神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白應(yīng)用于人的安全劑量的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對人體的安全給藥劑量，特別地，涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白應(yīng)用于人時(shí)的安 全劑量。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuregulin，NRG ;heregulin，HRG)，又叫神經(jīng)膠質(zhì)生長因子 (glial growth factor，GGF)、neu 分化因子（new differentiation factor，NDF)，為分子 量在44KD左右的糖蛋白，它們在細(xì)胞間傳遞信號，是酪氨酸激酶受體ErbB家族的配體。神 經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白家族含 4 個成員：NRGl，NRG2，NRG3，NRG^(Fallsetal.，ExpCellRes.284: 14-30, 2003)對后三者的生物學(xué)功能相對來講知之甚少。NRGl在神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和乳腺中 起著重要作用，還有證據(jù)顯示NRGl信號傳遞在其他一些器官系統(tǒng)的發(fā)育、功能以及人類疾 病（包括精神分裂癥和乳腺癌）的發(fā)病機(jī)理中起作用。NRGl有很多異構(gòu)體。對基因突變小 鼠（基因敲除小鼠）的研宄說明在N末端區(qū)或表皮生長因子（EGF)類似區(qū)不同的異構(gòu)體， 其在體功能也不一樣。本發(fā)明是以神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β (NRGie)為基礎(chǔ)的。
[0003] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 1β 為一跨膜蛋白（Holmes et al.，Science 256,1205-1210， 1992)。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白類似區(qū)（Ig-Iikedomain)和EGF類似區(qū) (EGF-like domain)，膜內(nèi)部分是C末端。在細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶作用下，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白的膜外部分可被酶切下來而呈游離狀態(tài)，從而有利于和周圍細(xì)胞表面的ErbB受體結(jié)合， 激活相應(yīng)的細(xì)胞信號傳遞。
[0004] ErbB受體家族也分為四類，ErbBl、ErbB2、ErbB3和ErbB4,它們都是跨膜蛋白，分 子量在180-185KD附近。除ErbB2外，它們在膜外的N末端都含配體結(jié)合區(qū)；除ErbB3外， 它們在膜內(nèi)的C末端都含蛋白酪氨酸激酶活性。其中ErbBl是表皮生長因子的受體，ErbB3 和ErbB4都是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的受體。在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的受體中，只有ErbB2和ErbB4在心 臟表達(dá)量較高。（Yarden et al·，Nat Rev Mol Cell Biol，2:127-137,2001)
[0005] 當(dāng)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與ErbB3或ErbB4的膜外部分結(jié)合時(shí)，將引起ErbB3、ErbB4與其 他ErbB受體（常常包括ErbB2)形成異源二聚體，或ErbB4自身形成同源二聚體，然后導(dǎo)致 受體的膜內(nèi)部分被磷酸化（Yarden et al.，Nat Rev Mol Cell Biol，2:127-137,2001)。磷 酸化的膜內(nèi)部分可進(jìn)一步與細(xì)胞內(nèi)的多種信號傳遞蛋白結(jié)合，從而激活下游ERK或AKT信 號通路，引起一系列細(xì)胞反應(yīng)：包括刺激或抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞迀移、細(xì)胞分化或 細(xì)胞粘連。
[0006] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對心臟的發(fā)育尤其重要（W00037095, CN1276381，W003099300， W09426298, US 6444642, WO 9918976, WO 0064400, Zhao et al. , J. Biol. Chem. 273, 10261-10269,1998)。在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)主要局限于心內(nèi)膜，隨后通過 旁分泌途徑釋放到周圍心肌細(xì)胞并與細(xì)胞膜上的蛋白酪氨酸激酶受體ErbB4膜外部分結(jié) 合，ErbB4進(jìn)而與ErbB2形成異源二聚體。ErbB4/ErbB2復(fù)合物的形成及激活對早期海綿樣 心臟形成小梁是必須的。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、ErbB4和ErbB2三個蛋白基因中的任何一個缺失 都會使胚胎沒有小梁并在發(fā)育早期死于子宮。W00037095顯示一定濃度的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可 持續(xù)激活ERK信號通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長及分化，引導(dǎo)心肌細(xì)胞和細(xì)胞粘連處肌節(jié)和 細(xì)胞骨架的重建，改善心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮。W00037095及W003099300還 指出神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可用于檢測、診斷和治療各種心血管疾病。
[0007] 下面列舉了與本發(fā)明有關(guān)的一些現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)：
[0008] 1、Cardiac muscle function and manipulation，W00037095
[0009] 2、生長因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及其類似物的新應(yīng)用，CN1276381
[0010] 3、Neuregulin based methods and compositions for treating cardiovascular diseases，W003099300
[0011] 4、You-yang Zhao, Douglas R. Sawyer，Ragavendra R. Baliga，Douglas J. Opel? Xinqiang Han，Mark A. Marchionni，and Ralph A. Neuregulins Promote Survival and Growth of Cardiac Myocytes. Kelly J. Biol.Chem. 273,10261-10269(1998)
[0012] 5、Methods for treating muscle diseases and disorders，W09426298
[0013] 6、Methods of increasing myotube formation or survival or muscle cell mitogenesis，differentiation or survival using a neuregulin，US 6444642
[0014] 7、Therapeutic methods comprising use of a neuregulin，WO 9918976
[0015] 8、Methods for treating congestive heart failure，WO 0064400
[0016] 9、William E. Holmes，Mark X. Sliwkowski，Robert W. Akita，William J. Henzel， James Lee，John W. Park，Daniel Yansura，Nasrin Abadi，Helga Raab，Gail D.Lewis， H. Michael Shepard，Wun-Jing Kuang，William I. Wood，David V. Goeddel，Richard L. Wandlen. Identification of heregulin，a specific activator of pl85 (erbB2). Science 256,1205-1210(1992)
[0017] 10、Douglas L. Falls.Neuregulins :functions，forms，and signaling strategies. Experimental Cell Research 284?14-30 (2003)
[0018] 11、 Yosef Yarden， Mark X.Sliwkowski.Untangling the ErbB signalling Network. Nature Reviews :Molecular Cell Biology 2127-137(2001)。
[0019] 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)給心衰大鼠連續(xù)數(shù)次注射一定量（149. 3U/kg :蛋白量/體重）的神 經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能激活其體內(nèi)的ERK和AKT信號通路，并有利于心力衰竭的恢復(fù)。
[0020] 為了找到用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白治療人心臟病的有效、安全劑量，需要先對健康人做毒 理實(shí)驗(yàn)，找到對健康人無毒負(fù)作用的安全劑量。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)和分析，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)調(diào) 節(jié)蛋白應(yīng)用于人的安全劑量，滿足了此種需要。
[0021] 發(fā)明概述
[0022] 本發(fā)明提供了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白應(yīng)用于人時(shí)的安全劑量。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案 中，所述的安全劑量是將神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白一次或多次施用給健康人群時(shí)，所獲得的健康人體 能承受的安全劑量。具體地，所述安全劑量在大約2. 99至大約35. 83U/kg (蛋白/體重）的 范圍內(nèi)，例如大約 2. 99U/kg、大約 5. 97U/kg、大約 11. 94U/kg、大約 17. 92U/kg、大約 23. 89U/ kg或大約35. 83U/kg(蛋白/體重）。更優(yōu)選地，所述的安全劑量是在大約2. 99至大約 17. 92U/kg(蛋白/體重）的范圍內(nèi)，例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11. 94U/kg或 大約17.92U/kg(蛋白/體重）。
[0023] 本發(fā)明還提供了對人體安全使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白劑量的方法，其包括將一定劑量的 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白一次或多次施用給健康人群，而不會引起負(fù)反應(yīng)或者只引起可以被接受程度 的負(fù)反應(yīng)。其中，所述的劑量在大約2. 99至大約35. 83U/kg(蛋白/體重）的范圍內(nèi)，例 如大約 2. 99U/kg、大約 5. 97U/kg、大約 11. 94U/kg、大約 17. 92U/kg、大約 23. 89/kg 或大約 35. 83U/kg (蛋白/體重）。更優(yōu)選地，所述的劑量是在大約2. 99至大約17. 92U/kg (蛋白/ 體重）的范圍內(nèi)，例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11. 94U/kg或大約17. 92U/kg (蛋 白/體重）。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將在大約2. 99至大約17. 92U/kg(蛋白/體重）范圍內(nèi) 例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11. 94U/kg或大約17. 92U/kg(蛋白/體重）的神 經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白一次或多次施用給健康人群，而不會引起負(fù)反應(yīng)或者只引起可以被接受程度的 負(fù)反應(yīng)?；蛘撸瑢⒊^17. 92U/kg至大約35. 83U/kg (蛋白/體重）范圍內(nèi)例如大約23. 89/ kg或大約35. 83U/kg(蛋白/體重）的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白一次施用給健康人群，而不會引起負(fù)反 應(yīng)或者只引起可以被接受程度的負(fù)反應(yīng)。
[0024] 本發(fā)明還提供了對于人體為安全的藥物制劑，其中包含安全劑量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白。所述安全劑量在大約2. 99至大約35. 83U/kg (蛋白/體重）的范圍內(nèi)，例如大約2. 99U/ kg、大約 5. 97U/kg、大約 IL 94U/kg、大約 17. 92U/kg、大約 23. 89/kg 或大約 35. 83U/kg (蛋 白/體重）。更優(yōu)選地，所述安全劑量是在大約2. 99至大約17. 92U/kg (蛋白/體重）的 范圍內(nèi)，例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11.94U/kg或大約17. 92U/kg(蛋白/體 重）。
[0025] 附圖簡述
[0026] 圖1是受試者A302(35. 83U神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/kg體重）在給藥前的心電圖。
[0027] 圖2是受試者A302 (35. 83U神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/kg體重）在給藥后2小時(shí)的心電圖。
[0028] 圖3是受試者A302 (35. 83U神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/kg體重）在給藥后24小時(shí)的心電圖。
[0029] 圖4是受試者A302 (35. 83U神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/kg體重）在給藥7天后的心電圖。
[0030] 圖5是給藥17.92U/kg(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/體重）組受試者C405在給藥前的心電圖。
[0031] 圖6是給藥17.92U/kg(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/體重）組受試者C405在第一次給藥后24 小時(shí)的心電圖。
[0032] 圖7是給藥17. 92U μ g/kg(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/體重）組受試者C405在第二次給藥 后2小時(shí)的心電圖。
[0033] 圖8是給藥17. 92U/