護(hù)的亞磷酰胺單體并按照常規(guī)亞磷酰胺化學(xué)用于合成寡聚化合物。已經(jīng)制備和研究了經(jīng)充分修飾的CeNA寡聚化合物和在特定位置上經(jīng)CeNA修飾的寡核苷酸(見Wang等人，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602)。通常在DNA鏈中摻入CeNA單體增強(qiáng)DNA/RNA雜合體的穩(wěn)定性。CeNA寡腺苷酸與RNA和DNA互補(bǔ)體形成復(fù)合體并具有與天然復(fù)合體相似的穩(wěn)定性。通過NMR和圓二色性研究CeNA結(jié)構(gòu)向天然核酸結(jié)構(gòu)的摻入以進(jìn)行容易的構(gòu)象適應(yīng)。而且，CeNA摻入靶向RNA的序列對(duì)血清穩(wěn)定，并且能激活大腸桿菌(E.Coli.)RNA酶，導(dǎo)致靶RNA鏈的切割。
CeNA的通式入如下所示 其中每個(gè)Bx為雜環(huán)堿基部分；L3為環(huán)己烯基間鍵，例如磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；T1為氫、羥基、經(jīng)保護(hù)的羥基、連接的核苷或連接的寡聚化合物；和T2為氫或磷酸、磷酸衍生物、連接的核苷或連接的寡聚化合物。
可由一種或多種失水己糖醇核苷制備另一類寡核苷酸模擬物(失水己糖醇核酸)(見Wouters和Herdewijn，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，9，1563-1566)并且所述模擬物具有通式 每個(gè)Bx為雜環(huán)堿基部分；L為失水己糖醇間鍵，例如磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；T1為氫、羥基、經(jīng)保護(hù)的羥基、連接的核苷或連接的寡聚化合物；和T2為氫或磷酸、磷酸衍生物、連接的核苷或連接的寡聚化合物。
進(jìn)一步的修飾包括二環(huán)糖部分例如“鎖定核酸”(LNA)，在其中核糖基糖環(huán)的2’羥基與該糖環(huán)的4’碳原子連接，因此形成2’-C，4’-C-氧基亞甲基鍵以產(chǎn)生二環(huán)糖部分(見Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs，2001，2，558-561；Braasch等人，Chem.Bio1.，2001，8 1-7；和Orum等人綜述，Curr.Opinion Mol.Ther.，2001，3，239-243；也見美國(guó)專利6,268,490和6,670,461)。該鍵可為橋接2′氧原子和4′碳原子的(-CH2-)x基，其中若x＝1，使用術(shù)語(yǔ)LNA，若x＝2，使用術(shù)語(yǔ)ENATM(Singh等人，Chem.Commun.，1998，4，455-456；ENATMMorita等人，BioorganicMedicinal Chemistry，2003，11，2211-2226)。因此，“ENATM”是LNA的一個(gè)非限制性實(shí)例。LNA和其它的二環(huán)糖類似物表現(xiàn)出與互補(bǔ)的DNA和RNA相當(dāng)高的雙鏈體熱穩(wěn)定性(Tm＝+3至+10℃)、3’核酸外切降解穩(wěn)定性和良好的溶解性質(zhì)?？捎蒔roLigo(Paris，F(xiàn)rance和Boulder，CO，USA)商業(yè)獲得LNA。在二環(huán)的環(huán)系統(tǒng)中具有單個(gè)CH2鍵的LNA的基本結(jié)構(gòu)如下所示。這僅僅是LNA一種類型的闡明。
其中每個(gè)T1和T2獨(dú)立地為氫、羥基保護(hù)基、連接的核苷或連接的寡聚化合物，并且每個(gè)Z1為核苷間連接基團(tuán)，比如磷酸二酯或硫代磷酸酯。
還已經(jīng)研究的LNA異構(gòu)體為α-L-LNA，已經(jīng)證實(shí)該異構(gòu)體對(duì)3’-外切核酸酶具有高度穩(wěn)定性(Frieden等人，Nucleic Acids Research，2003，21，6365-6372)。將α-L-LNA摻入反義缺口體和嵌合體，它們表現(xiàn)強(qiáng)烈反義活性。α-L-LNA的結(jié)構(gòu)如下所示
另一種已經(jīng)制備和研究了的類似的二環(huán)糖部分具有從3’羥基通過單個(gè)亞甲基至糖環(huán)的4’碳原子的橋，因此形成3’-C，4’-C-氧基亞甲基鍵(見美國(guó)專利6,043,060)。
由2D NMR光譜測(cè)定的LNA構(gòu)象已顯示在單鏈LNA和雙鏈體中，LNA核苷酸已鎖定的方向以這樣方式限制了磷酸酯主鏈以便導(dǎo)入更高級(jí)的N-型構(gòu)象群(Wengel等人，Nucleosides Nucleotides，1999，18，1365-1370)。
已經(jīng)證實(shí)LNA可形成極度穩(wěn)定的LNALNA雙鏈體(Koshkin等人，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，13252-13253)。已證實(shí)LNALNA雜交是熱穩(wěn)定性最高的核酸類型雙鏈體系統(tǒng)，并且在雙鏈體水平確定了LNA的RNA模擬特征。向DNA互補(bǔ)體導(dǎo)入三(3)種LNA單體(T.或A)顯著提高了解鏈溫度(Tm＝+15/+11)。通過形成極度穩(wěn)定的LNA:LNA雙鏈體已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了LNA介導(dǎo)的雜交的通用性。LNA的RNA模擬在單體的N-型構(gòu)象限制和LNA:RNA雙鏈體的二級(jí)結(jié)構(gòu)方面得以反映。
LNA也可與互補(bǔ)的DNA、RNA或LNA形成具有高的熱親合力的雙鏈體。圓二色性(CD)表明包含經(jīng)充分修飾的LNA的雙鏈體(特別是LNA:RNA)在結(jié)構(gòu)上與A-型RNA:RNA雙鏈體相似。對(duì)LNA:DNA雙鏈體的核磁共振(NMR)檢查證實(shí)了LNA單體的3’內(nèi)構(gòu)象。也已闡明雙鏈DNA的識(shí)別，提示LNA的鏈侵入。對(duì)錯(cuò)配的序列研究表明LNA服從Watson-Crick堿基配對(duì)法則，與對(duì)應(yīng)未經(jīng)修飾的對(duì)照鏈比較具有提高了的選擇性。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)DN/LNA嵌合體靶向螢光素酶mRNA內(nèi)的多個(gè)區(qū)域時(shí)(5’非翻譯區(qū)、起始密碼子區(qū)或編碼區(qū))，可有效地抑止基因表達(dá)(Braasch等人，Nucleic Acids Research，2002，30，5160-5167)。
新型LNA寡聚化合物以及LNA可用于多種診斷和治療應(yīng)用中。這些應(yīng)用中包括反義應(yīng)用、PCR應(yīng)用、鏈替換寡聚體、作為核酸聚合酶的底物以及通常作為基于核苷酸的藥物。
已經(jīng)描述了含有LNA強(qiáng)效并且無毒的反義寡核苷酸(Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638)。作者已經(jīng)證實(shí)LNA賦予反義化合物幾種所希望的性質(zhì)。LNA/DNA共聚物在血清和細(xì)胞提取物中不容易降解。LNA/DNA共聚物在不同檢測(cè)系統(tǒng)中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反義活性，所示檢測(cè)系統(tǒng)為例如活的大鼠腦中G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和在大腸桿菌中檢測(cè)報(bào)告基因。也已成功完成LNA經(jīng)Lipofectin介導(dǎo)的有效遞送到活的人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)。與LNA有關(guān)的其他成功的體內(nèi)研究已經(jīng)證實(shí)了可無毒性地敲除大鼠δ阿片樣受體(Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，5633-5638)，并且在另一個(gè)研究中證實(shí)了RNA聚合酶II大亞基翻譯的阻斷(Fluiter等人，Nucleic Acids Res.，2003，31，953-962)。
已經(jīng)描述了LNA單體腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制備、以及它們的寡聚、和核酸識(shí)別性質(zhì)(Koshkin等人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。在WO98/39352和WO99/14226中也描述了LNA及其制備。
已經(jīng)制備了LNA的第一種類似物硫代磷酸-LNA和2’-硫代-LNA(Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222)。已經(jīng)描述了包含作為核酸聚合酶底物的寡脫氧核糖核苷酸雙鏈體的鎖定核苷類似物的制備(Wengel等，PCT國(guó)際中請(qǐng)WO03/020739；和WO99/14226)。而且，在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了2′-氨基-LNA——一種新型帶柄的構(gòu)象限制性高親合力寡核苷酸類似物的合成(Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039)。此外，已經(jīng)制備了2′-氨基和2′-甲基氨基-LNA，并且先前已經(jīng)報(bào)道了它們帶有互補(bǔ)RNA和DNA鏈的雙鏈體的熱穩(wěn)定性。
已經(jīng)制備和研究了的符合本發(fā)明的另一種寡核苷酸模擬物是蘇糖核酸。該寡核苷酸模擬物以替代核糖核苷的蘇糖核苷為基礎(chǔ)，并且具有如下所示的一般結(jié)構(gòu)
對(duì)(3′，2′)-α-L-蘇糖核酸(TNA)的最初興趣涉及是否存在拷貝TNA的DNA聚合酶。發(fā)現(xiàn)某些DNA聚合酶能夠拷貝TNA模板的有限片段(見C&EN的報(bào)道/2003年1月13日)。
在另一項(xiàng)研究中確定TNA能與DNA、RNA和TNA寡核苷酸反平行Watson-Crick堿基配對(duì)(Chaput等人，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，856-857)。
在一項(xiàng)研究中，制備了(3′，2′)-α-L-蘇糖核酸并與2′和3′酰胺化物類似物比較(Wu等人，Organic Letters，2002，4(8)，1279-1282)。證實(shí)酰胺化物類似物與RNA和RNA結(jié)合，具有與RNA/DNA強(qiáng)度相似的強(qiáng)度。
已經(jīng)進(jìn)一步制備了寡核苷酸模擬物，包括具有下式(所顯示的酰胺化物單體)的雙環(huán)和三環(huán)核苷類似物 (見Steffens等人，Helv.Chim.Acta，1997，80，2426-2439；Steffens等人，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，3249-3255；Renneberg等人，J Am.Chem.Soc.，2002，124，5993-6002；和Renneberg等人；Nucleic acids res.，2002，30，2751-2757)。用亞磷酰胺方法已將這些經(jīng)修飾的核苷類似物寡聚化，并且當(dāng)與DNA、RNA和其自身雜交時(shí)，得到的含三環(huán)核苷類似物的寡聚化合物已顯示出提高的熱穩(wěn)定性(Tm)。含二環(huán)核苷類似物的寡聚化合物已顯示出接近DNA雙鏈體的熱穩(wěn)定性。
另一類寡核苷酸模擬物稱作磷酸單酯核酸，該模擬物在主鏈中摻入磷基團(tuán)。據(jù)報(bào)道這類寡核苷酸模擬物在抑止基因表達(dá)方面(反義寡核苷酸、核酶、有義寡核苷酸和形成三鏈體的寡核苷酸)具備有用的物理學(xué)和生物學(xué)以及藥理學(xué)特點(diǎn)，可作為核酸檢測(cè)探針以及在分子生物學(xué)中輔助應(yīng)用。
通式(Markush變量的定義見美國(guó)專利5,874,553和6,127,346，此處全文引用作為參考)顯示如下 已經(jīng)制備了服從本發(fā)明的其他寡核苷酸模擬物，其中環(huán)丁基環(huán)替代了天然存在的呋喃糖基環(huán)。
經(jīng)修飾的核苷間鍵在本發(fā)明中有用的反義寡聚化合物的特定實(shí)例包括含有經(jīng)修飾的例如非天然存在的核苷間鍵的寡核苷酸。如本說明書中所定義，具有經(jīng)修飾的核苷間鍵的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷間鍵和無磷原子的核苷間鍵。對(duì)于本說明書，以及為本領(lǐng)域中某些時(shí)候所提到，將在核苷間鍵中無磷原子的經(jīng)修飾的寡核苷酸也視為寡核苷。
含有磷原子的經(jīng)修飾的寡核苷酸主鏈包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯，包括3’-鏈烯基膦酸酯、5’-鏈烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯；氨基磷酸酯，包括3’-氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫烷基磷酸三酯、膦?；宜狨ズ土虼Ⅴ；宜狨?見Sheehan等人，Nucleic Acids Research，2003，31(14)，4109-4118和Dellinger等人J.Am.Chem.Soc.，2003，125，940-950)、具有正常3’-5’鍵的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、它們的2’-5’連接的類似物、和那些具有反極性(inverted polarity)的寡核苷酸主鏈，其中一個(gè)或多個(gè)的核苷間鍵為3’至3’、5’至5’或2’至2’鍵。一種含有磷的經(jīng)修飾的核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵，該鍵通過3’-5’鍵連接。具有反極性的寡核苷酸在3’最末的核苷間鍵中包含單個(gè)3’至3’鍵，即可為無堿基的單個(gè)倒置核苷殘基(在此位置核堿基丟失或用羥基代替)。也包括了多種鹽、混合鹽和游離酸形式。
已經(jīng)報(bào)道N3’-P5’-氨基磷酸酯既對(duì)互補(bǔ)的RNA鏈表現(xiàn)了高親合力又表現(xiàn)了核酸酶抗性(Gryaznov等人，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3134-3144)。已經(jīng)研究N3’-P5’-氨基磷酸酯并取得了一定成功，發(fā)現(xiàn)N3’-PS’-氨基磷酸酯在體內(nèi)特異下調(diào)c-myc基因表達(dá)(skorski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94，3966-3971；和Faira等人，Nat.Biotechnol.，2001，19，40-44)。
教導(dǎo)制備以上含磷鍵的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，U.S.3,687,808；4,469,803；4,476,301,5,023,234；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，每個(gè)專利此處引用作為參考。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，寡聚化合物具有一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯和/或雜原子核苷間鍵，特別具有-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(稱作亞甲基(甲基亞氨基)或MMI主鏈)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-代表天然的磷酸二酯核苷間鍵)。在以上參考的美國(guó)專利5,489,677中公開了MMI型核苷間鍵。在以上參考的美國(guó)專利5,602,240中公開了酰胺核苷間鍵。
不包括磷原子的經(jīng)修飾的寡核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子的或雜環(huán)核苷間鍵形成的主鏈。這些主鏈包括那些具有嗎啉代鍵(部分形成自核苷的糖部分)的主鏈；硅氧烷主鏈；硫醚、亞砜和砜主鏈；甲酰基(formacetyl)和硫代甲?；麈?；亞甲基甲?；土虼柞；麈?；核糖乙?；麈?；含烯的主鏈；氨基磺酸酯主鏈、亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和氨磺酰主鏈；酰胺主鏈和其它具有混合N、O、S和CH2組成部分的主鏈。
教導(dǎo)制備以上寡核苷酸的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，U.S.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，每份專利此處引用作為參考。
經(jīng)修飾的糖本發(fā)明的寡聚化合物也可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)取代的或經(jīng)修飾的糖部分。常規(guī)地修飾核糖基和相關(guān)的糖部分的不參與連接的任何反應(yīng)位置。因此對(duì)糖取代基適合的位置是不常用于3’至5’核苷間鍵中的2’位。其它合適的位置是3’和5’末端。當(dāng)兩個(gè)相鄰糖單位之間的鍵是2’，5’鍵時(shí)，可以修飾糖的3’位。糖取代基包括OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-或N-鏈烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、鏈烯基和炔基可為經(jīng)取代或未經(jīng)取代的C1至C10烷基或C2至C10鏈烯基和炔基。特別適宜的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n和m為從1到約10。其它適合的寡核苷酸包含糖取代基，該糖取代基選自C1至C10低級(jí)烷基、經(jīng)取代的低級(jí)烷基、鏈烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2，雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、經(jīng)取代的甲硅烷基、RNA切割基、報(bào)告分子基、嵌入劑、供改善寡核苷酸藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)的基團(tuán)或供改善寡核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)的基團(tuán)，和其它具有相似特點(diǎn)的取代基。
一種修飾包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也稱作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即，烷氧基烷氧基。其他修飾包括2′-二甲基氨基氧乙氧基即，O(CH2)2ON(CH3)2基，也稱作2′-DMAOE，如本文實(shí)施例中所述，2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域中也稱作2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-DMAEOE)，即，2′-O-(CH2)2O-(CH2)2N(CH3)2和N-甲基乙酰胺(也稱作NMA、2′-O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3)。
其它糖取代基包括甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(OCH2CH2CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基(-O-CH2-CH＝CH2)和氟代(F)。2′-糖取代基可位于阿糖(上)位或核糖(下)位內(nèi)。一個(gè)2′-阿糖修飾為2′-F(見Loc等人，Biochemistry，2002，41，3457-3467)?？稍诠丫刍衔锏钠渌恢蒙咸貏e在3’末端核苷上或在2′-5′連接的寡核苷酸中的糖的3′位上，以及5’末端核苷酸的5′位上進(jìn)行相似的修飾。寡聚化合物也可具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分替代呋喃戊糖基(pentofuranosyl)。教導(dǎo)制備經(jīng)如此修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，U.S.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920和6,147,200，每份專利此處全文引用作為參考。
進(jìn)一步代表性的糖取代基包括式Ia或IIa基團(tuán) 其中Rb為O、S或NH；Rd為單鍵、O、S或C(＝O)；Re為C1-C10烷基、N(Rk)(Rm)、N(Rk)(Rn)、N＝C(Rp)(Rq)、N＝C(Rp)
(Rr)或具有式IIIa； Rp和Rq每個(gè)獨(dú)立地為氫或C1-C10烷基；Rr為-Rx-Ry；每個(gè)Rs、Rt、Ru和Rv獨(dú)立地為氫、C(O)Rw、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的C1-C10烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的C2-C10鏈烯基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的C2-C10炔基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、化學(xué)官能團(tuán)或綴合物基，其中取代基選自羥基、氨基、烷氧基、羧基、芐基、苯基、硝基、硫羥基、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、鏈烯基和炔基；或任選地，Ru和Rv一起與它們連接的氮原子形成苯二甲酰亞氨基部分。
每個(gè)Rw獨(dú)立地為經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C1-C10烷基、三氟乙基、氰基乙氧基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、烯丙氧基、9-芴基甲氧基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基、2，2，2-三氯乙氧基、芐氧基、丁?；?、異丁酰基、苯基或芳基；Rk為氫、氮保護(hù)基或-Rx-Ry；Rx為鍵或連接部分；Ry為化學(xué)官能團(tuán)、綴合物基或固相支持介質(zhì)，每個(gè)Rm和Rn獨(dú)立地為，H、氮保護(hù)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C1-C10烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C2-C10鏈烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C2-C10炔基，其中取代基選自羥基、氨基、烷氧基、羧基、芐基、苯基、硝基、硫羥基、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、鏈烯基和炔基；NH3+、N(Ru)(Rv)、胍基和酰基，這里所述?；鶠樗嵝怎０坊蝓?；或Rk和Rm一起為氮保護(hù)基，在任選地包括選自N和O的額外的雜原子的環(huán)結(jié)構(gòu)中連接，或者為化學(xué)官能團(tuán)。
Ri為ORz、SRz或N(Rz)2；
每個(gè)Rz獨(dú)立地為，H、C1-C8烷基、C1-C8鹵烷基、C(＝NH)N(H)Ru、C(＝O)N(H)Ru或OC(＝O)N(H)Ru；Rf、Rg和Rh包含環(huán)系統(tǒng)，該環(huán)系統(tǒng)具有約4至約7個(gè)碳原子或具有約3至約6個(gè)碳原子和1或2個(gè)雜原子，其中所述雜原子選自氧、氮和硫，以及其中所述環(huán)系統(tǒng)為脂肪族、不飽和的脂肪族、芳族或飽和或不飽和雜環(huán)環(huán)系統(tǒng)；Rj為具有1至約10個(gè)碳原子的烷基或鹵烷基、具有2至約10個(gè)碳原子的鏈烯基、具有2至約10個(gè)碳原子的炔基、具有6至約14個(gè)碳原子的芳基、N(Rk)(Rm)ORk、鹵、SRk或CN；ma為1至約10；每個(gè)mb獨(dú)立地為0或1；mc為0或1至10的整數(shù)；md為1至10的整數(shù)；me為0、1或2；條件是mc為0時(shí)，md大于1。
在標(biāo)題為“Capped 2’-Oxyethoxy Oligonucleotide”的美國(guó)專利號(hào)6,172,209中公開了式I的代表性取代基，此處全文引用作為參考。
在標(biāo)題為“RNA Targeted 2′-Oligomeric compounds that areConformationally Preorganized”的美國(guó)專利號(hào)6,271,358中公開了式II的代表性環(huán)取代基，此處全文引用作為參考。
糖取代基包括O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3))2，其中n和m為1至約10。
在1999年7月7日申請(qǐng)的標(biāo)題為“Functionalized Oligomers”的美國(guó)專利號(hào)6,593,466中公開了在式III顯示的代表性胍取代基，因此全文引用作為參考。
在美國(guó)專利號(hào)6,147,200中公開了代表性乙酰胺基取代基，因此全文引用作為參考。
在標(biāo)題為“2′-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Oligomeric compounds”的國(guó)際公開號(hào)WO00/08044895中公開了代表性二甲基氨基乙氧基乙基取代基，因此全文引用作為參考。
本發(fā)明的寡聚化合物也包含任意組合的兩種或多種相同的或化學(xué)上不同的糖、堿基和核苷間鍵修飾。這里所用術(shù)語(yǔ)“化學(xué)上不同的”意為不同的化學(xué)本體，無論該本體完全不同或部分不同。例如，寡聚化合物可包含2’-氟以及2’-MOE修飾。將這兩種修飾視作在同一分子中化學(xué)上不同的本體。
經(jīng)修飾的核堿基/天然存在的核堿基寡聚化合物也可以包括核堿基(在本領(lǐng)域中常簡(jiǎn)稱為“堿基”或“雜環(huán)堿基部分”)修飾或取代。如此處所用，“未經(jīng)修飾的”或“天然的”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。這里還稱作雜環(huán)堿基部分的經(jīng)修飾的核堿基包括其它合成的和天然的核堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵、8-氨基、8-硫羥基、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵，特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。
雜環(huán)堿基部分也可包括那些其中嘌呤或嘧啶堿基為其它雜環(huán)所替代的雜環(huán)堿基，如7-脫氮雜-腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核堿基包括那些在美國(guó)專利號(hào)3,687,808公開的、那些在The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，858-859頁(yè)，Kroschwitz，J.I.，編著John Wiley & Sons，1990，由Englisch等人Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公開的，和Sanghvi，Y.S.，15章，Antisense Research and Applications，289-302頁(yè)，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，編著CRC Press，1993公開的那些核堿基。這些核堿基中某些堿基對(duì)提高本發(fā)明的寡聚化合物的親合力特別有用。這些核堿基包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已證實(shí)5-甲基胞嘧啶取代提高了核酸雙鏈體穩(wěn)定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，編者，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，276-278頁(yè))并且是目前合適的堿基取代，甚至當(dāng)與2’-O-甲氧基乙基糖修飾聯(lián)合時(shí)也是如此。
本發(fā)明的寡聚化合物可同樣包括替代一個(gè)或多個(gè)雜環(huán)堿基部分的多環(huán)雜環(huán)化合物。前面已經(jīng)報(bào)道了多種三環(huán)雜環(huán)化合物。通常在反義應(yīng)用中使用這些化合物以提高經(jīng)修飾的鏈對(duì)靶鏈的結(jié)合性質(zhì)。研究最徹底的修飾針對(duì)鳥嘌呤，因此已經(jīng)將它們命名為G-夾(clamp)或胞嘧啶類似物。眾多這樣的多環(huán)雜環(huán)化合物具有通式 與第二鏈中的鳥嘌呤形成3氫鍵的代表性胞嘧啶類似物包括1，3-二氮雜吩嗪-2-酮(R10＝O、R11-R14＝H)(Kurchavov等人，Nucleosides andNucleotides，1997，16，1837-1846)、1，3-二氮雜吩噻嗪-2-酮(R10＝S，R11-R14＝H)，(Lin，K.-Y.；Jones，R.J.；Matteucci，M.J.Am.Chem.Soc.1995，117，3873-3874)和6，7，8，9-四氟-1，3-二氮雜吩嗪-2-酮(R10＝O，R11-R14＝F)(Wang，J.；Lin，K.-Y.，Matteucci，M.Tetrahedron Lett.1998，9，8385-8388)。已證實(shí)這些摻入到寡核苷酸中的堿基修飾與互補(bǔ)鳥嘌呤雜交并且已經(jīng)證實(shí)后者也與腺嘌呤雜交并且通過擴(kuò)展堆積相互作用而增強(qiáng)螺旋的熱穩(wěn)定性(也見2002年5月24日申請(qǐng)的標(biāo)題為“經(jīng)修飾的肽核酸”的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)10/155,920；2002年5月24日申請(qǐng)的標(biāo)題為“核酸酶抗性嵌合寡核苷酸”的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)10/023,295，兩份專利此處均全文引用作為參考)。
當(dāng)胞嘧啶類似物/取代基具有附著在剛性1，3-二氮雜吩嗪-2-酮支架(R10＝O，R11＝-O-(CH2)2-NH2，R12-14＝H)上的氨基乙氧基部分時(shí)，觀察到進(jìn)一步螺旋穩(wěn)定性質(zhì)(Lin，K.-Y.；Matteucci，M.J.，Am.Chem.Soc.1998，120，8531-8532)。結(jié)合研究表明相對(duì)5-甲基胞嘧啶(dC5me)，一個(gè)摻入將能增強(qiáng)模型寡核苷酸與其互補(bǔ)的靶DNA或RNA的結(jié)合親合力并且ΔTm提高達(dá)18℃，這仍是已知的由單一修飾所致親合力增強(qiáng)的最高值。而另一方面，螺旋穩(wěn)定性的提高并不是損害寡核苷酸特異性。與dC5me相比，Tm數(shù)據(jù)顯示了完美匹配或錯(cuò)配的序列之間更大的差異。已提出被束縛的氨基充當(dāng)為額外的氫鍵供體以便與互補(bǔ)鳥嘌呤的Hoogsteen面即O6相互作用，從而形成4氫鍵。這意味著擴(kuò)展的堿基堆積和額外的特異性氫鍵聯(lián)合介導(dǎo)了G-夾的增加的親合力。
在美國(guó)專利6,028,183和美國(guó)專利6,007,992公開了服從本發(fā)明的其他三環(huán)雜環(huán)化合物和使用它們的方法，兩份專利的內(nèi)容此處全文引用作為參考。
吩嗪衍生物增強(qiáng)的結(jié)合親合力及其未受損的序列特異性使它們成為對(duì)于開發(fā)更有效的基于反義的藥物的有價(jià)值的核堿基類似物。實(shí)際上，已經(jīng)從體外實(shí)驗(yàn)中獲得了有希望的數(shù)據(jù)，其表明含吩嗪取代的七核苷酸能夠激活RNA酶H、增強(qiáng)細(xì)胞攝入并表現(xiàn)增加的反義活性(Lin，K-Y；Matteucci，M.J.Am.Chem.Soc.1998，120，8531-8532)。對(duì)于G夾活性增強(qiáng)更為明顯，因?yàn)楸砻鲉我蝗〈纯娠@著改善20聚體2’-脫氧硫代磷酸酯寡核苷酸的體外效力。(Flanagan，W.M.；Wolf，J.J.；Olson，P.；Grant，D.；Lin，K.-Y.；Wagner，R.W.；Matteucci，M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，3513-3518)。然而，為優(yōu)化寡核苷酸設(shè)計(jì)并且為更好理解這些雜環(huán)修飾對(duì)生物學(xué)活性的影響，評(píng)估這些修飾對(duì)寡聚物核酸酶穩(wěn)定性的影響是重要的。
作為有用的雜環(huán)堿基其他經(jīng)修飾的多環(huán)雜環(huán)化合物公開在，但不限于在上面提到的US 3,687,808，以及U.S.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,434,257；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,646,269；5,750,692；5,830,653；5,763,588；6,005,096和5,681,941，以及2001年11月28日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)09/996,292，這些專利中的部分專利此處引用作為參考。
綴合物用于本發(fā)明組合物中的寡聚化合物也可經(jīng)修飾而具有一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物以增強(qiáng)所得到寡聚化合物的活性、細(xì)胞分布和細(xì)胞攝入。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將綴合物基共價(jià)地連接官能團(tuán)例如羥基或氨基，制備了經(jīng)如此修飾的寡聚化合物。發(fā)明的綴合物基包括嵌入劑、報(bào)告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、能增強(qiáng)寡聚體藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，和能增強(qiáng)寡聚體藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。通常的綴合物基包括膽固醇、脂類、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素，和染料，例如包括Cy3和Alexa。在本發(fā)明上下文中，增強(qiáng)藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善寡聚體攝入、增強(qiáng)寡聚體降解抗性、和/或強(qiáng)化與RNA序列特異雜交的基團(tuán)。在本發(fā)明上下文中，增強(qiáng)藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善寡聚體攝入、分布、代謝或排泄的基團(tuán)。在1992年10月23日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US92/09196中公開了代表性的綴合物基，該專利全文此處引用作為參考。
綴合物部分包括但不限于脂類部分，例如膽固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、膽酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)，硫醚例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，脂肪族鏈，例如，十二雙醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov等人，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等人，Biochinaie，1993，75，49-54)，磷脂，例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙銨、1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-磷酸三乙銨(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧膽固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937).
本發(fā)明的寡聚化合物也可綴合活性藥物物質(zhì)，例如，阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮基布洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜草、吲哚美辛、巴比妥類、頭孢菌素、磺胺藥、抗糖尿病的、抗菌的或抗生素藥物。在美國(guó)專利申請(qǐng)09/334,130(1999年7月15日提交)中描述了寡核苷酸-藥物綴合物和它們的制備，該專利此處全文引用作為參考教導(dǎo)制備這樣的寡核苷酸綴合物的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，U.S.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,6Q8,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，每份專利此處引用作為參考用于本發(fā)明組合物中的寡聚化合物也可經(jīng)修飾而具有一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定基團(tuán)，該穩(wěn)定基團(tuán)通常附著于單鏈寡聚化合物一個(gè)或兩個(gè)末端，或雙鏈化合物任一條鏈的3’或5’末端的一個(gè)或多個(gè)，以增強(qiáng)如核酸酶穩(wěn)定性等性質(zhì)。帽結(jié)構(gòu)包括在穩(wěn)定基團(tuán)內(nèi)。“帽結(jié)構(gòu)或末端的帽結(jié)構(gòu)”意指化學(xué)修飾，該修飾可摻入寡核苷酸任一末端(見例如Wincott等人，WO97/26270，此處引用作為參考)。這些末端修飾保護(hù)具有末端核酸分子的寡聚化合物免遭外切核酸酶降解，并且能幫助寡聚化合物在細(xì)胞內(nèi)遞送和/或定位。帽可存在于5’末端(5’-帽)或3′(3’-帽)末端或兩個(gè)末端。該帽結(jié)構(gòu)不應(yīng)與存在于天然的mRNA分子5’末端的倒置甲基鳥嘌呤“5’帽”混淆。在非限制性實(shí)例中，該5′帽包括倒置的無堿基殘基(部分)、4′，5′-亞甲基核苷酸；1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳環(huán)核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；經(jīng)修飾的堿基核苷酸；二硫代磷酸酯鍵；蘇型-呋喃戊糖基核苷酸、無環(huán)3′，4′-斷核苷酸；無環(huán)3，4-二羥丁基核苷酸；無環(huán)3，5-二羥基戊基核苷酸；3′-3′-倒置的核苷酸部分；3′-3′-倒置的無堿基部分；3′-2′-倒置的核苷酸部分；3′-2′-倒置的無堿基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸；或橋接或非橋接的甲基膦酸酯部分(更多細(xì)節(jié)見Wincott等人，國(guó)際PCT公開WO97/26270，此處引用作為參考)本發(fā)明的3′-帽結(jié)構(gòu)包括，例如，4′，5′-亞甲基核苷酸；1-(p-D-赤型呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳環(huán)核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯、1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羥丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；經(jīng)修飾的堿基核苷酸；二硫代磷酸酯；蘇型-呋喃戊糖基核苷酸、無環(huán)3′，4′-斷核苷酸；3，4-二羥基丁基核苷酸；3，5-二羥基戊基核苷酸；45′-5′-倒置的核苷酸部分；5′-5′-倒置的無堿基部分；5′-氨基磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；橋接或非橋接的5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、橋接或非橋接的甲基膦酸酯和5′-巰基部分(更多細(xì)節(jié)見Beaucage和Tyer，1993，Tetrahedron 49，1925，此處引用作為參考)。
用來對(duì)寡聚化合物的一個(gè)或兩個(gè)末端加帽以賦予核酸酶穩(wěn)定性的其他3′和5′穩(wěn)定基團(tuán)包括那些在2003年1月16日公布的WO03/004602中公開的基團(tuán)。
3’-橋修飾用于描述同源雙鏈核酸的構(gòu)象幾何的術(shù)語(yǔ)為對(duì)RNA為“A”型，對(duì)DNA為“B”型。RNA和DNA雙鏈體各自構(gòu)象幾何由X射線衍射分析核酸纖維測(cè)定(Arnott和Hukins，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1970，47，1504)。通常，RNA:DNA雙鏈體較DNA:DNA雙鏈體更穩(wěn)定并且具有較高的解鏈溫度(Tm)(Sanger等人，Principles of Nucleic Acid Structure，1984，Springer-Verlag；New York，NY.；Lesnik等人，Biochemistry，1995，34，10807-10815；Conte等人，Nucleic Acids Res.，1997，25，2627-2634)。RNA提高的穩(wěn)定性已經(jīng)歸因于幾個(gè)結(jié)構(gòu)特征，最引入注意的是A型幾何導(dǎo)致改善的堿基堆積相互作用(Searle等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。在RNA中存在的2’羥基使糖對(duì)C3’橋折疊偏轉(zhuǎn)，該折疊也稱為Northern折疊(pucker)，該折疊導(dǎo)致雙鏈體促進(jìn)A型幾何。此外，RNA的2’羥基可形成水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，其幫助穩(wěn)定RNA雙鏈體(Egli等人，Biochemistry，1996，35，8489-8494)。另一方面，脫氧核酸優(yōu)選C2′橋糖折疊，即，也稱作Southern折疊，據(jù)認(rèn)為該折疊賦予了穩(wěn)定性較低的B型幾何(Sanger，W.(1984)核酸結(jié)構(gòu)原理，Springer-Verlag，New York，NY)。如此處所用，B型幾何既包括C2′-橋折疊也包括O4′-橋折疊。這與Berger等人，Nucleic Acids Research，1998，26，2473-2480一致，Berger等人指出，在考慮產(chǎn)生B型雙鏈體的呋喃糖構(gòu)象時(shí)，也應(yīng)當(dāng)對(duì)O4′-橋折疊的貢獻(xiàn)予以考慮。
然而，DNA:RNA雜交雙鏈體穩(wěn)定性通常比純的RNA:RNA雙鏈體穩(wěn)定性低，并且取決于它們的序列可能比DNA:DNA雙鏈體穩(wěn)定性更高或更低，(Searle等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。雜合雙鏈體的結(jié)構(gòu)介于A-型和B-型幾何之間，這種結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致弱堆積相互作用(Lane等人，Eur.J.Biochem.，1993，215，297-306；Fedoroff等人，J.Mol.Biol.，1993，233，509-523；Gonzalez等人；Biochemistry，1995，34，4969-4982；Horton等人，J.Mol.Biol.1996，264，521-533)。靶RNA和合成的序列間形成的雙鏈體的穩(wěn)定性對(duì)于針對(duì)但不限于包括RNA酶H、RNAi在內(nèi)的反義機(jī)制或需要寡聚化合物結(jié)合RNA靶鏈的任何機(jī)制的療法是關(guān)鍵的。就反義而言，有效地抑制mRNA需要反義化合物具有與mRNA足夠高的結(jié)合親合力。否則寡聚反義化合物與靶mRNA鏈之間所希望的相互作用將較少發(fā)生，結(jié)果導(dǎo)致降低的功效。
修飾糖折疊的一種常規(guī)方法是用影響糖幾何的取代基取代糖的2’位。對(duì)環(huán)構(gòu)象的影響依賴于2’位取代基的性質(zhì)。已經(jīng)研究了眾多不同的取代基以測(cè)定它們的糖折疊效應(yīng)。例如，已經(jīng)對(duì)2’-鹵素的研究表明2’-氟衍生物展示了C3’橋形式的最群體(65％)，而2’-碘展示了最低的群體(7％)。腺嘌呤(2’-OH)群體對(duì)脫氧腺嘌呤群體分別為36％和19％。進(jìn)一步，腺嘌呤二聚體(2’-脫氧-2’-氟-腺嘌呤-2’-脫氧2’-氟腺嘌呤)的2’-氟基的影響進(jìn)一步與經(jīng)堆積的構(gòu)象的穩(wěn)定有關(guān)。
如所期望，通過以2’-氟基替換2’-OH基能增強(qiáng)雙鏈體相對(duì)穩(wěn)定性，因此增加了C3’-橋群。推測(cè)2’-F鍵的高度極性和對(duì)C3’-橋折疊的極端偏愛將穩(wěn)定A型雙鏈體中堆積的構(gòu)象。來自UV減色性、圓二色性和1H NMR的數(shù)據(jù)也表面隨著鹵取代基電負(fù)性的降低，堆積度下降。而且，糖部分的2’位上的空間體積在A型雙鏈體中較在B型雙鏈體中得到更好地容納。因此，認(rèn)為在二核苷單磷酸酯的3’末端上的2’取代基對(duì)堆積構(gòu)象產(chǎn)生許多效應(yīng)空間互斥、呋喃糖折疊偏好、靜電排斥、疏水性吸引和成氫鍵能力。認(rèn)為這些取代基效應(yīng)由取代基的分子大小、電負(fù)性、和疏水性決定?；パa(bǔ)鏈的解鏈溫度同樣隨2’取代的腺嘌呤二磷酸酯而增高。構(gòu)象的3’橋偏好還是取代基的存在為結(jié)合增強(qiáng)的原因還不清楚。然而，可以用3’-橋構(gòu)象實(shí)現(xiàn)相鄰堿基更大重疊(堆積)。
本發(fā)明的一個(gè)方面，寡聚化合物包括經(jīng)合成方式修飾以誘導(dǎo)3’-橋糖構(gòu)象的核苷。核苷可摻入雜環(huán)堿基、糖部分或兩者的合成修飾，以誘導(dǎo)所希望的3’-橋糖構(gòu)象。這些經(jīng)修飾的核苷用于模擬類RNA核苷，以便在維持所希望的3’-橋構(gòu)象幾何的同時(shí)增強(qiáng)寡聚化合物的特定性質(zhì)。作為RNA干擾機(jī)器的必需條件，存在對(duì)RNA型雙鏈體(A型螺旋，主要是3’-橋)明顯的偏愛，這種偏愛部分地由如下事實(shí)所支持在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)系統(tǒng)中，2’-脫氧-2’-F-核苷組成的雙鏈體高效率啟動(dòng)RNAi反應(yīng)。通過使用更穩(wěn)定的3’-橋核苷而增強(qiáng)的性質(zhì)包括，但不限于，通過調(diào)整蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)解離塑料(off-rate)、吸收和清除調(diào)節(jié)藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、調(diào)節(jié)核酸酶穩(wěn)定性以及化學(xué)穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)寡聚體的結(jié)合親合力和特異性(對(duì)酶以及對(duì)互補(bǔ)序列的親和力和特異性)、以及提高RNA切割效率。本發(fā)明提供充當(dāng)RNAi途徑觸發(fā)物的寡聚化合物，該化合物具有經(jīng)如此方式修飾以支持C3’-橋型構(gòu)象的一個(gè)或多個(gè)核苷。
構(gòu)象圖 C2’-橋/SouthernC3’-橋/Northern核苷構(gòu)象受多種因素影響，這些因素包括在呋喃戊糖基糖2’、3’或4’位上的取代。電負(fù)性取代基通常偏好直立位，而需要空間的取代基通常偏好平伏位(核酸結(jié)構(gòu)原理，Wolfgang Sanger，1984，Springer-Verlag)?？沙晒ν瓿芍С?’-橋構(gòu)象的2’-位修飾并維持作為識(shí)別元件的2’-OH(Gallo等人，Tetrahedron(2001)，57，5707-5713.Harry-O′kuru等人，J.Org.Chem.，(1997)，62(6)，1754-1759和Tang等人，J.Org.Chem.(1999)，64，747-754)。
或者，通過如由2’脫氧-2’F-核苷所例證的2’-OH缺失而成功實(shí)現(xiàn)對(duì)3’-橋構(gòu)象的偏愛(Kawasaki等人，J.Med.Chem.(1993)，36，831-841)，該偏好采用了將電負(fù)性氟原子置于直立位的3’-橋構(gòu)象。核糖環(huán)的其它修飾包括，例如在4’-位置取代以產(chǎn)生經(jīng)4’-F修飾的核苷(Guillerm等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters(1995)，5，1455-1460以及Owen等人，J.Org.Chem.(1976)，41，3010-3017)或例如，產(chǎn)生亞甲基卡巴核苷(methanocarba nucleoside)的類似物的修飾也誘導(dǎo)了對(duì)3’-橋構(gòu)象的偏好(Jacobson等人，J.Med.Chem.Lett.(2000)，43，2196-2203和Lee等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters(2001)，11，1333-1337)。以相似思路，觸發(fā)RNAi反應(yīng)的寡聚化合物可由一種和多種經(jīng)修飾的核苷以如此方式組成，其中將該核苷的構(gòu)象鎖定為C3’-橋型構(gòu)象，即鎖定核酸(LNA，Singh等人，Chem.Commun.(1998)，4，455-456)，和經(jīng)乙烯橋接的核酸(ENATM，Morita等人，Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(2002)，12，73-76)。
經(jīng)修飾的核苷和它們寡聚體的優(yōu)選構(gòu)象通過多種方法例如分子動(dòng)態(tài)計(jì)算、核磁共振光譜學(xué)和CD測(cè)量得到評(píng)估。因此，選擇預(yù)測(cè)在寡聚的環(huán)境中可誘導(dǎo)類RNA構(gòu)象，A型雙鏈體幾何結(jié)構(gòu)的修飾以用于本發(fā)明的經(jīng)修飾的寡核苷酸。服從本發(fā)明的眾多經(jīng)修飾的核苷的合成為本領(lǐng)域公知(見例如，1988年P(guān)lenum出版社Leroy B.Townsend編輯《核苷和核苷酸的化學(xué)》第1-3卷，以及下面的實(shí)施例部分)。
一方面，本發(fā)明涉及所制備的針對(duì)核酸靶標(biāo)、與天然RNA相比具有增強(qiáng)的性質(zhì)的寡聚化合物。在設(shè)計(jì)增強(qiáng)性寡聚化合物時(shí)，鑒定了靶標(biāo)，并且選擇具有有效的長(zhǎng)度并且與靶序列一部分互補(bǔ)的序列的寡聚化合物。為可能的增強(qiáng)修飾細(xì)查了所選擇序列中每一個(gè)核苷。一種修飾將為以具有相同3’-橋構(gòu)象幾何但是還具有增強(qiáng)了的性質(zhì)的核苷替代一個(gè)或多個(gè)RNA核苷。相比于天然RNA，這種修飾能增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性和核酸酶穩(wěn)定性，并且與此同時(shí)可更廉價(jià)和更容易地合成和/或摻入寡核苷酸。所選擇的寡聚化合物序列可進(jìn)一步劃分為區(qū)域并對(duì)每個(gè)區(qū)域的核苷評(píng)估嵌合構(gòu)象可以導(dǎo)致的增強(qiáng)性修飾。既然經(jīng)?？梢詫?duì)一個(gè)或多個(gè)末端的核苷進(jìn)行有利的修飾，因此，也應(yīng)該對(duì)5’和3’末端給予考慮。本發(fā)明的寡聚化合物可包含單鏈上或一條或多條雙鏈序列的至少一個(gè)5’-位磷酸酯上至少一個(gè)5’-修飾的磷酸酯基。也可考慮其他修飾，例如核苷間鍵、綴合物基、取代基糖或堿、以核苷模擬物取代一個(gè)或多個(gè)核苷以及能增強(qiáng)所選擇的序列對(duì)它的預(yù)期靶的親合力的任何其它修飾。
賦予核苷酸的增強(qiáng)的核酸酶抗性和極高親合力的一種合成2’-修飾是2-甲氧基乙氧基(2′-MOE，2′-OCH2CH2OCH3)側(cè)鏈(Baker等人，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000)。2′-MOE取代的一個(gè)即刻優(yōu)點(diǎn)是提高了結(jié)合親合力，該修飾產(chǎn)生親合力較之于眾多相似的2’-修飾例如O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基的修飾產(chǎn)生的親合力強(qiáng)得多。已經(jīng)證實(shí)具有2’-O-甲氧基乙基取代基的寡聚體是基因表達(dá)的抑制物，具備體內(nèi)應(yīng)用有希望的特點(diǎn)(Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altmann等人，Chimia，1996，50，168-176，Altmann等人，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637；和Altmann等人，Nucleosides Nucleotide，1997，16，917-926)。相對(duì)于DNA，具有2′-MOE修飾的寡聚體表現(xiàn)出提高的RNA親合力以及更高的核酸酶抗性。在翼核苷和脫氧-硫代磷酸酯核苷酸(也稱為缺口寡聚體或缺口體)的內(nèi)部區(qū)域中具有2′-MOE取代基的嵌合寡聚體已顯示在低劑量下能有效降低動(dòng)物模型中腫瘤生長(zhǎng)。2′-MOE取代的寡聚體也已在幾種疾病狀態(tài)中顯示了作為反義化合物的光明前景。已批準(zhǔn)了一種此類MOE取代的寡聚體用于治療CMV視網(wǎng)膜炎。
大多數(shù)2’-MOE取代基呈現(xiàn)環(huán)繞于乙基連接體C-C鍵的扭曲構(gòu)象。然而，在兩個(gè)案例中觀察到了環(huán)繞于C-C鍵的反式(trans)構(gòu)象。晶體中的晶格相互作用包括雙鏈體通過它們的小溝相互堆積。因此，對(duì)某些殘基，2’-O-取代基的構(gòu)象受相鄰的雙鏈體接觸的影響。通常取代基構(gòu)象的變化(例如，環(huán)繞C-C鍵的g+或g-)在鏈間、小溝間和鏈內(nèi)的取代基之間產(chǎn)生一系列相互作用。在一個(gè)位置上，來自于兩個(gè)殘基的取代基原子處于小溝間范德華接觸之中。類似的，兩個(gè)來自相鄰的鏈內(nèi)殘基的取代基原子之間發(fā)生密切接觸。
以前測(cè)定的A-DNA雙鏈體晶體結(jié)構(gòu)為摻入單獨(dú)的2’-O-甲基T殘基的雙鏈體的結(jié)構(gòu)。在以上提到適用于2’-MOE取代基的晶體結(jié)構(gòu)中，已經(jīng)觀察到2’-MOE殘基的保守水合模式。觀察到單個(gè)的水分子位于取代基的O2’、O3’和甲氧基氧原子之間，與三方形成2.9至3.4的接觸。此外，取代基的氧原子參與了其它幾個(gè)氫鍵接觸。例如，特定2’-O-取代基的甲氧基氧原子通過橋接的水分子與來自相反鏈的腺苷的N3形成氫鍵。
在一些情況中，水分子陷入經(jīng)修飾的核苷的氧原子O2’、O3’和OC’之間。乙二醇連接體C-C鍵周圍具有反式構(gòu)象的2’-MOE取代基與相反鏈中鳥苷OC’和N2之間以緊密接觸連接，并且在OC’和N3(G)之間經(jīng)水介導(dǎo)連接。當(dāng)結(jié)合含有經(jīng)2’-MOE修飾鏈的雙鏈體的可獲得的熱力學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)，該晶體結(jié)構(gòu)可適用于進(jìn)一步詳細(xì)分析其它修飾的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
在深入的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)研究中，進(jìn)行了分子建模實(shí)驗(yàn)以研究具有2’-O-修飾的寡核苷酸增強(qiáng)了的結(jié)合親合力。對(duì)上面的SEQ ID NO10的化合物實(shí)施了計(jì)算機(jī)模擬，該化合物在寡核苷酸中每個(gè)核苷都具有2’-O-修飾。用AMBER力場(chǎng)方法對(duì)水性溶液中寡核苷酸進(jìn)行了模擬(Cornell等人，J.Am.Chem.Soc.，1995，117，5179-5197)(來自UCSF，San Francisco，CA的建模軟件包)。在Indigo2 SGI機(jī)上進(jìn)行了計(jì)算(Silicon Graphics，Mountain View，CA)。
另一個(gè)產(chǎn)生3’-橋糖構(gòu)象幾何的2’-糖取代基是2’-OMe基。就相應(yīng)的天然(2’-OH)種類而言，以2’-OMe基2’取代鳥苷、胞苷和尿苷二核苷磷酸酯顯示增強(qiáng)的堆積效應(yīng)，因此得出糖采用C3’-橋構(gòu)象的結(jié)論。在此實(shí)例中，認(rèn)為甲基的疏水性吸引力傾向于克服其空間體積的去穩(wěn)定性效應(yīng)。
通過測(cè)定寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈雜交復(fù)合體的解鏈溫度(Tm)比較了寡核苷酸與其互補(bǔ)靶標(biāo)鏈結(jié)合的能力。解鏈溫度(Tm)——雙螺旋的特征性物理性質(zhì)——是出現(xiàn)50％螺旋(雜交)對(duì)卷曲(未雜交)形式時(shí)的溫度(攝氏度)。通過UV光譜測(cè)定雜交復(fù)合體的形成和破壞(解鏈)測(cè)量Tm。在雜交期間發(fā)生的堿基堆積伴隨UV吸收的減少(減色性)。因此UV吸收的減少表明高Tm。Tm越高，鏈之間鍵的強(qiáng)度越大。
Freier和Altmann，Nucleic Acids Research，(1997)254429-4443，已經(jīng)發(fā)表了關(guān)于寡核苷酸結(jié)構(gòu)性修飾對(duì)它們與靶RNA形成的雙鏈體的穩(wěn)定性影響的研究。在該研究中，作者回顧了已經(jīng)合成的含有超過200種不同修飾的一系列寡核苷酸，并且評(píng)估了它們的雜交親合力和Tm。經(jīng)研究的糖的修飾包括在糖2’-位上的取代、3’-取代、4’-氧替代、二環(huán)糖的使用和四元環(huán)替代。對(duì)幾種核堿基修飾也進(jìn)行了研究，所述修飾包括在胸腺嘧啶的5或6位的取代、嘧啶雜環(huán)的修飾和嘌呤雜環(huán)的修飾。也對(duì)經(jīng)修飾的核苷間鍵進(jìn)行了研究，所述鍵包括中性、含磷和無磷的核苷間鍵。
在靶向mRNA靶鏈的經(jīng)修飾的寡核苷酸中增加C3’-橋糖的百分?jǐn)?shù)應(yīng)該預(yù)組織該鏈以結(jié)合RNA。文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道和研究過的幾種糖修飾中，電負(fù)性取代基例如2’-氟基或2’-烷氧基的摻入將使糖構(gòu)象轉(zhuǎn)向3’-橋(northern)折疊構(gòu)象。這使得摻入了此種修飾的寡核苷酸預(yù)組織以便具有A-型構(gòu)象幾何。這種A型構(gòu)象導(dǎo)致了寡核苷酸對(duì)靶RNA鏈增強(qiáng)的結(jié)合親合力。
此外，對(duì)含有乙二醇基序的2’-取代基而言，側(cè)鏈中環(huán)繞O-C-C-O扭轉(zhuǎn)的氧原子之間的旁(gauche)相互作用對(duì)雙鏈體具有穩(wěn)定效應(yīng)(Freier同前)。這種旁相互作用已經(jīng)多年來通過實(shí)驗(yàn)觀察到(Wolfe等人，Acc.Chem.Res.，1972，5，102；Abe等人，J.Am.Chem.Soc.，1976，98，468)。這gauche效應(yīng)可能導(dǎo)致支持雙鏈體形成的側(cè)鏈構(gòu)型。仍不能解釋該穩(wěn)定性構(gòu)型的確切本質(zhì)。盡管我們不想為理論所束縛，可能保持在單個(gè)gauche構(gòu)型中的O-C-C-O扭轉(zhuǎn)而非在烷基側(cè)鏈中觀察到的更為隨機(jī)的分布為形成雙鏈體提供了熵優(yōu)勢(shì)。
將A-型構(gòu)象特征(3’-橋)賦予所得雙鏈體的服從本發(fā)明的代表性2’-取代基包括2′-O-烷基、2′-O-取代的烷基和2′-氟基取代基。多種烷基和芳基醚和硫醚、胺和單烷基和二烷基取代的胺是適合的取代基。進(jìn)一步打算對(duì)本發(fā)明的一種或多種寡聚化合物在一個(gè)或多個(gè)單體亞單位(核苷是適合的)和/或核苷間鍵上的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多額修飾，以增強(qiáng)例如但不限于在所選擇的應(yīng)用中活性的性質(zhì)。
包含作為2’-修飾的本發(fā)明的環(huán)結(jié)構(gòu)包括環(huán)己基、環(huán)戊基和苯環(huán)以及具有類似環(huán)己基、環(huán)戊基和苯環(huán)的空間足跡(spacial footprints)的雜環(huán)環(huán)。本發(fā)明的2’-O-取代基包括但不限于2′-O-(反式2-甲氧基環(huán)己基、2′-O-(反式2-2-甲氧基環(huán)戊基、2′-O-(反式2-脲基環(huán)己基)和2′-O-(反式2-甲氧基苯基)。
所定義的化學(xué)除非本文另外定義，烷基意為C1-C12、C1-C8或C1-C6，直鏈或(若可能)支鏈脂肪族烴基。
除非本文另外定義，雜烷基意為C1-C12、C1-C8或C1-C6，直鏈或(若可能)支鏈脂肪族烴基，其在包括鏈末端部分的鏈中含有至少一個(gè)，或約1個(gè)至約3個(gè)雜原子。雜原子包括N、O和S。
除非本文另外定義，環(huán)烷基意為C3-C12、C3-C8或C3-C6脂肪族烴基環(huán)。
除非本文另外定義，鏈烯基意為C2-C12、C2-C8或C2-C6鏈烯基，該鏈烯基可為直鏈或(若可能)支鏈的烴基部分，該烴基部分至少包含一個(gè)碳-碳雙鍵。
除非本文另外定義，炔基意為C2-C12、C2-C8或C2-C6炔基，其可為直鏈或(若可能)支鏈的烴基部分，該烴基部分至少包含一個(gè)碳-碳叁鍵。
除非本文另外定義，雜環(huán)烷基意為包含至少三個(gè)環(huán)成員的環(huán)部分，其中至少一個(gè)環(huán)成員為碳，并且1、2或三個(gè)環(huán)成員為非碳。碳原子的數(shù)目可為1至約12、1到約6，并且環(huán)成員的總數(shù)可在3至約15間變動(dòng)，或從約3至約8變動(dòng)。環(huán)雜原子為N、O和S。雜環(huán)烷基包括嗎啉代、硫代嗎啉代、哌啶基、哌嗪基、高哌啶基(homopiperidinyl)、高哌嗪基(homopiperazinyl)、高嗎啉代(homomorpholino)、高硫代嗎啉代(homothiomorpholino)、吡咯烷基、四氫唑基、四氫咪唑基、四氫噻唑基、四羥異唑基、四氫吡唑基、吡喃基和四氫異噻唑基。
除非本文另外定義，芳基意為包含至少一個(gè)芳環(huán)的任何烴環(huán)結(jié)構(gòu)。芳環(huán)具有約6至約20個(gè)環(huán)碳。芳環(huán)也包括苯基、萘基、蒽基和菲基。
除非本文另外定義，雜芳基意為環(huán)部分，該環(huán)部分包含至少一個(gè)完全不飽和的環(huán)，該環(huán)由碳和非碳原子組成。環(huán)系統(tǒng)可包含約1至約4個(gè)環(huán)。碳原子的數(shù)目可在1至約12間變動(dòng)，或在1至約6間變動(dòng)，并且環(huán)成員的總數(shù)可在3至約15間變動(dòng)，或?yàn)榧s3至約8。環(huán)雜原子為N、O和S。雜芳基部分包括吡唑基、苯硫基、吡啶基、咪唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、嘌呤基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并咪唑基、苯并噻吩基等。
除非本文另外定義，其中部分定義為化合物的部分，例如雜芳基烷基(雜芳基和烷基)、芳烷基(芳基和烷基)等，每個(gè)亞部分均如此定義。
除非本文另外定義，吸電子基團(tuán)是將電荷吸離它所連接的碳原子的基團(tuán)，例如氰基或異氰酸根合基。其它指出的吸電子基團(tuán)包括那些電負(fù)性超過碳原子電負(fù)性的基團(tuán)，例如，鹵素、硝基或在鄰位或?qū)ξ灰砸粋€(gè)或多個(gè)氰基、異硫氰酸根合基、硝基或鹵素取代的苯基。
除非本文另外定義，術(shù)語(yǔ)鹵素和鹵具有它們的普通意思。術(shù)語(yǔ)鹵素和鹵素具有它們的普通意義。鹵(鹵素)取代基為F、Cl、Br和I。
除非本文另外定義，前面提到的任選的取代基是根據(jù)所希望的性質(zhì)的適合的取代基。包括鹵素(F、Cl、Br、I)、烷基、鏈烯基，和炔基部分、NO2、NH3(經(jīng)取代或未經(jīng)取代的)、酸部分(例如-CO2H、-OSO3H2等)、雜環(huán)烷基部分、雜芳基部分、芳基部分等。
在前面所有的式中，波浪線(～)表示連接5’-磷酸酯的氧或硫的鍵。磷酸酯保護(hù)基包括那些在美國(guó)專利號(hào)US 5,760,209、US 5,614,621、US6,051,699、US 6,020,475、US 6,326,478、US 6,169,177、US 6,121,437、US6,465,628中公開的磷酸酯保護(hù)基，每份專利此處全文明確地引用作為參考。
寡聚體合成如適宜，根據(jù)文獻(xiàn)中關(guān)于DNA(1993年Humana出版社Agrawal編輯Protocols for Oligonucleotides and Analogs)和/或RNA(Scaringe，Methods(2001)，23，206-217.Gait等人、1998年Smith編輯Gallo等人，Applications of Chemically synthesized RNA in RNAProtein Interactions1-36、Tetrahedron(2001)，57，5707-5713)合成的方法實(shí)施了經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的核苷的寡聚化。此外，在下面的實(shí)施例中說明了合成本發(fā)明的寡聚化合物的具體方案。
通過眾知的固相合成技術(shù)可方便并且常規(guī)地合成根據(jù)本發(fā)明使用的寡聚化合物。包括，例如Applied Biosystem(Foster City，CA)的幾家供貨商出售此類合成的設(shè)備?？梢灶~外地或備選性地使用為本領(lǐng)域公知的任何其他方法進(jìn)行此類合成。眾所公知使用相似技術(shù)制備諸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物的寡核苷酸。
本發(fā)明的寡聚化合物也可混合、膠囊化、綴合或與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物，例如脂質(zhì)體、受體靶向分子、經(jīng)口的、直腸的、局部的其它的劑型聯(lián)合以促進(jìn)攝入、分布和/或吸收。教導(dǎo)制備這種促進(jìn)攝入、分布和/或吸收的劑型的代表性美國(guó)專利包括，但不限于，美國(guó)專利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，每份專利此處引用作為參考。
鹽、前體藥物和生物等同物發(fā)明的寡聚化合物包括任何藥學(xué)可接受的鹽、酯或這種酯的鹽、或施用于包括人的動(dòng)物時(shí)，能夠(直接地或間接地)提供生物活性代謝物或其殘基的任意其它化合物。據(jù)此，例如，本公開也涉及發(fā)明的化合物的前體藥物和藥學(xué)可接受的鹽、這種前體藥物的藥學(xué)可接受的鹽、和其它生物等同物。
術(shù)語(yǔ)“前體藥物”表示一種治療劑，該治療劑以非活性或低活性形式制備，這種非活性或低活性形式經(jīng)內(nèi)源性酶或其它化學(xué)品和/或條件作用在機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為活性形式(即藥物)。特別地，根據(jù)Gosselin等人1993年12月9日公布的WO93/245510中或Imbach等人的WO94/26764中公開的方法，將本發(fā)明的寡核苷酸的前體藥物形式制備為SATE((S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯)衍生物。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的鹽”指本發(fā)明化合物的生理和藥學(xué)可接受的鹽即，保持親本化合物所希望的生物學(xué)活性并且不因此賦予不希望的毒性效應(yīng)的鹽。
可與金屬或胺，例如堿金屬和堿土金屬或有機(jī)胺形成藥學(xué)可接受的加堿鹽。用作陽(yáng)離子的金屬的實(shí)例為鈉、鉀、鎂、鈣等。合適的胺的實(shí)例為N，N’-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、二環(huán)己基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普魯卡因(見，例如，Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，J.of Pharma Sci.，1977，66，1-19)。通過將游離酸形式與足量所希望的堿接觸以常規(guī)的方式產(chǎn)生鹽而制備所述酸性化合物的堿加成鹽。通過將鹽形式與酸接觸并且以常規(guī)方式分離自由酸可再生游離酸形式。游離酸形式在某些物理性質(zhì)如在極性溶劑中的溶解性不同于它們各自的鹽形式，但是除此之外就本發(fā)明而言，鹽與它們各自的游離酸等同。如此所用，“藥物加成鹽”包括本發(fā)明組合物諸成分的一種成分的酸性形式藥學(xué)可接受的鹽。藥物加成鹽包括胺的有機(jī)或無機(jī)酸鹽。酸式鹽為氫氯酸鹽、乙酸鹽、水楊酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽。其它合適的藥學(xué)可接受的鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并且包括多種無機(jī)和有機(jī)酸的堿式鹽，例如，與無機(jī)酸，例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸或磷酸；與有機(jī)羧酸、磺酸、硫代酸或膦酸或N取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、馬來酸、羥基馬來酸、甲基馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、雙羥萘酸、煙酸或異煙酸，和與氨基酸，諸如在自然環(huán)境中參與蛋白質(zhì)合成的20種α氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸、和與苯基乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油、葡萄糖-6-磷酸、N-環(huán)己基氨基磺酸(形成環(huán)己基氨基磺酸鹽)，或與其它酸性有機(jī)化合物，例如抗壞血酸形成的鹽。也可用藥學(xué)可接受的陽(yáng)離子制備化合物的藥學(xué)可接受的鹽。合適的藥學(xué)可接受的陽(yáng)離子為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并且包括堿金屬、堿土金屬、銨和季銨陽(yáng)離子。也可能是碳酸鹽或碳酸氫鹽。
對(duì)于寡核苷酸，藥學(xué)可接受的鹽的實(shí)例包括但不限于(a)與例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺例如精胺和亞精胺等陽(yáng)離子形成的鹽；(b)與例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸；磷酸、硝酸等的無機(jī)酸形成的酸加成鹽；(c)與例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等等的有機(jī)酸形成的鹽；(d)與例如氯、溴和碘的元素陰離子形成的鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供作為鈉鹽的雙鏈寡聚化合物。
如此所用，術(shù)語(yǔ)“患者”指遭受一種或多種與存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)有關(guān)的疾病侵襲的哺乳動(dòng)物。將可以理解最適宜的患者是人，也可以理解本發(fā)明特別涉及抑制哺乳動(dòng)物存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)。
已經(jīng)認(rèn)識(shí)本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過以有效量的本發(fā)明的化合物治療正在受存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)有關(guān)的疾病疾病侵襲的患者而影響所述疾病。因此術(shù)語(yǔ)“治療”意指所有的其中，其中可以減慢、中斷、抑制、控制或中止本文描述的疾病的發(fā)展，但是不必表示完全消除所有癥狀。
如此所用，本發(fā)明的化合物的術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”指能有效地治療或防止此處所描述的疾病的量。
本發(fā)明的寡聚化合物可用于診斷、治療、預(yù)防和作為研究試劑和試劑盒。用于治療時(shí)，對(duì)懷疑患有能通過調(diào)節(jié)存活蛋白表達(dá)而治療的疾病或病癥的患者，例如人，通過施用根據(jù)本發(fā)明的反義化合物進(jìn)行治療。通過將有效量的反義化合物添加到合適的藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體中，可在藥物組合物中使用發(fā)明的化合物。也可預(yù)防性使用本發(fā)明的反義化合物和方法例如，以防止或延緩感染、炎癥或腫瘤形成。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的寡聚化合物的藥物組合物和劑型。本發(fā)明的藥物組合物可以多種途徑施用，取決于是否需要局部或全身性治療，并且取決于欲治療的部位。施用可為局部的(包括眼的和粘膜的，包括陰道和直腸遞送)、經(jīng)肺，例如通過粉劑或氣溶膠的吸入或吹入，包括通過霧化器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮的、皮內(nèi)的和透皮的、經(jīng)口的或腸胃外施用。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射、滴注或灌注?；蝻B內(nèi)的，例如鞘內(nèi)或室內(nèi)施用。認(rèn)為具有至少一個(gè)2’-O-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸尤其可用于經(jīng)口施用。
供局部施用的藥物組合物和劑型可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)的藥物載體、水性的、粉末或油狀基質(zhì)、增稠劑等可為必需或所希望的。也可使用經(jīng)涂布的安全套、手套等等。
經(jīng)口施用的組合物和劑型包括粉劑或粒劑、在水或非水性介質(zhì)中的懸浮劑或溶液劑、膠囊、小藥囊或片劑。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑和粘合劑也為所希望的。經(jīng)口施用的組合物也包括在2001年8月22日提交的共同待決美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)09/944,493和2001年8月22日提交的09/935,316中所描述的脈沖遞送組合物和生物粘附性組合物，這兩個(gè)共同待決專利的全部?jī)?nèi)容此處引用作為參考。此處描述了疾病治療的經(jīng)口施用。然而，經(jīng)口施用不是唯一的途徑。例如，因?yàn)榉奖慊驗(yàn)楸苊馀c經(jīng)口施用相關(guān)的潛在并發(fā)癥，靜脈內(nèi)途徑為所希望的。當(dāng)通過靜脈內(nèi)途徑施用本發(fā)明的化合物時(shí)，可使用靜脈內(nèi)快速濃注或緩慢灌注。
用于腸胃外、顱內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和劑型可包括無菌水性溶液劑，該溶液劑也可包含緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加物例如，但不限于，滲透增強(qiáng)劑、載體化合物和其它藥學(xué)可接受的載體或賦形劑、包含本發(fā)明的寡聚化合物的藥物組合物和/或劑型也可包括滲透增強(qiáng)劑，以便增強(qiáng)寡核苷酸的營(yíng)養(yǎng)遞送?？蓪B透增強(qiáng)劑分屬于五大類中的一類，即，脂肪酸、膽汁酸、鰲合劑、表面活性劑和非表面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，8，91-192；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，71，1-33)?？砂瑏碜杂谶@些大類中一類或多類的一種或多種滲透增強(qiáng)劑。作為滲透增強(qiáng)劑的一種或多種脂肪酸和它們的衍生物包括，例如，油酸、月桂酸(C12)、癸酸(C10)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸、三癸酸、油酸單甘油酯(a.k.a.1’-單油酰基-消旋-甘油)、二月桂酸甘油酯(dilaurin)、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、?；鈮A、?；憠A、單或二甘油酯和它們的生理學(xué)可接受的鹽(即，油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉桂酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽和亞油酸鹽)(Lee等人，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems，1991，82，91-192；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，71，1-33；El-Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。一些脂肪酸的實(shí)例為癸酸鈉和月桂酸鈉，通常以濃度0.5％至5％單獨(dú)地或聯(lián)合地使用。
多種天然膽汁鹽和它們的合成性衍生物作為滲透增強(qiáng)劑發(fā)揮作用。因此，術(shù)語(yǔ)“膽汁鹽”包括膽汁天然存在的成分和任何它們的合成衍生物。膽汁鹽的實(shí)例為鵝脫氧膽酸(CDCA)和/或熊去氧膽酸(UDCA)，通常以濃度0.5％至2％使用。
可使用包含一種或多種滲透增強(qiáng)劑的復(fù)合劑型。例如，膽汁鹽可與脂肪酸聯(lián)合使用制造復(fù)合劑型。合適的聯(lián)合包括聯(lián)合CDCA與癸酸鈉或月桂酸鈉(通常0.5％至5％)。
鰲合劑包括，但不限于，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5’-甲氧基水楊酸鹽和Homovanilate)、膠原的N-?；苌?、Laureht-9和β-二酮的N-氨基?；苌?烯胺)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，82，92-192；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，71，1-33；Buur等人，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。鰲合劑具有作為DNA酶抑制物的額外優(yōu)點(diǎn)。
表面活性劑包括，例如，十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，82，92-191)；和全氟化合物乳劑，例如FC-43(Takahashi等人，J.Phare.Pharmacol.，1988，40，252-257)。
非表面活性劑包括，例如，不飽和環(huán)脲、1-烷基-和1-鏈烯基氮雜環(huán)-alkanone衍生物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，1991，82，92-191)；和非類固醇類消炎劑，例如雙氯酚酸鈉、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等人，J.Pharm.Pharntacol.，1987，39，621-626)。
“藥學(xué)可接受的載體(賦形劑)”是藥學(xué)可接受的溶劑、懸浮劑或任何其它供遞送一種或多種核酸至動(dòng)物的藥學(xué)惰性賦形劑。藥學(xué)可接受的載體可為液體或固體，并且當(dāng)與給定藥物組合物的核酸和其它成分聯(lián)合時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮施用方式進(jìn)行選擇，從而提供所希望的體積、均一性等等。一般的藥學(xué)可接受的載體包括，但不限于，結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖或其它糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、二氧化硅、膠體二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如，淀粉、淀粉甘醇酸鈉等)；或濕潤(rùn)劑(例如，十二烷基硫酸鈉等)。在美國(guó)專利4,704,295；4,556,552；4,309,406和4,309,404中描述了緩釋經(jīng)口遞送系統(tǒng)和/或經(jīng)口施用劑型的腸包衣。
本發(fā)明的組合物可額外地包含通常在藥物組合物中發(fā)下的其它附加成分，這些附加成分通常以本領(lǐng)域建立的使用水平使用。因此，例如，組合物可包含額外的相容性藥學(xué)活性物質(zhì)例如，抗瘙癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可包含用于物理上配制本發(fā)明組合物的多種劑型的額外物質(zhì)，例如，染料、矯味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，這類物質(zhì)加入時(shí)不應(yīng)當(dāng)過度干擾發(fā)明組合物中成分的生物學(xué)活性。
無論采用什么方法將發(fā)明的寡聚化合物導(dǎo)入患者，可用膠體分散系統(tǒng)作為遞送賦形劑以增強(qiáng)化合物的體內(nèi)穩(wěn)定性和/或以將化合物靶向特定的器官、組織或細(xì)胞類型。膠體分散系統(tǒng)包括，但不限于，大分子復(fù)合體、納米膠囊(nanocapsule)、微球體、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括油包水乳液、微團(tuán)、混合微團(tuán)、脂質(zhì)體和結(jié)構(gòu)未經(jīng)表征的脂寡核苷酸復(fù)合體。一種膠體分散系統(tǒng)是多種脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是微型球體，該微型球體具有由按雙層結(jié)構(gòu)組織的脂質(zhì)構(gòu)成的一個(gè)或多個(gè)外層包裹的水性核心(通常見，Chonn等人，Current Op.Biotech.，1995，6，698-708)。
發(fā)明的某些實(shí)施方案為脂質(zhì)體和其它組合物提供了一種或多種通過非反義機(jī)制發(fā)揮作用的化學(xué)治療劑。此類化學(xué)治療劑的實(shí)例包括但不限于柔紅霉素、柔毛霉素、放線菌素D、阿霉素、表阿霉素、去甲柔毛霉素、去羥阿霉素、博來霉素、麥磺磷芥、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、卡莫司汀、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、強(qiáng)的松、羥孕酮、睪酮、三苯氧胺、達(dá)卡巴嗪、甲基芐肼、六甲三聚氰胺、五甲三聚氰胺、米托蒽醌、胺苯吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、噴司他丁、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5F-U)、5-氟脫氧尿苷(5F-UdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(VP-16)、曲麥克特、伊立替康、拓?fù)涮婵?、吉西他濱、替尼泊苷、順鉑、卡鉑和己烯雌酚(DES)。通常見The Merck Manualof Diagnosis and Therapy第15版1987，第1206頁(yè)至1228頁(yè)Berkow等人編著，Rahway，N.J。當(dāng)與發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，這些化學(xué)治療劑可單獨(dú)(例如，5-FU和寡核苷酸)使用或者順序(例如5-FU和寡核苷酸持續(xù)一段時(shí)間后接著使用MTX和寡核苷酸)使用，或與一種或多種其它這樣的化學(xué)治療劑聯(lián)合(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放射治療和寡核苷酸)使用。
消炎藥，包括但不限于非類固醇消炎藥和皮質(zhì)醇和抗病毒藥，包括但不限于病毒唑、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷和更昔洛韋，這些藥物也可以與本發(fā)明的組合物聯(lián)合。通常分別The Merck Manual of Diagnosis and Therapy第15版Berkow等人編著，1987，Rahway，N.J，第2499頁(yè)至2506頁(yè)和第46頁(yè)至第49頁(yè)。其它非反義化學(xué)治療劑也在本發(fā)明范圍內(nèi)。兩種或多種聯(lián)合的化合物可一起或順序使用。
認(rèn)為治療組合物的配制和它們隨后施用是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能力范圍所及。劑量依賴于欲治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和反應(yīng)性，治療持續(xù)時(shí)間持續(xù)數(shù)日到數(shù)月，或直到實(shí)現(xiàn)治愈或疾病狀態(tài)的減輕。可通過測(cè)量患者體內(nèi)藥物積累計(jì)算出最佳給藥方案。技術(shù)人員可輕易的確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。最佳劑量根據(jù)單個(gè)的寡核苷酸的相對(duì)效力變動(dòng)，并且可依據(jù)在體外試驗(yàn)和動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)有效EC50而估計(jì)。通常，劑量為每公斤體重0.01μg至100g，并且每日、每周、每月或每年施用一次或多次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能依據(jù)經(jīng)測(cè)定藥物在體液或組織中保持時(shí)間和濃度輕易地估計(jì)給藥重復(fù)率。在成功的治療后，喜歡患者經(jīng)歷維持治療以防止疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)，其中以每公斤體重0.01μg至100g，并且每日、每周、每月或每年施用一次或多次的維持劑量施用寡核苷酸。對(duì)雙鏈化合物，必須考慮到第二鏈的增加的核酸負(fù)荷(對(duì)包含兩條分開鏈的化合物)或額外的核酸長(zhǎng)度(對(duì)具有雙鏈區(qū)域的自身互補(bǔ)的單鏈)來計(jì)算劑量。
可以多種不同方法向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入雙鏈化合物。例如，可通過微注射；以雙鏈化合物包被的微粒轟擊；將細(xì)胞浸浴在雙鏈化合物溶液中；在雙鏈化合物存在時(shí)對(duì)細(xì)胞電穿孔；雙鏈化合物的脂質(zhì)體介導(dǎo)的遞送、化學(xué)品如磷酸鈣、陰離子脂質(zhì)等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；病毒感染；轉(zhuǎn)化等施用雙鏈化合物。雙鏈化合物可與增強(qiáng)細(xì)胞攝入RNA、穩(wěn)定退火鏈、或增強(qiáng)抑制靶多核苷酸序列功能的成分一同導(dǎo)入。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)物或組織外植體，可在含有雙鏈化合物或易于進(jìn)行脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的溶液中方便地孵育細(xì)胞。
測(cè)定施用于人或動(dòng)物患者從而預(yù)防或治療與存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)有關(guān)的病理的雙鏈化合物的最佳量，以及施用含有此類雙鏈寡核苷酸的治療組合物或藥物組合物的方法在藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。人或動(dòng)物患者的給藥依賴于癥狀、病癥和疾病的性質(zhì)、受感染細(xì)胞或組織的性質(zhì)、患者的狀況、體重、一般健康、性別、飲食、時(shí)間、持續(xù)時(shí)間，和施用途徑；雙鏈化合物的吸收、分布、代謝和排泄率；與其它藥物的聯(lián)合；病理的嚴(yán)重性和正在治療的疾病狀態(tài)的反應(yīng)性。施用的雙鏈化合物的量也依賴于靶多核苷酸序列和其區(qū)域的性質(zhì)，和雙鏈化合物的性質(zhì)，并且可容易地優(yōu)化以獲得所希望的有效水平。治療的時(shí)間可持續(xù)數(shù)日至數(shù)周和數(shù)月，或直到實(shí)現(xiàn)治愈或者實(shí)現(xiàn)疾病狀態(tài)的可接受的減輕或防止?？赏ㄟ^測(cè)量患者機(jī)體內(nèi)的藥物積累和治療的有效性計(jì)算最佳給藥方案。普通技術(shù)人員可輕易確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。
盡管特別根據(jù)某些實(shí)施方案描述了本發(fā)明的實(shí)施方案，而但是下面的實(shí)施例僅用于闡明本發(fā)明而不意在限制本發(fā)明。。
實(shí)施例實(shí)施例1用于寡核苷酸合成的核苷亞磷酰胺脫氧和2’-烷氧基酰胺鹽2’-脫氧和2’-甲氧基β-氰乙基二異丙基亞磷酰胺鹽自商業(yè)來源購(gòu)得(例如，Chemgenes，Needham，MA或Glen Research，Inc.Sterling，VA)。其它2’-烷氧基取代的核苷酰胺鹽如美國(guó)專利5,506,351中所描述制備，此處引用作為參考。為使用2’-烷氧基酰胺鹽合成寡核苷酸，使用未修飾的寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)，只是在脈沖遞送四唑和堿基后的等待步驟增加至360秒。
用商業(yè)途徑可獲得的亞磷酰胺(Glen Research、Sterling VA或ChemGenes，Needham，MA)按照已公開的方法(Sanghvi等人，NucleicAcids Research，1993，21，3197-3203)合成了含有5-甲基-2’-脫氧胞苷(5-Me-C)的寡核苷酸。
2’-氟酰胺鹽2’-氟脫氧腺苷酰胺鹽如前面(Kawasaki等人，J Med.Chem.，1993，36，831-841)和美國(guó)專利5,670,633(此處引用作為參考)中所描述，合成了2’-氟寡核苷酸。簡(jiǎn)言之，使用商業(yè)途徑可獲得的9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤作為起始物質(zhì)并根據(jù)經(jīng)改進(jìn)的文獻(xiàn)方法合成N6-苯甲?；?2’-脫氧-2’-氟腺苷，其中替代2’-β-三苯甲基的SN2導(dǎo)入2’-α-氟原子。因此N6-苯甲?；?9’-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤作為3’，5’-雙四氫吡喃基(THP)中間物以中等產(chǎn)率得到選擇性保護(hù)。用標(biāo)準(zhǔn)方法完成THP和N6-苯甲?；拿摫Ｗo(hù)，并且使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得5’-二甲氧基三苯甲基-(DMT)和5’-(DMT)-3’-亞磷酰胺中間物。
2’-氟脫氧鳥苷使用受四異丙基二硅氧烷基(TPDS)保護(hù)的9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤作為起始物質(zhì)合成2’-脫氧-2’-氟鳥嘌呤，并且轉(zhuǎn)換為中間物二異丁?；⒗秽腔B嘌呤。TPDS基脫保護(hù)后，用THP保護(hù)羥基以產(chǎn)生受二異丁?；?THP保護(hù)的阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤。
選擇性O(shè)-脫酰基化和三氟化(triflation)后，以氟化物處理粗產(chǎn)物，然后脫保護(hù)THP基。使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得5’-DMT-和5’-DMT-3’-亞磷酰胺。
2’-氟尿苷通過改進(jìn)的文獻(xiàn)方法成功合成了2’-脫氧-2’-氟尿苷，該方法中用70％氟化氫-吡啶處理2，2’-脫水-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶。使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得5’-DMT-和5’-DMT-3’亞磷酰胺。
2’-氟脫氧胞苷通過2’-脫氧-2’-氟尿苷的胺化合成了2’-脫氧-2’-氟胞苷，然后選擇性保護(hù)以產(chǎn)生N4-苯甲酰基-2’-脫氧-2’-氟胞苷。使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得5’-DMT-和5’-DMT-3’亞磷酰胺。
2’-O-(2-甲氧基乙基)修飾的酰胺鹽如下或備選地，按照Martin，p.，Helvetica Chimica Acta，1995，78，486-504的方法制備2’-O-甲氧基乙基-取代的核苷酰胺鹽。
2，2’-脫水(1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿苷)將5-甲基尿苷(核糖基胸腺嘧啶，從Yamasa，Choshi，Japan商業(yè)獲得)(72.0g，0.279M)、二苯基碳酸(90.0g，0.420M)和碳酸氫鈉(2.0g，0.024M)加入DMF(300ml)。加熱混合物至形成回流，攪拌，使產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w以受控的方式釋放。1小時(shí)后，減壓濃縮稍變黑的溶液。攪拌下將得到的漿液傾入二乙醚(2.5L)。產(chǎn)物形成樹膠。傾析醚并以最小量的甲醇(約400ml)中溶解殘?jiān)⑷芤簝A入新鮮的醚中(2.5L)以產(chǎn)生堅(jiān)硬樹膠。傾析醚并在真空烘箱中干燥樹膠(在60℃，1mm Hg，24小時(shí))以產(chǎn)生固體，將該固體壓碎為淺褐色粉末(57g，85％粗產(chǎn)率)。NMR光譜與結(jié)構(gòu)相一致，該結(jié)構(gòu)混雜了苯酚鈉鹽(約5％)，該物質(zhì)以原樣用于進(jìn)一步的反應(yīng)(或可使用乙酸乙酯中甲醇梯度(10-25％)通過柱層析進(jìn)一步純化該物質(zhì)得到白色固體，熔點(diǎn)222-224℃)。
2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷將2，2’-脫水-5-甲基尿苷(195g，0.18M)，三(2-甲氧基乙基)硼酸酯(231g，0.98M)和2-甲氧基乙醇(1.2L)加入2L不銹鋼壓力容器中，并且置于預(yù)熱至160℃的油浴中。在155-160℃加熱48小時(shí)后，開啟容器并且使溶液蒸干，并且用MeOH(200ml)研制。在熱丙酮(1L)中懸浮殘?jiān)⒉蝗芙獾柠}過濾，以丙酮(150ml)洗滌，并且蒸發(fā)濾液。將殘?jiān)?280g)溶于CH3CN(600ml)并蒸發(fā)。在含有0.5％Et3NH的CH2Cl2/丙酮/MeOH(20∶5∶3)中裝填硅膠柱(3kg)。在CH2Cl2(250ml)中溶解殘?jiān)⑶椅接诙趸?150g)后加入柱上。以裝柱溶劑洗脫產(chǎn)物，產(chǎn)生160g(63％)產(chǎn)物。通過再次純化不純的級(jí)分獲得額外的物質(zhì)。
2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(160g，0.506M)與吡啶(250ml)共蒸發(fā)，并且將干燥了的殘?jiān)苡谶拎?1.3L)。加入第一等分試樣的二甲氧基三苯甲基氯(94.3g，0.278M)并在室溫下攪拌混合物一小時(shí)。加入第二等分試樣的二甲氧基三苯甲基氯(94.3g，0.278M)并再攪拌反應(yīng)物1小時(shí)。然后加入甲醇(170mL)終止反應(yīng)。HPLC表明存在約70％產(chǎn)物。蒸發(fā)溶劑并用CH3CN(200ml)研制。將殘?jiān)苡贑HCl3(1.5L)中，并且以2×500ml飽和NaHCO3和2×500ml飽和NaCl萃取，有機(jī)相用Na2SO4干燥，過濾和蒸發(fā)。獲得275g殘?jiān)Ｔ?.5kg硅膠柱上純化殘?jiān)?，該凝膠柱以含有0.5％ET3NH的EtOAc/己烷/丙酮(5∶5∶1)填充和洗脫。蒸發(fā)純的級(jí)分以產(chǎn)生164g產(chǎn)物。從不純的級(jí)分獲得額外約20g產(chǎn)物，得到總產(chǎn)量183g(57％)。
3’-O-乙?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷混合2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-尿苷(106g，0.167M)、DMF/吡啶(由562ml DMF和188ml吡啶制備的3∶1混合物750ml)和乙酸酐(24.38ml，0.258M)并在室溫下攪拌24小時(shí)。通過首先加入MeOH淬滅tlc樣品通過tlc監(jiān)視反應(yīng)。由tlc判斷反應(yīng)完成時(shí)，加入MeOH(50ml)，并在35℃蒸發(fā)混合物。殘?jiān)苡贑HCl3(800mL)，并且以2×200ml飽和碳酸氫鈉和2×200ml飽和NaCl萃取。水層以200ml CHCl3再次萃取。以硫酸鈉干燥合并的有機(jī)物并蒸發(fā)產(chǎn)生122g殘?jiān)?約90％產(chǎn)物)。殘?jiān)?.5kg硅膠柱上純化并以EtOAc/己烷(4∶1)洗脫。純的產(chǎn)物級(jí)分蒸發(fā)得到96g(84％)。從后面的級(jí)分中回收額外的1.5g產(chǎn)物。
3’-O-乙酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷將3′-O-乙?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-二-甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷(96g，0.144M)溶于CH3CN(700ml)中制備第一種溶液并備用。
將三乙胺(189ml，1.44M)加入三唑(90g，1.3M)的CH3CN(1L)溶液中，冷卻至-5℃，并且用懸掛攪拌器(overhead stirrer)攪拌0.5小時(shí)。將POCl3經(jīng)30分鐘逐滴加至維持在0-10℃的攪拌的溶液中，并且將得到的混合物額外攪拌2小時(shí)。將第一種溶液經(jīng)45分鐘逐滴加至后一溶液中。將得到的反應(yīng)混合物冷室溫中過夜貯存。將鹽從反應(yīng)混合物中過濾并且將溶液蒸發(fā)。在EtOAc(1L)中溶解殘?jiān)⑶彝ㄟ^過濾除去未溶解的固體。濾液以1×300ml NaHCO3和2×300ml飽和NaCl洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥并蒸發(fā)。殘?jiān)肊tOAc研制以產(chǎn)生標(biāo)題化合物。
2’-O-甲氧基乙基-5’-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷室溫下攪拌溶于二烷(500ml)和NH4OH(30ml)中的3′-O-乙?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷(103g，0.141M)溶液2小時(shí)。蒸發(fā)二烷溶液并且殘?jiān)cMeOH(2×200ml)共沸。殘?jiān)贛eOH(300ml)中溶解并轉(zhuǎn)移至2L不銹鋼壓力容器中。加入經(jīng)NH3氣飽和的MeOH(400ml)并且在加熱容器至100℃并保持2小時(shí)(tlc顯示完全轉(zhuǎn)化)。將容器內(nèi)容物蒸干并且將殘?jiān)贓tOAc(500ml)中溶解，并且以飽和NaCl(200ml)洗滌一次。有機(jī)物經(jīng)硫酸鈉干燥并且將溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生85g(95％)標(biāo)題化合物。
N4-苯甲?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷在DMF(800ml)中溶解2’-O-甲氧基乙基-5’-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(85g，0.134M)并且攪拌下加入苯甲酸酐(37.2g，0.165M)。在攪拌3小時(shí)后，tlc顯示反應(yīng)接近95％完成。將溶劑蒸發(fā)并且將殘?jiān)cMeOH(200ml)共沸。殘?jiān)贑HCl3(700ml)中溶解，并且以飽和NaHCO3(2×300ml)和飽和NaCl(2×300ml)萃取，經(jīng)MgSO4干燥并且蒸發(fā)產(chǎn)生殘?jiān)?96g)。以含有0.5％Et3NH的EtOAc/己烷(1∶1)作為洗脫溶劑在1.5kg硅膠柱上層析該殘?jiān)?。將純的產(chǎn)物級(jí)分蒸發(fā)產(chǎn)生90g(90％)標(biāo)題化合物。
N4-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷-3’-酰胺鹽在CH2Cl2(1L)中溶解N4-苯甲?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(74g，0.10M)。在氮環(huán)境攪拌下加入四唑二異丙基胺和2-氰基乙氧基-四(異丙基)亞磷酸酯(40.5ml，0.123M)。得到的混合物在室溫?cái)嚢?0小時(shí)(tlc顯示反應(yīng)為95％完成)。反應(yīng)混合物以飽和NaHCO3(1×300ml)和飽和NaCl(3×300ml)萃取。水性洗滌物用CH2Cl2(300mL)再次萃取，合并萃取物，經(jīng)MgSO4干燥和濃縮。用EtOAc/己烷(3∶1)作為洗脫溶劑，在1.5kg硅膠柱上層析獲得的殘?jiān)：喜⒓兗?jí)分以產(chǎn)生90.6g(87％)標(biāo)題化合物。
2’-(氨基乙氧基)核苷酰胺鹽和2’-(二甲基氨基乙氧基)核苷酰胺鹽按照美國(guó)專利6,127,533(此處引用作為參考)中的方法，制備了氫基乙氧基和二甲基氨基乙氧基酰胺鹽。
實(shí)施例2寡核苷酸合成使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)用碘氧化在自動(dòng)DNA合成儀(AppliedBiosystems model 380B)上合成未取代和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。
除了以3H-1，2-苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮1，1-二氧化物在乙腈中的0.2M溶液替代供亞磷酸鹽鍵分步硫化的標(biāo)準(zhǔn)氧化瓶以外，同合成磷酸二酯寡核苷酸一樣合成了硫代磷酸酯。硫雜化等待步驟增至68秒并且后續(xù)為加帽步驟。在將寡核苷酸從CPG柱上切割并且在55℃的濃氫氧化銨中去保護(hù)(18小時(shí))后，用0.5M NaCl溶液中的乙醇以2.5倍體積沉淀純化寡核苷酸。如美國(guó)專利5,508,270中所描述，制備了次膦酸酯寡核苷酸，將所述專利此處引用作為參考。
如美國(guó)專利4,469,863中所描述，制備了烷基膦酸酯寡核苷酸，將所述專利此處引用作為參考。
如美國(guó)專利5,610,289或5,625,050中所描述，制備了3’-脫氧-3’-亞甲基膦酸酯寡核苷酸，將所述專利此處引用作為參考。
如美國(guó)專利5,256,775或5,366,878中描述，制備了亞亞磷酰胺寡核苷酸，將所述專利此處引用作為參考。
如公布的PCT申請(qǐng)PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(各自作為WO94/17093和WO94/02499公布)中所描述，制備了烷基硫代膦酸酯寡核苷酸，此處引用作為參考。如美國(guó)專利5,476,925中所描述，制備了3’-脫氧-3’-氨基亞磷酰胺寡核苷酸，將所述專利此處引用作為參考。
如美國(guó)專利5,023,243中所描述，制備了磷酸三酯寡核苷酸，將所述專利此處引用作為參考。
如美國(guó)專利5,130,302和5,177,198中所描述，制備了硼磷酸酯(branophosphate)寡核苷酸，此處將所述專利均引用作為參考。
通過Naka等人J.Am.Chem.Soc.1227233-7243,2000和美國(guó)專利號(hào)5,639,873教導(dǎo)的方法制備了4-核糖核苷和2’-脫氧4’-核糖核苷組合物，此處將所述專利均完整的引用作為參考。
實(shí)施例3寡核苷合成如美國(guó)專利5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289中所描述，制備了亞甲基甲基亞氨基連接的寡核苷，其也確認(rèn)為MMI連接的寡核苷、亞甲基二甲基聯(lián)亞氨基寡核苷，其也確認(rèn)為MDH連接的寡核苷，以及亞甲基羰基氨基連接的寡核苷，其也確認(rèn)為酰胺-3連接的寡核苷，以及亞甲基氨基羰基連接的寡核苷，其也確認(rèn)為酰胺-4連接的寡核苷，以及具有例如，交替的MMI和P＝O或P＝S鍵的混合主鏈化合物，所有專利此處均引用作為參考。本發(fā)明的寡聚化合物也可包含混合的鍵，在混合的鍵中任何數(shù)量的兩種或多種鍵可以任何順序出現(xiàn)，并且在寡聚化合物中的任何位置出現(xiàn)，例如包含硫代磷酸酯鍵的化合物的5’一半和包含磷酸二酯鍵的3’一半。將這些化合物稱為混合的硫代磷酸酯鍵和磷酸二酯鍵。
如美國(guó)專利5,264,562和5,264,564中描述，制備了甲縮醛(formacetal)和硫代甲縮醛連接的寡核苷，將所述專利此處引用作為參考。
如美國(guó)專利5,223,618中描述，制備了環(huán)氧乙烷連接的寡核苷，將所述專利此處引用作為參考。
實(shí)施例4PNA合成根據(jù)在Peptide Nucleic Acids(PNA)Synthesis，Properties andPotential Applications，Bioorganic & Medicinal Chemistry，1996，4，5-23中提及的多種方法的任一種，制備了肽核酸(PNA)。也可根據(jù)美國(guó)專利5,539,082、5,700,922和5,719,262制備肽核酸，將所述專利此處引用作為參考。
實(shí)施例5嵌合寡核苷合成本發(fā)明的嵌合寡核苷酸、寡核苷或混合的寡核苷酸/寡核苷可具有數(shù)種不同的類型。這些類型包括第一類型，其中連接的核苷的“缺口”片段位于連接的核苷5’和3’“翼”片段之間，以及第二“開放末端”類型，其中“缺口”片段位于寡聚化合物3’末端或5’末端。第一類型寡核苷酸在本領(lǐng)域也稱作“缺口體”或帶缺口的寡核苷酸。第二類型的寡核苷酸在本領(lǐng)域也稱作“半體”或“翼體”(wingmer)。
本發(fā)明的雙鏈化合物可為數(shù)種類型，包括但不限于，siRNA、規(guī)范siRNA、平末端siRNA或發(fā)夾。啟動(dòng)RNAi反義機(jī)制的本發(fā)明的單鏈化合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些單鏈化合物包括，但不限于，ssRNAi和反義RNA(asRNA)。
(2’-O-Me)-(2’-脫氧)-(2’-O-Me)嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸如上述，用Applied Biosystems自動(dòng)DNA合成儀合成了具有2’-O-烷基硫代磷酸酯和2’-脫氧硫代磷酸酯寡核苷酸片段的嵌合寡核苷酸。用自動(dòng)合成儀和提供DNA部分的2’-脫氧-5’二甲氧基三苯甲基-3’-O-亞磷酰胺和提供經(jīng)2’-MOE修飾的核苷酸的5’-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-3’-O-亞磷酰胺合成了寡核苷酸。通過將遞送四唑和堿基后的等待步驟增加至600秒，調(diào)整了標(biāo)準(zhǔn)合成循環(huán)，所述調(diào)整對(duì)RNA重復(fù)四次，并且對(duì)2’-甲氧基重復(fù)兩次。從支持體上切除受完全保護(hù)的寡核苷酸并且在室溫下3∶1氨/乙醇中過夜去保護(hù)磷酸基，然后凍干。然后在室溫在甲醇氨中進(jìn)行處理24小時(shí)以使所有堿基脫保護(hù)并且再次凍干樣品。沉淀在THF的中1MTBAF中室溫重懸24小時(shí)以使2’位脫保護(hù)。以1M TEAA終止反應(yīng)并且將樣品在G25大小排阻柱上脫鹽之前經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減至1/2體積。然后用分光光度法分析回收的寡聚物的產(chǎn)率并且用毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜分析純度。
(2’-O-(2-甲氧基乙基))-(2’-脫氧)-(2 ’-O-(甲氧基乙基))嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸按上述對(duì)2’-甲基嵌合寡核苷酸的步驟，以2’-O-(甲氧基乙基)酰胺鹽替代2’-O-甲基酰胺鹽，制備2’-O-(2-甲氧基乙基))-(2’-脫氧)-(2’-O-(甲氧基乙基))嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸。
(2’-O-(2-甲氧基乙基)磷酸二酯)-(2’-脫氧硫代磷酸酯)-(2’-O-(2-甲氧基乙基)磷酸二酯)嵌合寡核苷酸按上述對(duì)2’-O-甲基嵌合寡核苷酸的步驟，以2’-O-(甲氧基乙基)酰胺鹽替代2’-O-甲基酰胺鹽，制備(2’-O-(2-甲氧基乙基磷酸二酯)-(2’-脫氧硫代磷酸酯)-(2’-O-(甲氧基乙基)磷酸二酯)嵌合寡核苷酸，使用碘氧化以在嵌合結(jié)構(gòu)的翼部分生成磷酸二酯核苷酸間鍵并且用3H-1，2苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮1，1二氧化物(Beaucage Reagent)進(jìn)行硫化以便為中心缺口生成硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
其它嵌合寡核苷酸、嵌合寡核苷和混合的嵌合寡核苷酸/寡核苷根據(jù)美國(guó)專利5,623,065合成，此處引用作為參考。
RNA合成通常，RNA合成化學(xué)以在策略性中間反應(yīng)中選擇性摻入多種保護(hù)基。雖然本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解保護(hù)基在有機(jī)合成中的用途，一類有用的保護(hù)基包括甲硅烷基醚。特別地使用大體積的甲硅烷基醚保護(hù)5’羥基與用酸不穩(wěn)定原酸酯保護(hù)基保護(hù)2’羥基。以標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)使用這套保護(hù)基。重要的是在所有其它合成步驟后最后除去酸不穩(wěn)定原酸酯基。而且在合成期間，甲硅烷基保護(hù)基早期使用確保了當(dāng)需要時(shí)方便的去除而沒有2’羥基的不希望的脫保護(hù)。
按照這種依次保護(hù)5’羥基同時(shí)用經(jīng)差異性移去并且具有不同化學(xué)穩(wěn)定性的保護(hù)基保護(hù)2’羥基的方法，合成了RNA寡核苷酸。
以逐步方式合成RNA寡核苷酸。向固相支持體結(jié)合的寡核苷酸依次(3’至5’方向)加入每一種核苷酸。在鏈3’末端的第一個(gè)核苷共價(jià)結(jié)合在固相支持體上。加入核苷酸前體，核苷亞磷酰胺和激活劑，將第二個(gè)堿基偶聯(lián)至第一個(gè)核苷的5’末端。洗滌支持體并且將任何未反應(yīng)的5’羥基用乙酸酐加帽以產(chǎn)生5’-乙酰基部分。然后將該鍵氧化為更為穩(wěn)定并且是最后所希望的P(V)鍵。在核苷酸加入循環(huán)結(jié)束時(shí)，以氟化物切除5’甲硅烷基。對(duì)每一個(gè)隨后的核苷酸重復(fù)該循環(huán)。
合成后，使用DMF中的1M 2-氨甲?；?2-氰基乙烯基-1，1-二硫醇二鈉鹽(S2Na2)三水合物切割磷酸酯上的甲基保護(hù)基。用水從固相支持體結(jié)合的寡核苷酸洗去脫保護(hù)溶液。然后支持體用40％甲胺水溶液55℃處理10分鐘。這將使RNA寡核苷酸釋放至溶液中，脫保護(hù)外向環(huán)胺，并且修飾2’基團(tuán)。在此階段可用陰離子交換HPLC分析寡核苷酸。
最后一個(gè)除去的保護(hù)基是2’原酸酯基。由Dharmacon Research，Inc.(Lafayette.Co)開發(fā)的乙二醇單乙酯原酸酯保護(hù)基是一個(gè)有用的原酸酯保護(hù)基實(shí)例，其具有如下的重要性質(zhì)。它對(duì)合成核苷亞磷酰胺和合成寡核苷酸的條件穩(wěn)定。然而，在寡核苷酸合成后，用甲胺處理寡核苷酸既從固相支持體上切除寡核苷酸又從原酸酯上除去了乙?；?。得到的在原酸酯上的2-乙基-羥基取代基的吸電子力比乙酰基化的前體低。因此，經(jīng)修飾的原酸酯變得對(duì)酸催化的水解更為不穩(wěn)定。特別指出，在除去乙?；螅懈钏俾始涌旒s10倍。因此這種原酸酯具有足夠穩(wěn)定性以便與寡核苷酸合成相容，并且當(dāng)隨后修飾后，容許在與最后RNA寡核苷酸產(chǎn)物相容的相對(duì)溫和的水性條件下實(shí)施脫保護(hù)。
此外，RNA合成方法為本領(lǐng)域公知(Scaringe，S.A.Ph.D.Thesis，University of Colorado，1996；Scaringe，S.A.等人，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，11820-11821；Matteucci，M.D.和Caruthers，M.H.，J Am.Chem.Soc.，1981，103，3185-3191；Beaucage，S.L和Caruthers，M.H.，Tetrahedron Lett.，1981，22，1859-1862；Dahl，B.J.等人，ActaChem.Scand.，1990，44，639-641；Reddy，M.P.等人，Tetrahedropa Lett.，1994，25，4311-4314；Wincott，F(xiàn).等人，Nucleic AcidsRes.，1995，23，2677-2684；Griffin，B.E.等人，Tetrahedron，1967，23，2301-2313；Griffin，B.E.等人，Tetrahedron，1967，23，2315-2331)。
本發(fā)明的RNA反義化合物(RNA寡核苷酸，無論單鏈或雙鏈)可通過此處的方法合成或從Dharmacon Research，Inc.(Lafayette.Co)購(gòu)買。一旦合成，即可用本領(lǐng)域所知的方法將互補(bǔ)的RNA反義化合物復(fù)性，形成雙鏈(雙鏈體化)反義化合物。例如，將RNA寡核苷酸的每條互補(bǔ)鏈(50μM RNA寡核苷酸溶液)各30μl與15μl 5×復(fù)性緩沖液(100mM乙酸鉀，30mM HEPES-KOH pH7.4，2mM乙酸鎂)混合后90℃加熱1分鐘，然后37℃1小時(shí)。得到的雙鏈體反義化合物可用于試劑盒、鑒定、篩選或用于研究靶核酸功能，或診斷或治療目的其它方法。
實(shí)施例6寡核苷酸分離在將寡核苷酸或寡核苷從受控的孔玻璃柱(Applied Biosystems)上切割并且在濃氫氧化銨中55℃脫保護(hù)18小時(shí)后，通過2.5體積的乙醇沉淀兩次純化寡核苷酸或寡核苷。在變性凝膠上用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析所合成的寡核苷酸，并且判斷為至少85％全長(zhǎng)物質(zhì)。在合成中得到的硫代磷酸酯和磷酸二酯鍵的相對(duì)量通過31P核磁共振光譜定期檢測(cè)。并且對(duì)于某些研究，用HPLC純化寡核苷酸，如Chiang等人，J.Biol.Chem.1991，266，18162-18171所描述。經(jīng)HPLC純化的物質(zhì)得到的結(jié)果與未經(jīng)HPLC純化的物質(zhì)得到的結(jié)果相似。
實(shí)施例7寡核苷合成-96孔板形式在能夠同時(shí)組裝96條序列的自動(dòng)化合成儀上按標(biāo)準(zhǔn)96孔形式通過固相P(III)亞磷酰胺化學(xué)合成寡核苷酸。通過水性碘氧化提供了磷酸二酯核苷酸間鍵。通過使用無水乙腈中的3，H-1，2苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮1，1二氧化物(Beaucage Reagent)硫化，生成了硫代磷酸酯核苷酸間鍵。自供貨商(例如PE-Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，或Pharmacia，Piscataway，NJ)購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)的受堿基保護(hù)的β-氰基乙基二丙基亞磷酰胺。
按已知文獻(xiàn)中或申請(qǐng)專利的方法制備非標(biāo)準(zhǔn)的核苷。它們用作堿基受保護(hù)的β-氰基乙基二丙基亞磷酰胺。
將寡核苷酸從支持體上切除并在升高的溫度(55-60℃)下以濃NH4OH脫保護(hù)12-16小時(shí)，并且真空干燥釋放的產(chǎn)物。然后將經(jīng)干燥的產(chǎn)物在無μ菌水中重新懸浮以提供主平板，然后用機(jī)器人加樣器稀釋主平板的所有分析性樣品和測(cè)試平板樣品。
實(shí)施例8寡核苷酸分析-96孔板形式每一孔中的寡核苷酸的濃度通過樣品稀釋和UV吸收光譜估計(jì)。在96孔形式(Beckman P/ACEJ MDQ)中以毛細(xì)管電泳(CE)，或?qū)为?dú)制備的樣品，在商業(yè)CE裝置(例如，Beckman P/ACEJ 5000，ABI 270)中評(píng)估單個(gè)產(chǎn)物的全長(zhǎng)完整性。使用電噴質(zhì)譜經(jīng)化合物的質(zhì)量分析確定堿基和主鏈組成。所有試驗(yàn)測(cè)試平板都用單通道或多通道機(jī)器人加樣器從主平板中稀釋。若平板中至少85％的化合物為至少85％全長(zhǎng)，則判斷該平板為可接受的。
實(shí)施例9細(xì)胞培養(yǎng)和寡核苷酸治療可在多種細(xì)胞類型的任一種中檢測(cè)反義化合物對(duì)靶核酸表達(dá)的影響，條件是靶核酸以可測(cè)量的水平存在?？墒褂茫鏟CR或RNA印跡分析常規(guī)地測(cè)定這種影響。為闡明的目的提供了下述細(xì)胞類型，但是可常規(guī)地使用其它細(xì)胞類型。
MCF7從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)得到人乳腺癌細(xì)胞系MCF7。在補(bǔ)充了10％胎牛血清(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)的低糖DMEM(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)中常規(guī)培養(yǎng)MCF7細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約90％匯合時(shí)，通過胰蛋白酶消化并稀釋常規(guī)地傳代細(xì)胞。以約7000個(gè)細(xì)胞/孔的密度在96孔板(Falcon-Primaria #3872)中接種細(xì)胞供用于RT-PCR分析。對(duì)RNA印跡或其它分析，可將細(xì)胞接種于100mm或其它標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板上并使用適合體積的培養(yǎng)基和寡核苷酸進(jìn)行類似的處理。
HeLa細(xì)胞從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)得到人上皮樣癌細(xì)胞系HeLa。在補(bǔ)充了10％胎牛血清(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的高糖DMEM(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中常規(guī)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約90％匯合時(shí)，通過胰蛋白酶消化并稀釋常規(guī)地傳代細(xì)胞。以約50,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度在24孔板(Falcon-Primaria #3846)中培養(yǎng)細(xì)胞或以約5,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度在96孔細(xì)板中培養(yǎng)細(xì)胞供用于RT-PCR分析。對(duì)于RNA印跡或其它分析，在細(xì)胞達(dá)到約90％匯合時(shí)，收獲細(xì)胞。
U-87MG細(xì)胞從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)得到人成角質(zhì)細(xì)胞瘤U-87MG細(xì)胞系。在補(bǔ)充了10％胎牛血清(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)和抗生素的DMEM(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中培養(yǎng)U-87MG細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到適合的匯合時(shí)，通過胰蛋白酶消化并稀釋常規(guī)地傳代細(xì)胞。以約10,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度在96孔板(Falcon-Primaria #3872)中接種細(xì)胞供用于RT-PCR分析。
對(duì)于RNA印跡或其它分析，可將細(xì)胞接種于100mm或其它標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)板中并使用合適體積的培養(yǎng)基和寡核苷酸進(jìn)行類似的處理。對(duì)于RNA印跡或其它分析，可將細(xì)胞接種于100mm或其它標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)板中并進(jìn)行類似的處理，使用合適體積的培養(yǎng)基和寡核苷酸類似地處理。
HUVEC細(xì)胞HUVEC細(xì)胞得自ATCC并在補(bǔ)充了SingleQuots補(bǔ)充物的EBM(Clonetics Corp，Walkersille，MD)中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％匯合時(shí)，以胰蛋白酶消化和稀釋常規(guī)傳代，將細(xì)胞保持多達(dá)15次傳代。對(duì)生長(zhǎng)在96孔板中的細(xì)胞(10,000個(gè)細(xì)胞/孔)，將孔以200μl OPTI-MEM-1TM減血清的培養(yǎng)基(Gibco BRL)洗滌一次，然后以130μl含12μg/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1TM和終濃度為25nM所希望的雙鏈化合物處理。在處理5小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基。dsRNA處理16小時(shí)后收獲細(xì)胞，在此時(shí)分離RNA并且以RT-PCR測(cè)量靶標(biāo)的減少。
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％匯合時(shí)，細(xì)胞以寡核苷酸處理。對(duì)生長(zhǎng)在96孔板中的細(xì)胞，將孔以200μl OPTI-MEM-1減血清的培養(yǎng)基(Gibco BRL)洗滌一次，然后以130μl含3.75μg/ml LIPOFECTIN(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1和終濃度為150nM所希望的雙鏈化合物處理。對(duì)dsRNA化合物，使用2×130μl OPTI-MEM-1。在處理4小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基。寡核苷酸處理16小時(shí)后，收獲細(xì)胞。所用的寡核苷酸濃度在細(xì)胞系之間不同。為測(cè)定特定細(xì)胞系的最佳寡核苷酸濃度，細(xì)胞以一系列濃度的陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸處理。對(duì)人細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照RNA酶H寡核苷酸為ISIS 13920，TCCGTCATCGCTCCTCAGGG，SEQ ID NO1，該陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸為具有靶向人H-ras的硫代磷酸酯主鏈的2′-O-甲氧基乙基缺口體(粗體顯示2′-O-甲氧基乙基)。對(duì)小鼠或大鼠細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸為ISIS 15770，ATGCATTCTGCCCCCAAGGA，SEQ ID NO2，該陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸為具有靶向小鼠和大鼠二者c-raf的硫代磷酸酯主鏈的2′-O-甲氧基乙基缺口體(粗體顯示2′-O-甲氧基乙基)。然后使用導(dǎo)致H-ras(ISIS 13920)或c-raf(ISIS 15770)mRNA 80％抑制的陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸濃度作為在該細(xì)胞系的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中新的寡核苷酸的篩選濃度。若未達(dá)到80％抑制，使用導(dǎo)致H-ras或c-raf mRNA 60％抑制的陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸的最低濃度作為在該細(xì)胞系的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中寡核苷酸篩選濃度。若未達(dá)到60％抑制，認(rèn)為這個(gè)特定細(xì)胞系不適合寡核苷酸轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例10存活蛋白表達(dá)的寡核苷酸抑制的分析可以本領(lǐng)域公知的多種方法測(cè)定存活蛋白表達(dá)的反義調(diào)節(jié)。例如，可通過例如，RNA印跡分析、競(jìng)爭(zhēng)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或?qū)崟r(shí)PCR(RT-PCR)定量存活蛋白的mRNA水平。目前優(yōu)選實(shí)時(shí)定量PCR。可用總細(xì)胞RNA或Poly(A)+mRNA進(jìn)行RNA分析。在例如1993年Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，pp.4.1.1-4.2.9和4.5.1-4.5.3，John Wiley & Sons，Inc.中教導(dǎo)了分離RNA的方法。RNA印跡分析在本領(lǐng)域內(nèi)為常規(guī)并且在例如，1996年Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，pp.4.2.1-4.2.9，JohnWiley & Sons，Inc.中教導(dǎo)。可用商業(yè)途徑可獲得的ABI PRISM 7700Sequence Detection System方便地完成實(shí)時(shí)定量(PCR)，從PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA可獲得該系統(tǒng)并且根據(jù)制造商說明使用。其它PCR方法也為本領(lǐng)域公知。
可用本領(lǐng)域公知的多種方法定量存活蛋白的水平，所述方法為例如免疫沉淀、蛋白質(zhì)印跡分析(免疫印跡)、ELISA或熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)?？设b定并從多個(gè)來源，例如MSRS抗體目錄(Aerie Corporation，Birmingham，MI)獲得或由常規(guī)抗體產(chǎn)生方法制備針對(duì)存活蛋白的抗體。在例如，1997年Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，第2卷，pp.11.12.1-11.12.9，John Wiley & Sons，Inc.中教導(dǎo)了制備多克隆抗血清的方法。在1997年Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，第2卷，pp.11.4.1-11.11.5，John Wiley& Sons，Inc.中教導(dǎo)了單克隆抗體的制備。
免疫沉淀方法是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的，并且可在例如1998年Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Volume 2，pp.10.16.1-10.16.11，John Wiley & Sons，Inc.，中發(fā)現(xiàn)。蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)分析是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的，并且可在例如1997年Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，第2卷，pp.10.8.1-10.8.21，John Wiley& Sons，Inc.中發(fā)現(xiàn)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的，并且可在例如1991年Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，第2卷，pp.11.2.1-11.2.22，John Wiley & Sons，Inc.中發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例11Poly(A)+mRNA分離根據(jù)Miura等人，Clin.Chem.，1996，42，1758-1764分離了Poly(A)+mRNA。在例如1993年Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，第1卷，pp.4.5.1-4.5.3，John Wiley & Sons，Inc.中教導(dǎo)了分離Poly(A)+mRNA的其它方法。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于生長(zhǎng)在96孔板中的細(xì)胞，從細(xì)胞除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基并以200μl冷PBS洗滌每孔。每孔加入60μl裂解緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.6，1mM EDTA，0.5M NaCl，0.5％NP-40，20mM氧釩基核糖核苷絡(luò)合物)，溫和攪拌平板并在室溫溫育5分鐘。將55μl裂解物轉(zhuǎn)移至Oligo d(T)包被的96孔板(AGCT Inc.，Irvine CA)。平板在室溫溫育60分鐘，以200μl洗滌緩沖液(10mM Tris-ClpH7.6，1mM EDTA，0.3M NaCl)洗滌3次。在終末洗滌后，在紙巾上沾吸平板，然后空氣干燥5分鐘。每孔加入60μl預(yù)熱到70℃的洗脫緩沖液(5mM Tris-Cl pH7.6)，該平板在90℃熱平板上溫育5分鐘，并且將洗脫物轉(zhuǎn)移到新的96孔平板中。
使用適合體積的所有溶液，在100mm或其它標(biāo)準(zhǔn)板上類似生長(zhǎng)的細(xì)胞。
實(shí)施例12總RNA分離用購(gòu)自Qiagen，Inc.(Valencia，CA)的RNEASY 96試劑盒和緩沖液，并按照制造商推薦的方法分離總RNA。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于生長(zhǎng)在96孔板中的細(xì)胞，從細(xì)胞除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基并以200μl冷PBS洗滌每孔。每孔加入RLT緩沖液100μl并且將平板劇烈攪動(dòng)20秒。然后每孔加入100μl70％乙醇并且內(nèi)容物經(jīng)上下三次吹吸混合。然后將樣品轉(zhuǎn)移到RNEASY 96孔平板，其與安裝了廢棄物收集盤并且連接了真空源的QIAVAC歧管相連。應(yīng)用真空15秒。向RNEASY 96孔平板的每孔加入1ml RW1緩沖液并且再應(yīng)用真空15秒。然后RNEASY 96孔平板的每孔加入1ml RPE緩沖液并且應(yīng)用真空15秒。然后重復(fù)緩沖液RPE洗滌并且額外的應(yīng)用真空10分鐘。然后平板從QIAVAC歧管移去并且在紙巾上沾吸干。然后重新將平板與裝配了含有1.2ml收集管的收集管架的QIAVAC歧管連接。然后通過向每一孔中移液60μl水并孵育1分鐘，并且應(yīng)用真空30秒洗脫RNA?？捎妙~外60μl水重復(fù)洗脫步驟。
實(shí)施例13實(shí)時(shí)定量PCR分析存活蛋白mRNA水平使用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)根據(jù)制造商說明以實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定存活蛋白mRNA水平的量。該系統(tǒng)是密閉管封、基于非凝膠的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，可允許實(shí)時(shí)高通量地定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物。與其中擴(kuò)增產(chǎn)物在PCR完成后定量的標(biāo)準(zhǔn)PCR相反，實(shí)時(shí)定量PCR中產(chǎn)物在它們積累時(shí)即被定量。這種定量通過在PCR反應(yīng)中包含可與正向和反向PCR引物之間特異性復(fù)性并且包含兩種熒光染料的寡核苷酸探針而實(shí)現(xiàn)。報(bào)告分子染料(例如，從Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA獲得的JOE或FAM)附著在探針的5’末端并且猝滅劑染料(例如，從Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或PE-Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA獲得的TAMRA)附著在探針的3’末端。當(dāng)探針和染料完整時(shí)，3’猝滅劑染料的接近猝滅了報(bào)告分子染料的發(fā)射。在擴(kuò)增期間，探針與靶序列的退火產(chǎn)生了可由Taq聚合酶的5’外切核酸酶活性切割的底物。在PCR擴(kuò)增循環(huán)延伸期期間，Taq聚合酶對(duì)探針的切割將報(bào)告分子染料從探針的剩余部分(并且因此從猝滅劑部分)釋放并產(chǎn)生序列特異熒光信號(hào)。隨每個(gè)循環(huán)，額外的報(bào)告分子染料分子從它們各自的探針中切割下來，并且由嵌入ABI PRISM 7700 SequenceDetection System的激光光學(xué)元件以規(guī)則(六秒)間隔監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。在每次測(cè)定中，含有來自未經(jīng)處理的對(duì)照樣品RNA系列稀釋物的一系列平行反應(yīng)生成了標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量測(cè)試樣品經(jīng)反義寡核苷酸處理后的抑制百分率。
自PE-Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA獲得PCR試劑。通過向含有25μl Poly(A)mRNA溶液的96孔板加入25μl PCR混合物(1×TAQMAN緩沖液A，5.5mM MgCl2，dATP、dCTP和dGTP各300uM，600uM dUTP，正向引物、反向引物和探針各100nM、20單位RNA酶抑制物、1.25單位AMPLITAQ GOLD和12.5單位MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶)。經(jīng)48℃溫育30分鐘實(shí)施RT反應(yīng)。隨后95℃溫育10分鐘以激活A(yù)MPLITAQGOLD，實(shí)施兩步法PCR方案的40個(gè)循環(huán)95℃15秒(變性)，隨后為60℃1.5分鐘(復(fù)性/延伸)。使用已公布的序列信息(GenBank登錄號(hào)U75285，此處引用作為SEQ ID NO3)設(shè)計(jì)針對(duì)人存活蛋白的探針和引物與人存活蛋白序列雜交。對(duì)于人存活蛋白，PCR引物為正向引物AAGGACCACCGCATCTCTACA(SEQ ID NO4)反向引物CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT(SEQ ID NO5)，并且PCR探針為FAM-CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA(SEQ ID NO6)其中FAM(PE-Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)為熒光報(bào)告分子染料，TAMRA(PE-Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)為猝滅劑染料。對(duì)于人GAPDH，PCR引物為正向引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO7)反向引物GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO8)，并且PCR探針為5′JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3′(SEQID NO9)其中JOE(PE-Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)為熒光報(bào)告分子染料，TAMRA(PE-Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)為猝滅劑染料。
實(shí)施例14蛋白質(zhì)印跡法分析存活蛋白水平用標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施蛋白質(zhì)印跡分析(免疫印跡分析)。細(xì)胞在寡核苷酸處理16-20小時(shí)后收獲，以PBS洗滌一次，懸浮于Laemmli緩沖液(100μl/孔)，煮沸5分鐘并且在16％SDS-PAGE凝膠中上樣。凝膠在150V下運(yùn)行1.5小時(shí)，并轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)印跡膜。使用針對(duì)存活蛋白的適合的一級(jí)抗體，并使用針對(duì)一級(jí)抗體種類的放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體。用PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)顯示帶。
實(shí)施例15設(shè)計(jì)和篩選靶向存活蛋白的雙鏈反義化合物(siRNA)根據(jù)本發(fā)明，可設(shè)計(jì)一系列包含本發(fā)明反義化合物和它們的互補(bǔ)物的雙鏈寡聚化合物(siRNA)以靶向存活蛋白。如此處所述，雙鏈體反義鏈的核堿基序列包含靶向存活蛋白的寡核苷酸的至少一部分。鏈的末端可通過加入一個(gè)或多個(gè)天然的或經(jīng)修飾的核堿基修飾以形成突出端進(jìn)行修飾。然后將dsRNA的有義鏈設(shè)計(jì)和合成為與反義鏈互補(bǔ)并且也在兩末端之一包含修飾或附加。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA雙鏈體的兩條鏈將與中央的核堿基互補(bǔ)，每條鏈在一個(gè)末端或兩個(gè)末端具有突出端。
例如，含有具備序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ ID NO10)并且具有脫氧胸苷的雙核堿基突出端的反義鏈的雙鏈體將具有如下結(jié)構(gòu)cgagaggcggacgggaccgTT反義(SEQ ID NO11)TT gctctccgcctgccctggc互補(bǔ)(SEQ ID NO12)如所示，這種雙鏈化合物代表規(guī)范siRNA。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，如所示，可制備具有平末端的含有相同序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ ID NO10)的反義鏈的雙鏈體cgagaggcggacgggaccg反義(SEQ ID NO10)gctctccgcctgccctggc互補(bǔ)(SEQ IN NO13)如所示，這種雙鏈化合物代表平末端siRNA。
雙鏈體RNA鏈可通過此處公開的方法合成或從Dharmacon ResearchInc.，(Lafayette，CO)購(gòu)買。一旦合成，即將互補(bǔ)鏈復(fù)性。將單鏈等分試樣并稀釋為50μM濃度。一旦稀釋，即將每條鏈各30μl與15μl復(fù)性緩沖液5×溶液混合。所述緩沖液終濃度為100mM乙酸鉀、30mMHEPES-KOH pH7.4和2mM乙酸鎂。終體積為75μl。將該溶液90℃溫育1分鐘，然后離心15秒。將管在37℃放置1小時(shí)后在實(shí)驗(yàn)中使用雙鏈體。dsRNA雙鏈體終濃度為20μM?？蓪⑦@種溶液冷凍(-20℃)貯存并且凍融達(dá)5次。
雙鏈體反義化合物(siRNA)一經(jīng)制備，即可按照此處所述方案評(píng)估它們調(diào)節(jié)存活蛋白表達(dá)的能力。
細(xì)胞培養(yǎng)條件、體外測(cè)定dsRNA IC50值IC50
通過將多種濃度的dsRNA與表現(xiàn)出與存活蛋白表達(dá)或過度表達(dá)相關(guān)的病理的合適細(xì)胞系、組織或器官在體外接觸，并且測(cè)定在這些濃度的dsRNA對(duì)包括，但不限于，存活蛋白病理或致病機(jī)理的多個(gè)步驟、階段或方面諸參數(shù)的定量影響，可測(cè)定本發(fā)明的dsRNA體外IC50?？裳芯康拇硇詤?shù)包括，例如，存活蛋白mRNA的翻譯或存活蛋白的合成；對(duì)替代標(biāo)記物的影響或體外可方便測(cè)量的指示潛在dsRNA治療效果的任何其它參數(shù)。
在現(xiàn)有技術(shù)條件下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員有可能采用現(xiàn)有的基于細(xì)胞的測(cè)定法，或開發(fā)全新的體外測(cè)定法以不過過度實(shí)驗(yàn)來測(cè)定此處公開的dsRNA的IC50值。
蛋白質(zhì)印跡對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，在10cm組織培養(yǎng)皿(Falcon，#3003)中以7.5×105個(gè)細(xì)胞/皿的密度平鋪細(xì)胞。對(duì)于RT-PCR分析，按1×104個(gè)細(xì)胞/孔平鋪96孔板(Corning Incorporated，#3596)。在3μl/ml OPTIMEM減血清培養(yǎng)基(Gibco/Invitrogen)/100nM siRNA雙鏈體的濃度下使用Lipofectin(GIBCO/Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑。在加入siRNA之前，Lipofectin試劑與OPTIMEM培養(yǎng)基溫育30分鐘。加入所希望量的siRNA并混合。進(jìn)一步在OPTIMEM中實(shí)施1∶1稀釋。細(xì)胞以1×磷酸緩沖鹽水洗滌兩次然后以O(shè)PTIMEM中的siRNA/Lipofectin混合物處理。在溫育4小時(shí)后，以完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代OPTIMEM培養(yǎng)基。在額外16-20小時(shí)后收獲細(xì)胞供蛋白質(zhì)印跡或RT-PCR分析。
在溫育期結(jié)束時(shí)，除去培養(yǎng)基并且細(xì)胞以PBS洗滌兩次。通過將緩沖液直接加入平板，在加入CompleteTMMini蛋白酶抑制物片劑(Roche，#1836153)以及1mM原釩酸鈉(Sigma)的RIPA緩沖液(20mMTris-HCI，pH7.4、5mM EDTA、50mM NaCl、10mM焦磷酸鈉、50mM氟化鈉和1％Nonidet P40)中裂解細(xì)胞。以刮取法收集裂解物，轉(zhuǎn)移到微量離心管并且在4℃以14,000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘清除細(xì)胞碎片。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑(Pierce)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。總細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至Immobilon-P膜(Millipore，#IPVH091)。用針對(duì)存活蛋白的一級(jí)抗體(R & D Systems，#AF886)和針對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的一級(jí)抗體(Sigma，#A5441)檢測(cè)膜。用辣根過氧化物酶連接的抗兔Ig和抗鼠Ig抗體(Pharmacia)作為二級(jí)抗體。通過用SuperSigmal West Pico化學(xué)發(fā)光試劑(Pierce)溫育膜5分鐘，使抗原抗體復(fù)合物顯現(xiàn)，隨后用配置了冷CCD照相機(jī)的Fluor-S成像儀(Biorad)捕獲化學(xué)發(fā)光。用Quantity One軟件(Biorad)定量每份樣品的目的蛋白質(zhì)帶。通過比較樣品的存活蛋白/肌動(dòng)蛋白比率與未處理對(duì)照的存活蛋白/肌動(dòng)蛋白比率計(jì)算每份樣品的抑制百分率。用Graph Pad Prism軟件(GraphPad Software)經(jīng)抑制百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)的非線性回歸分析得到IC50。
RNA分離按推薦的方案(Qiagen)用RNeasy96試劑盒分離總RNA。簡(jiǎn)而言之，在除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，細(xì)胞以200μl冷PBS洗滌。洗滌后，加入RLT緩沖液100μl，將平板劇烈振蕩約20秒。向每孔加入100μl 70％乙醇并且將內(nèi)容物上下三次吹吸混合。然后將樣品應(yīng)用于置于QIAvac歧管的QIAvac頂部基座中的RNeasy96平板孔，QIAvac歧管連接真空源。應(yīng)用真空30秒或直至轉(zhuǎn)移完成。每孔加入80μl DNA酶I溫育混合物(20mM Tris-HCl，pH8.4，2mM MgCl2，50mM KCl和來自Invitrogen的225單位/ml DNA酶I)并且在室溫溫育30分鐘。加入緩沖液RW1(1ml/孔)并且應(yīng)用真空30秒。每孔加入RPE緩沖液(1ml/孔)并且應(yīng)用真空30秒。洗滌步驟用緩沖液RW1和RPE再次重復(fù)。然后平板從歧管除去并在紙巾上沾吸。然后平板放回QIAvac歧管并且應(yīng)用真空10分鐘。為洗脫RNA，直接向每孔的膜上加入30μl無RNA酶的水，溫育1分鐘并且應(yīng)用真空30秒。為最大限度回收總RNA，洗脫步驟用額外的每孔30μl無RNA酶的水重復(fù)。
存活的定量通過使用ABI PRISM7900序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)的實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定存活蛋白和GAPDH mRNA水平的定量。向具有10μl總RNA的96孔板中加入15μl TaqMan One Step PCR Master Mix(AppliedBiosystems，#4309169)試劑(含正向引物和反向引物各100nM，以及200nM探針)實(shí)施RT-PCR。對(duì)人存活蛋白，正向PCR引物為5′GCACCACTTCCAGGGTTTATTC3′(SEQ ID NO186)，反向引物為5′TCTCCTTTCCTAAGACATTGCTAAGG3′(SEQ ID NO187)。所用的存活蛋白TaqMan探針是5′(FAM)TGGTGCCACCAGCCTTCCTGTG3′(SEQ ID NO188)(BiosearehTechnologies，Inc.)。實(shí)施例15至最后的全部實(shí)驗(yàn)均使用針對(duì)SEQ ID No14設(shè)計(jì)的該引物-探針組。對(duì)人GAPDA，使用Taq Man GAPDH ControlReagent Kit(Applied Biosystems，#402869)。通過比較樣品的存活蛋白/GADPH的mRNA比率與未處理對(duì)照的存活蛋白/GADPH的mRNA比率計(jì)算每份樣品的抑制百分率。用GraphPad Prism軟件(GraphPadSoftware)經(jīng)抑制百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)的非線性回歸分析得到IC50。
實(shí)施例16設(shè)計(jì)表型試驗(yàn)和體內(nèi)研究存活蛋白抑制物的用途表型試驗(yàn)一旦通過此處公開的方法已經(jīng)鑒定靶向存活蛋白的活性寡聚化合物，在一個(gè)或多個(gè)表型試驗(yàn)中進(jìn)一步研究該化合物，每一個(gè)試驗(yàn)具有指示特定疾病狀態(tài)或病癥的治療功效的的可度量的終點(diǎn)。
表型試驗(yàn)、試劑盒和供其用途的試劑為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知，并且此處用于研究存活蛋白在健康和疾病中的作用和/或關(guān)系。可從數(shù)家商業(yè)供貨商中的任何一家購(gòu)買的代表性表型試驗(yàn)包括那些測(cè)定細(xì)胞生存力、細(xì)胞毒性、增殖或細(xì)胞存活的試驗(yàn)(Molecular Probes，Eugene，OR；PerkinElmer，Boston，MA)、以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的試驗(yàn)包括酶試驗(yàn)(Panvera，LLC，Madison，WI；BD Bioseiences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ；OncogeneResearch Products，San Diego，CA)、細(xì)胞調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥、氧化過程和凋亡(Assay Designs Inc.，Ann Arbor，MI)、甘油三酯積累(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、血管發(fā)生試驗(yàn)、管形成試驗(yàn)、細(xì)胞因子和激素試驗(yàn)和代謝試驗(yàn)(Chemicon InternationalInc.，Temecula，CA；AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。
在一個(gè)非限定性實(shí)例中，用體外研究鑒定的存活蛋白抑制物和經(jīng)上述方法測(cè)定的最佳濃度的對(duì)照化合物處理經(jīng)測(cè)定適合于特定表型試驗(yàn)的細(xì)胞(例如，挑選用于乳腺癌研究的MCF-7細(xì)胞、肥胖研究的脂肪細(xì)胞)。在治療期結(jié)束時(shí)，通過對(duì)測(cè)定表型結(jié)果和終點(diǎn)的試驗(yàn)特異的一種或多種方法分析了經(jīng)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞。
表型終點(diǎn)包括細(xì)胞形式隨時(shí)間或治療劑量的變化或細(xì)胞成分例如蛋白質(zhì)、脂類、核酸、激素、糖類或金屬水平的變化。包括pH、細(xì)胞周期階段、細(xì)胞攝入或排出生物學(xué)指示物的細(xì)胞狀態(tài)的測(cè)量也是目標(biāo)終點(diǎn)。
處理后細(xì)胞的基因型的分析(測(cè)量細(xì)胞的一種或多種基因的表達(dá))也用作存活蛋白抑制物的功效和效力的指示物。在經(jīng)處理或未經(jīng)處理的細(xì)胞中測(cè)量了特征基因，或那些懷疑與特定的疾病狀態(tài)、病癥或表型相關(guān)的基因。
實(shí)施例17雙鏈RNA(dsRNA)對(duì)人存活蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計(jì)了包含本發(fā)明的反義化合物和它們的互補(bǔ)物的一系列雙鏈寡聚化合物以靶向存活蛋白mRNA。將dsRNA的有義鏈設(shè)計(jì)并且合成為反義鏈的反向互補(bǔ)物，它們的名單在表1中顯示。在HeLa細(xì)胞中評(píng)估寡聚化合物。用于HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)方法見于例如，www.atcc.org。
對(duì)于生長(zhǎng)在96孔板的細(xì)胞，以200μl OPTI-MEM-1TM減少血清的培養(yǎng)基(Gibco BRL)洗滌孔一次，然后以130μl含有12μg/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1TM和終濃度為25nM所希望的dsRNA處理。在處理5小時(shí)后，以新鮮培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基。dsRNA處理16小時(shí)后收獲細(xì)胞，在這個(gè)時(shí)候如上所述，分離RNA并且用RT-PCR測(cè)量靶標(biāo)減少。
表1顯示了dsRNA寡聚化合物的反義序列。在處理HeLa細(xì)胞之前，根據(jù)實(shí)施例16中描述的方法，通過反義和有義鏈的復(fù)性生成dsRNA寡聚體。靶位點(diǎn)由第一個(gè)(5’最)核苷酸編號(hào)顯示，如在序列源(參考Genbank登錄號(hào)NM 001168.1，此處引用作為SEQ ID NO14)所給出，dsRNA寡核苷酸反義鏈結(jié)合所述靶位點(diǎn)。
表1中所有化合物為dsRNA，長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸，首先按5’至3’方向列出反義鏈(頂部鏈)，并且其次也按5’至3’方向列出有義鏈(底部鏈)。所有核苷為核糖并且主鏈鍵為磷酸酯(P＝O)?！鞍形稽c(diǎn)”指反義鏈所靶向的存活蛋白mRNA中靶區(qū)域的最5’位置。
如此處所述通過實(shí)時(shí)定量PCR獲得了數(shù)據(jù)。以靶向人存活蛋白mRNA的雙鏈寡聚化合物(由于它們各自有義鏈雜交的反義鏈)處理HeLa細(xì)胞。
表1dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平
除了ISIS 339046、339047、339053、339065、339068和339072之外的所有dsRNA化合物均表現(xiàn)了超過45％的存活蛋白表達(dá)抑制。
在劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，如此處其它實(shí)施例中所述，用按每100nM寡核苷酸混合了3μg/ml LIPOFECTIN的所指示的寡核苷酸1.1nM、3.3nM、10nM和30nM處理HeLa細(xì)胞。未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。在處理16小時(shí)后，從細(xì)胞制備RNA供隨后的實(shí)時(shí)PCR分析。
用實(shí)時(shí)PCR定量人存活蛋白mRNA表達(dá)水平并且如此處其它實(shí)施例中所描述，用Ribogreen歸一化基因靶標(biāo)量。數(shù)據(jù)為來自兩次實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)并且在表2中顯示。
雙鏈體兩條鏈的身份由下劃線分開顯示，首先顯示反義鏈(反義鏈_有義鏈)。
表2dsRNA寡聚化合物對(duì)人存活蛋白mRNA水平的抑制劑量反應(yīng)
如表2所顯示，受試化合物以濃度依賴方式抑制HeLa細(xì)胞中人存活蛋白mRNA的表達(dá)。
實(shí)施例18具有5’-磷酸酯帽的雙鏈RNA(dsRNA)對(duì)人存活蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計(jì)了包含示于表1中(ISIS 339045-339073)中、均帶有5’末端磷酸酯基修飾的反義化合物和其互補(bǔ)物的一系列雙鏈寡聚化合物以靶向存活蛋白mRNA。對(duì)應(yīng)的dsRNA化合物為ISIS 341201-341229(表3)。將dsRNA有義鏈設(shè)計(jì)并且合成為反義鏈的反向互補(bǔ)物，它們的名單在表2中顯示。在HeLa細(xì)胞中評(píng)估寡聚化合物。用于HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)方法見于例如，www.atcc.org。
對(duì)于生長(zhǎng)在96孔板的細(xì)胞，以200μl OPTI-MEM-1TM減少血清的培養(yǎng)基(Gibco BRL)洗滌一次，然后以130μl含有12μg/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1TM和終濃度為25nM所希望的dsRNA處理。在處理5小時(shí)后，以新鮮培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基。dsRNA處理16小時(shí)后收獲細(xì)胞，此時(shí)如上所描述，分離RNA并且用RT-PCR測(cè)量靶標(biāo)減少。
表3中顯示了dsRNA寡聚化合物。在處理HeLa細(xì)胞之前，根據(jù)實(shí)施例17中所述方法，通過反義和有義鏈的復(fù)性生成dsRNA寡聚體。靶位點(diǎn)由第一個(gè)(5’最)核苷酸編號(hào)顯示，如序列源參考(Genbank登錄號(hào)NM_001168.1，此處引用作為SEQ ID NO14)所給出，該dsRNA寡核苷酸反義鏈結(jié)合靶位點(diǎn)。
表3中所有化合物均為寡核苷酸，長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸，首先列出反義鏈，并且其次列出有義鏈(底部鏈)，兩者均按5’至3’方向。表3中的化合物具有磷酸酯(P＝O)主鏈鍵并且在每條鏈中也包含了末端5’磷酸酯帽。表3中的化合物為平末端siRNA。
如此處其它實(shí)施例中所描述，通過實(shí)時(shí)定量PCR獲得了數(shù)據(jù)。以靶向人存活蛋白mRNA的雙鏈寡聚化合物處理HeLa細(xì)胞。
表3具有55’磷酸酯帽的dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平
除了ISIS 341203、341209、341221、341224和341225之外的所有dsRNA化合物均表現(xiàn)出大于40％存活蛋白表達(dá)抑制。這些數(shù)據(jù)表明在某些靶位點(diǎn)，具有5’磷酸酯的雙鏈化合物在抑制存活蛋白表達(dá)方面表現(xiàn)了更強(qiáng)的效力(比較表1和3)。
實(shí)施例19比較靶向存活蛋白mRNA相同位點(diǎn)的siRNA構(gòu)建體根據(jù)本發(fā)明，研究了ISIS 339048序列改變對(duì)HeLa細(xì)胞中人存活蛋白mRNA抑制的影響。ISIS 343867(5′-UUUGAAAAUGUUGAUCUCC-3′SEQ ID NO81)是平末端siRNA的反義鏈，結(jié)合至與ISIS 339048所結(jié)合的存活蛋白mRNA的相同位點(diǎn)。差異在于ISIS 343867是缺少ISIS339048的5’末端腺嘌呤的19聚體化合物。SIS341881(UUUGAAAAUGUUGAUCUCCTT；SEQ ID NO82)是規(guī)范siRNA反義鏈，結(jié)合至與ISIS 339048所結(jié)合的存活蛋白mRNA的相同位點(diǎn)。差異在于ISIS 341881在3’末端含有dTdT(脫氧胸苷-脫氧胸苷)(“dTdT”突出端”)。SIS 343868具有序列5’-GGAGAUCAACAUUUUCAAA-3’(SEQ IDNO83)，并且是對(duì)應(yīng)于ISIS343867的有義鏈。ISIS 341880(SEQ ID NO84)是對(duì)應(yīng)于ISIS341881的有義鏈。在表4中顯示了構(gòu)建體，首先顯示反義鏈，隨后為有義鏈，兩者都為5’至3’方向。在表4中顯示了存活蛋白siRNA構(gòu)建體的序列，并且劑量反應(yīng)結(jié)果在表5中顯示。
表4在HeLa細(xì)胞中以劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試siRNA構(gòu)建體對(duì)人存活蛋白mRNA表達(dá)的抑制
表5靶向存活蛋白mRNA相同位點(diǎn)的siRNA寡聚化合物對(duì)人存活蛋白mRNA水平的抑制劑量反應(yīng)
如表5中所顯示，經(jīng)測(cè)試的化合物以劑量依賴方式抑制HeLa細(xì)胞中人存活蛋白mRNA表達(dá)。ISIS 343867和ISIS 341881在幾乎最低的劑量下更為有效地抑制存活蛋白mRNA水平，提示平末端的19聚體siRNA或在3’末端帶有dTdT修飾的規(guī)范的21聚體siRNA可能是最初平末端20聚體siRNA ISIS 339048的有利修飾物。
這三種化合物的IC50值(nM)如下平末端siRNA(20聚體)339048_339078，0.28nM；平末端siRNA(19聚體)343867_343868，0.19 nM和規(guī)范siRNA 341881_341880，0.15nM將IC50定義為與未處理對(duì)照比較，導(dǎo)致mRNA(或蛋白)表達(dá)50％抑制的寡聚化合物的濃度。由這些數(shù)據(jù)顯示，規(guī)范siRNA和平末端siRNA(19聚體)二者的表現(xiàn)均比平末端siRNA(20聚體)好得多。
靶向人存活蛋白的額外的平末端構(gòu)建體經(jīng)修飾的化合物
設(shè)計(jì)了靶向人存活蛋白(GenBank登錄號(hào)NM_01168.1；SEQ ID NO14)的一系列siRNA化合物并且以5’至3’方向在表6中顯示。
表6靶向人存活蛋白的siRNA化合物
在表6中序列的修飾如下ISIS 346272全部為核糖，全部為P＝O鍵。
ISIS 346279-346281、346286、346287全部為P＝S鍵。
ISIS 346282-346284、346289和346290交替為P＝O/P＝S鍵，以P＝O開始。
ISIS 346291、346292、346294、346295和346296；交替為P＝S/P＝O鍵；以P＝S開始。
ISIS 348310全部是核糖，具有P＝O主鏈。
ISIS 352505在5、8、11、14和17-19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主鏈。
ISIS 352506在6、7、10、11和17-19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主鏈。
ISIS 352507在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主鏈。
ISIS 352508在5、8、11和14位置上是2′-MOE；在17-19位置上是2′-O-甲基。P＝O主鏈。
ISIS 352509在4、9和18位置上是2′-MOE。P＝O主鏈。
ISIS 352510在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位置上是2′-MOE。P＝O主鏈。
ISIS 352511在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上是2′-MOE。P＝O主鏈。
ISIS 352512在每個(gè)位置上是2′-O-甲基，P＝O主鏈。
ISIS 352513在2-18位置上是2′-O-甲基。P＝O主鏈。
ISIS 352514在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上是2′-MOE，P＝O主鏈。
ISIS 352515在15-19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主鏈。
ISIS 352516在1-7鍵是P＝S連接體，在8-18鍵是P＝O連接體。
ISIS 353537在1-3和17-19位置上是4′-硫代核糖，P＝O主鏈。
ISIS 353538在3、9、12和17-19位置上是4′-硫代核糖，P＝O主鏈。
ISIS 353539在1-3、9和12位置上是4′-硫代核糖；在17-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主鏈。
ISIS 353540在1-3位置上是4′-硫代核糖；在17-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主鏈。
ISIS 355710在1-5位置上是2′-ara-氟-2 ′-脫氧核糖；在15-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主鏈。
ISIS 355711在1-5、8、9和12-16位置上是2′-ara-氟-2′-脫氧核糖；在6、7、10、11和17-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主鏈。
ISIS 355712在5、8、11、14位置上是LNA，在17-19上是2′-O-甲基。P＝O主鏈。
ISIS 355713交替的2′-O-甲基核糖/2′-ara-氟-2′-脫氧核糖，在位置1上以2′OMe開始。P＝O主鏈。
ISIS 355714交替的2′-O-甲基核糖/2′-ara-氟-2′-脫氧核糖，在位置1上以2′-ara-氟開始。P＝O主鏈。
ISIS 355715在4、9、18位置上是LNA。P＝O主鏈。
ISIS 355716在1、2、6、11、20位置上是LNA。P＝O主鏈。
實(shí)施例20通過單鏈RNAi化合物調(diào)節(jié)人存活蛋白表達(dá)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HBVEC)中評(píng)估了一系列單鏈寡聚化合物(asRNA)抑制人存活蛋白的能力。用于HBVEC的培養(yǎng)方法見于例如，www.atcc.org。
表7中顯示了asRNA寡聚化合物的序列。靶位點(diǎn)由最前端第一個(gè)(5’最)核苷酸編號(hào)顯示，如在序列源參考(Genbank登錄號(hào)NM 001168.1，此處引用作為SEQ ID NO14)所給出，asRNA寡核苷酸結(jié)合該靶位點(diǎn)。
在表7中的所有化合物均為寡核糖核苷酸，長(zhǎng)度為20核苷酸，具有全程的硫代磷酸酯主鏈鍵，并且在5’末端具有末端磷酸酯，并且所有化合物均以5’至3’方向描繪。
如此處其它實(shí)施例中所述，通過實(shí)時(shí)定量PCR獲得了數(shù)據(jù)。
表7通過asRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平
如表7中所顯示，所有asRNA化合物均表現(xiàn)了至少40％存活蛋白表達(dá)的抑制。
實(shí)施例21使用針對(duì)人存活蛋白的dsRNA構(gòu)建體抑制HeLa細(xì)胞中存活蛋白mRNA的表達(dá)如以上所述，在HeLa細(xì)胞中使用人存活蛋白引物-探針對(duì)(SEQ ID186-188)測(cè)試了多種dsRNA構(gòu)建體以測(cè)定在19聚體ISIS 343867(SEQ IDNO81)，20聚體339048(SEQ ID NO23)中的PS取代效應(yīng)，以及測(cè)定2′-O-甲基(2′-OMe)，2′-氟基(2′-F)，2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)和4′-硫(4′-S)化學(xué)的效應(yīng)。在表8和9中顯示了結(jié)果。第一個(gè)ISIS編號(hào)為反義鏈，第二個(gè)ISIS編號(hào)為有義鏈。
表8平末端siRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平在19聚體中的PS取代效應(yīng)
這些數(shù)據(jù)顯示表明19聚體平端磷酸二酯siRNA在抑制存活蛋白表達(dá)方面更有效，并且具有低于為其20聚體對(duì)等相應(yīng)物IC50的10倍1/10的IC50(比較行A和行B)。而且，當(dāng)主鏈鍵全部為硫代磷酸酯鍵替代時(shí)，測(cè)試的化合物喪失以IC50所測(cè)量的提高的效力喪失了。然而，減少靶減少的能力仍然維持(比較行A和行BC)。
同時(shí)也表明將磷酸二酯鍵以交替出現(xiàn)重新引入反義鏈中導(dǎo)致功效恢復(fù)，如通過降低的IC50值所測(cè)量，但是不能達(dá)到全部P＝O主鏈的水平(比較行D和行H)。
最后，當(dāng)每一條鏈中交替的磷酸二酯/硫代磷酸酯鍵以相反對(duì)齊(一條鏈中P＝O，相反另一條鏈中為P＝S)時(shí)對(duì)IC50值和表達(dá)水平具有最強(qiáng)的影響，獲得比天然最佳的構(gòu)建體更好的值(比較行I和行A)。
表9平末端siRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平在20聚體中的PS取狀效應(yīng)
這些數(shù)據(jù)表明，與19聚體相比，平末端的20聚體對(duì)兩條鏈中的硫代磷酸酯主鏈修飾具有更強(qiáng)的耐受性，全部P＝S的20聚體的IC50值兩條鏈中全部P＝O的20聚體的IC50值相當(dāng)(比較行B和C)。然而，兩種構(gòu)建體均未達(dá)到用19聚體觀察到的IC50值(比較行B和C與行A)。
令人驚奇地，相反對(duì)齊的(一條鏈中P＝O，相反另一條鏈中為P＝S)交替核苷酸間鍵能夠降低IC50至用19聚體天然P＝O構(gòu)建體觀察到的IC50(比較行I和A)。
糖的化學(xué)修飾的效應(yīng)設(shè)計(jì)了一系列平末端siRNA以研究糖修飾對(duì)雙鏈化合物抑制人存活蛋白mRNA表達(dá)能力的影響。如此處其它實(shí)施例中所述，在HeLa細(xì)胞中實(shí)施了研究，并且通過RT-PCR測(cè)定mRNA水平、如下為對(duì)化合物的修飾ISIS 352511包含在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上的2′-O-甲基修飾(下劃線)。
ISIS 352512在每個(gè)2’位點(diǎn)上包含2′-O-甲基修飾(下劃線)。
ISIS 355714包含在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位置上2′氟基修飾(粗體)；并且在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上包含2′-O-甲基修飾。
ISIS 352514在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上包含交替的2′-MOE修飾。
所有其它化合物為天然RNA化合物。在表10中顯示結(jié)果。
表10通過siRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平糖修飾的影響
這些數(shù)據(jù)表明含有2’氟和2’OMe交替基序的雙鏈化合物是抑制人存活蛋白表達(dá)的最佳構(gòu)建體。
實(shí)施例22使用針對(duì)人存活蛋白的dsRNA構(gòu)建體在HeLa細(xì)胞中的劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)在劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，如此處其它實(shí)施例中所述，用每100nM寡核苷酸混合了3μg/ml LIPOFECTIN的所指示的dsRNA寡核苷酸0.02、0.2、2.0和20.0nM處理HeLa細(xì)胞。未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。在處理16小時(shí)后，從細(xì)胞制備RNA供隨后實(shí)時(shí)PCR分析。
用實(shí)時(shí)PCR定量人存活蛋白mRNA表達(dá)水平并且如此處其它實(shí)施例中所描述，用Ribogreen歸一化基因靶量。數(shù)據(jù)為來自兩次實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)并且在表11中顯示。首先顯示反義鏈的Isis編號(hào)，然后為有義鏈的Isis編號(hào)(反義_有義)。
表11dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平劑量反應(yīng)
如表11中所顯示，眾多dsRNA化合物以劑量依賴方式抑制人存活蛋白mRNA在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)實(shí)施例23使用針對(duì)人存活蛋白的dsRNA構(gòu)建體在HeLa細(xì)胞中的劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)在劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，如此處其它實(shí)施例中所描述，用每100nM寡核苷酸混合了3μg/ml LIPOFECTIN的所指示的寡核苷酸0.014nM、0.04nM、0.12nM、0.37nM、1.11nM、3.33nM、10nM和30nM處理HeLa細(xì)胞。未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。在處理16小時(shí)后，從細(xì)胞制備RNA供隨后實(shí)時(shí)PCR分析。
用實(shí)時(shí)PCR定量人存活蛋自mRNA表達(dá)水平并且如此處其它實(shí)施例中所描述，用Ribogreen歸一化基因靶量。數(shù)據(jù)為來自兩次實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)并且在表12中顯示。首先顯示反義鏈的Isis編號(hào)，然后為有義鏈的Isis編號(hào)(反義_有義)。
表12dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平劑量反應(yīng)
如表12中所顯示，多數(shù)dsRNA化合物以劑量依賴方式抑制在HeLa細(xì)胞中人存活蛋白mRNA的表達(dá)實(shí)施例24在U-87MG細(xì)胞中劑量依賴性抑制存活蛋白mRNA表達(dá)用上述的方法在U-87MG細(xì)胞中測(cè)試了雙鏈化合物抑制人存活蛋白mRNA表達(dá)的能力。在0.0019nM、0.0096nM、0.048nM、0.24nM、1.2nM、6.0nM、30.0nM和150.0nM濃度下，測(cè)試了多種靶向人存活蛋白的dsRNA構(gòu)建體。結(jié)果總結(jié)于表13中。首先顯示反義鏈的Isis編號(hào)，然后為有義鏈的Isis編號(hào)(反義_有義)表13dsRNA化合物劑量依賴性抑制人存活蛋白mRNA表達(dá)。
如表13中所顯示，多數(shù)dsRNA化合物以劑量依賴形式抑制U-87MG細(xì)胞中人存活蛋白mRNA的表達(dá)。
實(shí)施例25規(guī)范siRNA寡核苷酸抑制存活蛋白設(shè)計(jì)了一系列靶向人存活蛋白的規(guī)范siRNA。對(duì)存活蛋白特異并且如下所描述的dsRNA諸序列中的每條序列包含RNA寡核苷酸雙鏈體(未顯示)每條鏈的3’末端端兩個(gè)脫氧胸苷核苷酸。由Dharmacon Research Inc實(shí)施基因特異性siRNA的合成、雙鏈體形成及純化。在表中，“位置”指dsRNA反義鏈結(jié)合的基因位置。將表中的每條序列這樣列出使得反義鏈(頂部鏈)按5’至3’方向書寫；其互補(bǔ)有義鏈(底部鏈)也按5’至3’方向書寫。
表14設(shè)計(jì)靶向人存活蛋白的規(guī)范siRNA寡核苷酸
當(dāng)用上述的RT-PCR和定量蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法測(cè)試存活蛋白mRNA的抑制時(shí)，化合物U17、U20、U23、U36、U48和U54表現(xiàn)出低于100nM的IC50。
在定量RT-PCR分析和蛋白質(zhì)印跡分析中化合物U17都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的活性，并且因此特別優(yōu)選用于本文描述的適應(yīng)癥。
實(shí)施例26靶向存活蛋白的額外的雙鏈化合物的IC50值表15和16匯總了使用多種dsRNA并使用這里所述方法得到的IC50值。測(cè)試的構(gòu)建體包含5’至3’方向的反義鏈，和5’至3’方向的有義鏈。在表15中，“D”為劑量反應(yīng)(mRNA水平)，“W”為蛋白質(zhì)印跡。所有核苷間鍵均為磷酸二酯，除非標(biāo)注了指示硫代磷酸酯鍵的小寫“s”。
表15靶向人存活蛋白的dsRNA構(gòu)建體的IC50數(shù)據(jù)
表16針對(duì)人存活蛋白的dsRNA的IC50值
實(shí)施例27在人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植模型中測(cè)量抗腫瘤活性在本領(lǐng)域公知的動(dòng)物模型中測(cè)試了此處所述一種或多種寡聚化合物，包括dsRNA化合物的抗腫瘤活性。兩種此類動(dòng)物模型為(1)U-87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植腫瘤模型(Kiaris H，Schally AV，Varga JL，Antagonists of growth hormone-releasing hormone inhibit the growth ofU-87MG human glioblastoma in nude mice Neoplasia。2000 May-Jun；2(3)242-50)和YUSAC-2人黑素瘤異種移植腫瘤模型(Grossman D，KimPJ，Schechner JS，Altieri DC，Inhibition of melanoma tumor growth invivo by survivin targeting.Proc Natl Acad Sci USA.2001 Jan 16；98(2)635-40)。每組使用共計(jì)10CD1 nu/nu(Charles River)小鼠。為了移植，腫瘤細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，在PBS中洗滌，并且在PBS中以6×107個(gè)細(xì)胞/ml(U-87MG)重懸浮和在DMEM中以4×107個(gè)細(xì)胞/ml(YUSAC-2)重懸浮。僅僅在植入前，照射動(dòng)物(450TBI)并且在Matrigel(1∶1)中混合細(xì)胞。在左后肋中皮下(s.c.)注射在0.2ml體積中的總計(jì)6×106個(gè)腫瘤細(xì)胞(U-87MG)和4×106(YUSAC-2)個(gè)腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞植入3天后，開始以測(cè)試寡聚化合物(在0.9％NaCl中溶解，注射級(jí))或錯(cuò)配的對(duì)照寡核苷酸(在0.9％NaCl中溶解)或賦形劑(0.9％NaCl)治療。對(duì)于U-87MG研究，將0.2ml體積的化合物每隔一天共約12劑腹膜內(nèi)(i.p)施用；對(duì)于YUSAC-2研究，將0.2ml體積的化合物每隔一天共約13劑靜脈內(nèi)(i.v)施用。每星期兩次測(cè)量腫瘤長(zhǎng)度和寬度，用式腫瘤體積＝(L×W2)×0.536計(jì)算腫瘤體積。以腫瘤體積對(duì)每個(gè)治療組腫瘤植入后的天數(shù)作圖。
當(dāng)與用賦形劑或25mg/kg錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸治療的攜帶腫瘤的動(dòng)物相比時(shí)，一種或多種寡聚化合物的治療延緩了人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和黑素瘤的生長(zhǎng)。
實(shí)施例28在小鼠血漿中交替的2’-O-甲基/2’-氟siRNA構(gòu)建體的穩(wěn)定性用類似以前所描述的那些方法(Leeds，J.M.，等人，1996，Anal.Biochem.，235，36-43；Geary，R.S.等人，1999，Anal.Biochem.，274，241-248)的提取和毛細(xì)管電泳方法分析了來自經(jīng)稀釋的小鼠血漿的完整雙鏈體RNA。來自于3-6個(gè)月齡的雌性Balb/c(Charles River Labs)小鼠的經(jīng)肝素處理的小鼠血清從-80℃解凍，并且以磷酸緩沖鹽水(140mM NaCl，3mM KCl，2mM磷酸鉀，10mM磷酸鈉)稀釋至25％(v/v)。將濃度為1001μM的約10nmol預(yù)復(fù)性的siRNA加至25％血漿中，并且在37℃溫育0、15、30、45、60、120、180、240、360和420分鐘。在指示的時(shí)間取出等分試樣，以EDTA處理至終濃度為2mM，并且在0℃的冰上放置直至通過毛細(xì)管凝膠電泳(Beckman P/ACE MDQ-UV，具有eCap DNACapillary tube)分析。測(cè)量siRNA雙鏈體峰的面積并且用來計(jì)算剩余的完整siRNA百分率。將濃度為2.5mM的腺苷三磷酸(ATP)加入每次的注射液中作為內(nèi)部校正標(biāo)準(zhǔn)。零時(shí)間點(diǎn)取自在磷酸緩沖鹽水中稀釋siRNA隨后毛細(xì)管電泳時(shí)。將完整siRNA百分率對(duì)時(shí)間作圖，以便計(jì)算假一級(jí)半壽期。在表17中顯示結(jié)果。
表17在小鼠血漿中交替2’-O-甲基/2’-氟平端siRNA構(gòu)建體的穩(wěn)定性
反義鏈ISIS 353538在3、8、11、17-19位置上包含4′硫修飾，并且與未經(jīng)修飾的有義RNA鏈配對(duì)。
反義鏈ISIS 355713包含對(duì)糖的交替2′O甲基/2′F修飾并且與具有交替的2′F/2′O甲基修飾的有義鏈配對(duì)。所述交替修飾為相反對(duì)齊，反義鏈在1位上經(jīng)2’Ome修飾而有義鏈在1位經(jīng)2’F修飾。明顯地，交替的2′-O-甲基/2′-氟構(gòu)建體保持相對(duì)未變并且在血清中穩(wěn)定。
根據(jù)前面的描述，除此處所描述那些方案以外，本發(fā)明的多種修改方案對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。這些修改方案也將落入附帶的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本申請(qǐng)中引用的每篇文獻(xiàn)在本文中全文引用作為參考。
序列表<110>ISIS藥物公司伊萊利利公司<120>存活蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)<130>ISIS0134-500WO(BIOL0042WO)<160>233<170>FastSEQ for Windows版本4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>1tccgtcatcg ctcctcaggg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>2atgcattctg cccccaagga 20<210>3<211>14796<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人(H.sapien)<400>3tctagacatg cggatatatt caagctgggc acagcacagc agccccaccc caggcagctt 60gaaatcagag ctggggtcca aagggaccac accccgaggg actgtgtggg ggtcggggca 120cacaggccac tgcttccccc cgtctttctc agccattcct gaagtcagcc tcactctgct 180tctcagggat ttcaaatgtg cagagactct ggcacttttg tagaagcccc ttctggtcct 240aacttacacc tggatgctgt ggggctgcag ctgctgctcg ggctcgggag gatgctgggg 300gcccggtgcc catgagcttt tgaagctcct ggaactcggt tttgagggtg ttcaggtcca 360ggtggacacc tgggctgtcc ttgtccatgc atttgatgac attgtgtgca gaagtgaaaa 420ggagttaggc cgggcatgct ggcttatgcc tgtaatccca gcactttggg aggctgaggc 480
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<223>寡聚化合物
<400>123cugugcucu guuuugucu 19<210>124<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>124agacaaaaca ggagcacag19<210>125<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>125guggcaccag aggugcuuc 19<210>126<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>126gaagcaccuc uggugccac19<210>127<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>127gaaggcagug ucccuuuug19<210>128<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>128caaaagggacc acugccuuc 19<210>129<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>129gaugcaugac uugugugug 19<210>130<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>130cacacacaag ucaugcauc 19<210>131<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>131uggagacaga gucccuggc 19<210>132<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>132gccagggacu cugucucca 19<210>133<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<100>133cauggcuuucc uuauuuugu 19<210>134<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>134acaaaauaag aaagccaug 19<210>135<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>135auguuaauuc acagaauag 19<210>136<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>136cuauucugug aauuaacaa 19<210>137<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>137cuacaauuaa aacuaagca 19<210>138<211>19
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>138ugcuuaguuu uaauuguag 19<210>139<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>139acuaaagcaca aagccauuc19<210>140<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>140gaauggcuuu gugcuuagu 19<210>141<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>141uagagugaua ggaagcguc 19<210>142<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>142gacgcuuccu aucaacucua19
<210>143<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>143gcgucuggca gauacuccu 19<210>144<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>144aggaguaucu gccagacgc 19<210>145<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>145aaggcagugg ccuaaaucc 19<210>146<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>146ggauuuaggc cacugccuu 19<210>147<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>147
ggcaguggccuaaauccuu 19<210>148<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>148aaggauuuag gccacugcc 19<210>149<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>149augacuuggc ucgaugcug19<210>150<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>150cagcaucgag ccaagucau19<210>151<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>151ccuucacauc ugucacguu19<210>152<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>152aacgugacag augugaagg 19<210> 153<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>153uucacagaau agcacaaac 19<210> 154<211>19<212> RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>154guuugugcua uucugugaa 19<210>155<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>155gccugcaccc cggagcgga 19<210>156<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>156uccgcuccgg ggugcaggc 19<210>157<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<400>157cauaaaaagc auucguccg 19<210>158<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>158cggacgaaug cuuuuuaug 19<210>159<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>159agcagcuggc ugccaugga 19<210>160<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>160uccauggcag ccagcugcu 19<210>161<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>161gcugcaccac uuccagggu 19<210>162<211>19<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>162acccuggaag uggugcagc 19<210>163<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>163uucccuggug ccaccagcc 19<210>164<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>164ggcugguggc accagggaa 19<210>165<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>165ugggccccuu agcaauguc 19<210>166<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>166gacauugcua aggggccca 19<210>167
<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>167aggaaaggag aucaacauu 19<210>168<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>168aauguugauc uccuuuccu 19<210>169<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>169uuagauguuu caacugugc 19<210>170<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>170gcacaguuga aacaucuaa 19<210>171<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>171caguuggcugc uucucucuc19
<210>172<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>172gagagagaag cagccacug 19<210>173<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>173cucauuuuug cuguuuuga 19<210>174<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>174ucaaaacagc aaaaaugag 19<210>175<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>175uguucgcgug ggcagagcc 19<210>176<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>176ggcucugccc acgcgaaca 19<210>177<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>177ugugucugga ccucauguu 19<210>178<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>178aacaugaggu ccagacaca 19<210>179<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>179cacaguccug aguguggac 19<210>180<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>180guccacacuc aggacugug 19<210>181<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>181uggacuuggc aggugccug 19<210>182<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>182caggcaccug ccaagucca 19<210>183<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>183ucugagcugc agguuccuu 19<210>184<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>184aaggaaccug cagcucaga 19<210>185<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>185gugccuccuc agaggacag 19<210>186<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<400>186cuguccucug aggaggcac 19<210>187<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>187guuguugugu uuuuuuguu 19<210>188<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>188aacaaaaaaa cacaacaac 19<210>189<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>189acuaagcaca aagccauuc 19<210>190<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<100>190gaauggcuuu gugcuuagu 19<210>191<211>19
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>191gccauucuaa gucauuggg 19<210>192<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>192cccaaugacu uagaauggc 19<210>193<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>193gucauugggg aaacggggu 19<210>194<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>194accccguuuc cccaaugac 19<210>195<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>195cggggugaac uucaggugg19
<210>196<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>196ccaccugaag uucaccccg 19<210>197<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>197gcccccugcc uggcagccc 19<210>198<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>198gggcugccag gcagggggc 19<210>199<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>199guccgcccag guccccgcu 19<210>200<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>200
agcggggacc ugggcggac 19<210>201<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>201gucuggcgua agaugaugg 19<210>202<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<100>202ccaucauucuu acgccagac19<210>203<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>203gaugauggau uugauucgc 19<210>204<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>204gcgaaucaaa uccaucauc 19<210>205<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>205ccucuggagg ucaucucgg 19<210>206<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>206ccgagaugac cuccagagg19<210>207<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>207auuugaaucg cgggacccg 19<210>208<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>208cgggucccgc gauucaaau 19<210>209<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>209cggcaugggu gccccgacg 19<210>210<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<400>210cgucggggca cccaugccg 19<210>211<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>211ggcccagugu uucuucugc 19<210>212<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>212gcagaagaaa cacugggcc 19<210>213<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>213ugcagcgggu gcugcuggu 19<210>214<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>214accagcagca cccgcugca 19<210>215<211>19<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>215accaggugag aagugaggg 19<210>216<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>216cccucacuuc ucaccuggu 19<210>217<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>217uugccacugc ugugugauu 19<210>218<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>218aaucacacag caguggcaa 19<210>219<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>219cuggccgcuc cucccucag 19<210>220
<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>220cugagggagg agcggccag 19<210>221<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>221cccagugagc cgcggggca 19<210>222<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>222ugccccgcgg cucacuggg 19<210>223<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>223gcugcaggcc gugugucug 19<210>224<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>224cagacacacg gccugcagc 19
<210>225<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>225cauagagcug cagggugga 19<210>226<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>226uccacccugc agcucuaug 19<210>227<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>227auuguuacag cuucgcugg 19<210>228<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>228ccagcgaagc uguaacaau 19<210>229<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>229agaaauaaaa agccuguca 19<210>230<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>230ugacaggcuu uuuauuucu 19<210>231<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>231gcaccacttc cagggtttat tc 22<210>232<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>232tctcctttcc taagacattg ctaagg 26<210>233<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR探針<400>233tggtgccacc agccttcctg tg 2權(quán)利要求
1.具有第一鏈和第二鏈的雙鏈化合物，其中所述第一鏈與編碼人存活蛋白(SEQ ID NO14)的核酸分子互補(bǔ)；所述第二鏈與所述第一鏈互補(bǔ)；所述第一鏈和第二鏈每條鏈長(zhǎng)度為8-80個(gè)核堿基；并且該雙鏈化合物抑制人存活蛋白的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，其中所述鏈的一條或兩條鏈長(zhǎng)度為10-50個(gè)核堿基。
3.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，其中所述鏈的一條或兩條鏈長(zhǎng)度為12-30個(gè)核堿基。
4.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，其中所述鏈的一條或兩條鏈長(zhǎng)度為12-24個(gè)核堿基。
5.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，其中所述鏈的一條或兩條鏈長(zhǎng)度為19-23個(gè)核堿基。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的雙鏈化合物，其中第一鏈和編碼人存活蛋白的核酸分子之間的互補(bǔ)性為至少70％。
7.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的雙鏈化合物，其中第一鏈和編碼人存活蛋白的核酸分子之間的互補(bǔ)性為至少80％。
8.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的雙鏈化合物，其中第一鏈和編碼人存活蛋白的核酸分子之間的互補(bǔ)性為至少90％。
9.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的雙鏈化合物，其中第一鏈和編碼人存活蛋白的核酸分子之間的互補(bǔ)性為至少95％。
10.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，其中第一鏈鍵合第二鏈。
11.權(quán)利要求10的雙鏈化合物，其中鍵為共價(jià)的。
12.權(quán)利要求10的雙鏈化合物，其中鍵經(jīng)由核酸連接體。
13.權(quán)利要求10的雙鏈化合物，其中兩條鏈為自身互補(bǔ)的并且形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
14.權(quán)利要求5的雙鏈化合物，該雙鏈化合物為siRNA，其中所述siRNA包含所述第一和第二鏈之間的中央互補(bǔ)部分和在所述第一和第二鏈之間任選地互補(bǔ)的末端部分。
15.權(quán)利要求14的siRNA，其中末端部分是位于每條鏈的3’或5’末端的長(zhǎng)度為1-6個(gè)核堿基的突出端。
16.權(quán)利要求14的siRNA，該siRNA為規(guī)范siRNA，其中所述第一和第二鏈之間的中央互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度為19個(gè)核堿基并且末端部分由dTdT的3’突出端組成。
17.權(quán)利要求16的規(guī)范siRNA，其包含化合物U17、U20、U23、U36、U48或U54。
18.權(quán)利要求17的規(guī)范siRNA，其包含化合物U17。
19.權(quán)利要求5的雙鏈化合物，該雙鏈化合物為平末端siRNA。
20.權(quán)利要求19的平末端siRNA，該平末端siRNA靶向人存活蛋白(SEQ ID NO14)的3’UTR。
21.權(quán)利要求1-14任意一項(xiàng)的化合物，該化合物經(jīng)化學(xué)修飾。
22.權(quán)利要求21的化合物，其中化學(xué)修飾針對(duì)糖、核堿基或核苷間鍵。
23.權(quán)利要求22的化合物，其中針對(duì)糖的修飾為2’修飾。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中2’糖修飾選自2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-甲基、鎖定核酸(LNA)或2’-氟修飾。
25.權(quán)利要求23的化合物，其中2’修飾為2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)。
26.權(quán)利要求23的化合物，其中2’修飾為2’-O-甲基。
27.權(quán)利要求23的化合物，其中2’修飾為2’-F。
28.權(quán)利要求23的化合物，其中糖的2’修飾導(dǎo)致二環(huán)糖。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中二環(huán)修飾為鎖定核酸(LNA)。
30.權(quán)利要求22的化合物，其中針對(duì)糖的修飾為4’-硫代。
31.權(quán)利要求21的化合物，其包含兩種或兩種以上化學(xué)上不同的糖修飾。
32.權(quán)利要求22的化合物，其包含化學(xué)修飾的核堿基。
33.權(quán)利要求32的化合物，其中所述經(jīng)修飾的核堿基是5’-甲基胞苷。
34.權(quán)利要求22的化合物，其包含至少一種核苷間鍵修飾。
35.權(quán)利要求34的化合物，其包含交替的硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷間鍵。
36.權(quán)利要求21的化合物，其包含混合的硫代磷酸酯和磷酸二酯鍵。
37.權(quán)利要求21的化合物，該化合物為綴合物。
38.權(quán)利要求1的化合物，其包含選自硫代磷酸酯鍵、2’-氟、2’-O-甲基和4’-硫代的一種或多種修飾。
39.權(quán)利要求19的平末端siRNA，該平末端siRNA的長(zhǎng)度為19個(gè)核堿基。
40.權(quán)利要求39的平末端siRNA，該平末端siRNA在每條鏈中具有交替的PO/PS核苷間鍵，其中所述鍵為相反對(duì)齊。
41.權(quán)利要求39的平末端siRNA，該平末端siRNA在每條鏈中具有交替的PO/PS核苷間鍵，其中所述鍵為相同對(duì)齊。
42.權(quán)利要求19的平末端siRNA，該平末端siRNA的長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基。
43.權(quán)利要求42的平末端siRNA，該平末端siRNA在每條鏈中具有交替的PO/PS核苷間鍵，其中所述鍵為相反對(duì)齊。
44.權(quán)利要求42的平末端siRNA，該平末端siRNA在每條鏈中具有交替的PO/PS核苷間鍵，其中所述鍵為相同對(duì)齊。
45.權(quán)利要求19的平末端siRNA，該平末端siRNA的長(zhǎng)度為21個(gè)核堿基。
46.權(quán)利要求19的平末端siRNA，該平末端siRNA的長(zhǎng)度為22個(gè)核堿基。
47.權(quán)利要求19的平末端siRNA，該平末端siRNA的長(zhǎng)度為23個(gè)核堿基。
48.權(quán)利要求15的平末端siRNA，其中所述末端突出端部分位于一條所述鏈的一個(gè)5’末端。
49.權(quán)利要求15的siRNA，其中所述末端突出端部分位于一條所述鏈的一個(gè)3’末端。
50.權(quán)利要求14的siRNA，其中中央互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度為19個(gè)核堿基。
51.權(quán)利要求14的siRNA，其中中央互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度為20個(gè)核堿基。
52.權(quán)利要求14的siRNA，其中中央互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度為21個(gè)核堿基。
53.權(quán)利要求14的siRNA，其中中央互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度為22個(gè)核堿基。
54.權(quán)利要求14的siRNA，其中中央互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度為23個(gè)核堿基。
55.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-54任意一項(xiàng)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
56.權(quán)利要求1-54任意一項(xiàng)的化合物的藥學(xué)可接受的鹽。
57.權(quán)利要求56的藥學(xué)可接受的鹽，其為鈉鹽。
58.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，該雙鏈化合物具有不大于1nM的IC50。
59.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，該雙鏈化合物具有不大于2nM的IC50。
60.權(quán)利要求1的雙鏈化合物，該雙鏈化合物具有不大于5nM的IC50。
61.修飾編碼人存活蛋白(SEQ ID NO14)的核酸的方法，該方法包括將編碼人存活蛋白的核酸分子與權(quán)利要求1-54任意一項(xiàng)的化合物接觸，從而所述編碼人存活蛋白的核酸分子受到修飾。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述修飾的特征為切割所述編碼人存活蛋白的核酸分子。
63.抑制細(xì)胞或組織中存活蛋白表達(dá)的方法，該方法包括將所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求1-54任意一項(xiàng)的化合物接觸。
64.治療與存活蛋白表達(dá)或過量表達(dá)相關(guān)的疾病的方法，該方法包括對(duì)動(dòng)物，尤其對(duì)人施用有效量的權(quán)利要求1-54任意一項(xiàng)的化合物。
65.權(quán)利要求64的方法，其中疾病為癌。
66.權(quán)利要求65的方法，其中癌選自肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、腎癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胰腺癌和非霍奇金淋巴瘤。
67.長(zhǎng)度為8至80個(gè)核堿基的單鏈RNAi寡核苷酸，該單鏈RNAi寡核苷酸與編碼人存活蛋白(SEQ ID NO14)的核酸分子特異雜交并且通過RNAi反義機(jī)制發(fā)揮作用而抑制所述編碼人存活蛋白的核酸分子的表達(dá)。
68.權(quán)利要求67的單鏈RNAi寡核苷酸，其長(zhǎng)度為19至23個(gè)核堿基。
69.權(quán)利要求68的單鏈RNAi寡核苷酸，其為反義RNA。
70.權(quán)利要求67的單鏈RNAi寡核苷酸，其經(jīng)化學(xué)修飾。
71.權(quán)利要求70的單鏈RNAi寡核苷酸，其中所述修飾針對(duì)核堿基、糖或核苷間鍵。
全文摘要
提供了調(diào)節(jié)存活蛋白表達(dá)的化合物和組合物。通過RNAi反義作用機(jī)制起作用的化合物例證的化合物包括雙鏈和單鏈構(gòu)建體，以及siRNA、規(guī)范siRNA、平末端siRNA和單鏈反義RNA化合物。還提供了使用這些化合物調(diào)節(jié)存活蛋白表達(dá)和治療與存活蛋白表達(dá)相關(guān)的疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1984921SQ200480015280
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2004年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者B·巴特, B·K·帕泰特, E·斯韋茲 申請(qǐng)人:Isis 藥物公司, 伊萊利利公司