專利名稱：霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體及抗原捕獲elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株及抗原捕獲ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio cholera，VC)引起的烈性腸道傳染病，該病起病急、傳播快、涉及范圍廣，屬國(guó)際檢疫傳染病，在我國(guó)被列為甲類傳染病之一，是主要食源性致病微生物之一，時(shí)時(shí)威脅著人類并給人類帶來(lái)危害。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過(guò)污染的水源或飲食經(jīng)口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進(jìn)入小腸后，依靠鞭毛的運(yùn)動(dòng)，穿過(guò)粘膜表面的粘液層，通過(guò)菌毛作用粘附于腸壁上皮細(xì)胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經(jīng)過(guò)短暫的潛伏期后便急驟發(fā)病。該菌不侵入腸上皮細(xì)胞和腸腺，也不侵入血液，在局部繁殖和產(chǎn)生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細(xì)胞與腸腺使腸液過(guò)度分泌，從而患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”并含大量弧菌，此為本病典型的特征。 目前檢測(cè)食品中致病微生物的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，即分離鑒定方法，該方法所需時(shí)間長(zhǎng)，一般情況下需要5-7天，有時(shí)達(dá)到10-15天，很難滿足快速鑒定的需要；近幾年發(fā)展起來(lái)的PCR技術(shù)，是一種快速、靈敏、特異性好的技術(shù)，但是目前該技術(shù)還是依賴于傳統(tǒng)方法的前增菌步驟，增菌液中往往含有PCR抑制劑，從而影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果；以抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)已經(jīng)成為食品中有毒有害物質(zhì)及有害生物檢測(cè)不可或缺的重要技術(shù)手段。目前已經(jīng)發(fā)展了多種特異性免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析(TrFIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CIA)、生物發(fā)光免疫分析(BIA)、免疫沉淀反應(yīng)、免疫凝集反應(yīng)、ELISA檢測(cè)試劑盒、免疫膠體金試紙條、免疫乳膠檢測(cè)試劑等。其中ELISA檢測(cè)試劑盒、免疫膠體金試紙條等多種以抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，以其簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)用的特點(diǎn)一直是國(guó)境檢驗(yàn)檢疫安全偵檢技術(shù)體系中的重要組成，已經(jīng)成為有害生物及有毒有害物質(zhì)檢測(cè)不可或缺的重要技術(shù)手段?？焖俚腅LISA方法檢測(cè)，作為篩選方法具有快速、靈敏的特點(diǎn)，是受到廣泛歡迎的篩選方法，但是所使用的試劑盒均來(lái)自國(guó)外，價(jià)格昂貴，而且需要配備其專門的儀器。因而，研究開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的食源性致病微生物的抗體,是開(kāi)發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ELISA檢測(cè)方法、膠體金檢測(cè)方法、基于免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫納米磁珠富集方法的基礎(chǔ)。鞭毛是霍亂弧菌的一個(gè)重要毒力因子，具有特異性的鞭毛抗原(H抗原)，常作為血清學(xué)鑒定的依據(jù)之一。細(xì)菌的鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物學(xué)和致病機(jī)制研究中具有重要的意義。例如，鞭毛蛋白被認(rèn)為是一種保護(hù)性的抗原用于致病菌的疫苗研究，有研究結(jié)果表明，鞭毛蛋白可作為天然免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然免疫應(yīng)答可幫助建立針對(duì)外源抗原的獲得性免疫應(yīng)答，從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的特性。迄今用于霍亂特異性診斷的血清和預(yù)防用菌苗均為多克隆抗體和復(fù)雜的菌體抗原,難以對(duì)菌體抗原成分做進(jìn)一步分析?；魜y弧菌血清群超過(guò)200個(gè)，但只有01群及0139群引起霍亂大流行。Ol群霍亂弧菌分為稻葉、小川和彥島(少見(jiàn))3種血清型。各型弧菌產(chǎn)生類似的腸毒素，臨床表現(xiàn)也類似。每一次霍亂流行都會(huì)有一個(gè)特定的優(yōu)勢(shì)型，且流行趨勢(shì)是在不斷變化的。0139血清型霍亂是近10年來(lái)肆虐于南亞，并波及亞、歐、美、非、澳五大洲的數(shù)十個(gè)國(guó)家和地區(qū)的一種新發(fā)現(xiàn)的烈性傳染病，目前已成為全球霍亂的優(yōu)勢(shì)菌群。目前已研制出專門 針對(duì)01群或0139群的抗體。但是，隨著環(huán)境及其他條件的變化，其他血清型的霍亂弧菌仍然有引發(fā)流行病的可能。因此，制備適用于所有血清型的霍亂弧菌的抗體具有重要的意義。在已往的霍亂弧菌單克隆抗體的制備過(guò)程中，多使用滅活的VC菌體作為抗原，而菌體的大部分蛋白為菌屬共有蛋白，不具有種間特異性，導(dǎo)致收獲的單抗很難避免弧菌菌屬內(nèi)的種間交叉反應(yīng)。本研究選用具有種間特異性的鞭毛蛋白作為抗原，并且在陽(yáng)性克隆篩選過(guò)程中排除交叉反應(yīng)，制備特異性良好的VC單克隆抗體，并將其應(yīng)用于制備霍亂弧菌ELISA檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。該單克隆抗體可以用于檢測(cè)霍亂弧菌。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種霍亂弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案如下本發(fā)明所提供的霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 6754的小鼠雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。該小鼠雜交瘤細(xì)胞株已于2012年11月I日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址是中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6754。保藏編號(hào)為CGMCC No. 6754的小鼠雜交瘤細(xì)胞株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了一種霍亂弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒，該試劑盒包括已包被霍亂弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體的固相載體和酶標(biāo)記的本發(fā)明所述的單克隆抗體。所述酶優(yōu)選為辣根過(guò)氧化酶。進(jìn)一步地，為了便于檢測(cè)，本發(fā)明試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以及ELISA反應(yīng)所需的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑。其中，所述陽(yáng)性對(duì)照為霍亂弧菌鞭毛蛋白，所述陰性對(duì)照為未免疫霍亂弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀釋液。所述酶聯(lián)免疫檢測(cè)試齊U，均為常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑，包括但不限于，酶的底物反應(yīng)液、洗滌液和反應(yīng)終止液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果首先，本發(fā)明通過(guò)特異性實(shí)驗(yàn)，證明本發(fā)明的霍亂弧菌單克隆抗體顯示出良好的特異性和穩(wěn)定性。在特異性實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了包括41株霍亂弧菌、I株01群霍亂弧菌、I株0139群霍亂弧菌、50株副溶血性弧菌和28株非霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中包括大部分常見(jiàn)的病原菌。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的霍亂弧菌單克隆抗體的特異性驗(yàn)證廣度遠(yuǎn)大于其他霍亂弧菌單克隆抗體的驗(yàn)證，并且對(duì)不同血清型的霍亂弧菌檢測(cè)均適用。其次，敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)敏感性為IO3/孔。目前在國(guó)內(nèi)外已商業(yè)化生產(chǎn)的試劑盒，其靈敏度基本在IO4/孔左右，因此，本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度高于其他試劑盒檢測(cè)的平均水平，具有理想的應(yīng)用前景。與微生物傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的ELISA檢測(cè)方法與其檢測(cè)靈敏度相當(dāng)，但將檢測(cè)周期從7 10天縮短至f 2天，并且具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。


圖1.霍亂弧菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE圖；泳道1:霍亂弧菌鞭毛蛋白r ;泳道2 :蛋白 Marker ；圖2.霍亂弧菌鞭毛蛋白電鏡；圖3. mAb 的 SDS-PAGE 圖；泳道1:蛋白 Marker ;泳道 2 :mAb。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體的制備 1.菌體培養(yǎng)及鞭毛蛋白的提取霍亂弧菌(Vibrio cholera) (VC-75，實(shí)驗(yàn)室分離保存)接種于TlNl培養(yǎng)基(購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)CM168)，36°C活化24h ;挑取單菌落接種于含2%NaCl的TSA培養(yǎng)基(購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)CM417)生長(zhǎng)18 24h ;用無(wú)菌棉簽將生長(zhǎng)良好的菌落均勻涂布在TSA (2%NaCl)培養(yǎng)基上，36°C培養(yǎng)18±2h。次日用無(wú)菌棉簽刮下菌體懸浮于預(yù)冷的O. 15M NaCl溶液中，冰浴15 30min，IOOOrpm勻漿45sec，立即置于冰上IOmin0勻漿液4°C條件下IOOOOrpm離心IOmin ;取上清液4°C條件下16000rpm離心2h，棄上清，沉淀重懸于 TET (IOmM Tris, 2mM EDTA，pH 8. O, l%Triton X-100)緩沖液中。離心過(guò)程重復(fù)3次。操作過(guò)程保持低溫下進(jìn)行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA(0.1M Tris,
O.1mM EDTA, pH 7. 8) buffer 中，4°C保存?zhèn)溆谩?2. SDS-PAGE 及電鏡鑒定提取的鞭毛蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。5%積層膠，10%分離膠，120V電壓，電泳至膠底部。凝膠用考馬斯亮藍(lán)法染色，脫色后凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。見(jiàn)圖1。霍亂弧菌鞭毛蛋白的電鏡鑒定見(jiàn)圖2。3.動(dòng)物的免疫(I) BALB/c小鼠的免疫以鞭毛蛋白為抗原，免疫61周齡的BALB/c小鼠5只，設(shè)2只不作免疫小鼠做陰性對(duì)照。初次免疫抗原加等量福氏完全佐劑充分乳化后，皮下注射免疫小鼠，40 μ g/小鼠。以后每隔兩周用相同劑量抗原與福氏不完全佐劑充分乳化后免疫。第五次免疫:Γ5天后尾靜脈采血，檢測(cè)抗血清效價(jià)。(2)新西蘭純種兔的免疫用霍亂弧菌鞭毛蛋白免疫雌性新西蘭兔O. 5mg/只。每隔兩周免疫一次，共免疫5次。五免后3-5天進(jìn)行心臟大量取血，置37°C I小時(shí)，然后放冰箱4°C過(guò)夜，隔天取血清純化得霍亂弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體，_20°C凍存?zhèn)溆谩?.抗血清效價(jià)抗血清效價(jià)采用間接ELISA方法用PBS稀釋VC抗原濃度至I μ g/mL,加入96孔板，100 μ L/孔，4°C過(guò)夜。用PBST洗板3次。2%的牛血清白蛋白溶于PBS溶液中，200 μ L/孔，37°C封閉lh。用PBST洗板。5只免疫鼠血清用PBS梯度稀釋加入對(duì)應(yīng)孔中，100 μ L/孔，空白對(duì)照為PBS溶液，陰性對(duì)照為未免疫小鼠血清37°C包被45min后洗板。HRP標(biāo)記的羊抗鼠以1:2500倍數(shù)稀釋加入，10(^17孔，371包被401^11后洗板。每孔加新鮮配制的底物溶液100 μ L，37°C作用15min后每孔加入2M濃硫酸50 μ L，用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定0D450nm值，讀數(shù)并觀察結(jié)果。選擇效價(jià)高且滿足？州值> 2.0的小鼠，一周后加強(qiáng)免疫，3飛天內(nèi)取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。5. P2/0骨髓瘤細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)提前對(duì)凍存的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行復(fù)蘇，將_80°C冷凍冰箱中凍存的骨髓瘤細(xì)胞快速取出后，置于38°C水浴中輕微晃動(dòng)使其迅速融化，注意凍存管口不能碰到水，以免污染，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含6 IOml RPM1-1640完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，小牛血清購(gòu)自Hyclone，貨號(hào)SH30541. 03)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4飛個(gè)小時(shí)，待細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)時(shí)，及時(shí)換液，以后每隔2 3天傳代一次，并調(diào)整細(xì)胞使其處于最適生長(zhǎng)密度，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定活性，計(jì)數(shù)，準(zhǔn)備進(jìn)行融合。細(xì)胞融合前f 2天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行I比4傳代，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整每瓶細(xì)胞濃度為f2X 105/ml，一般f 2天即可獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。 6.飼養(yǎng)細(xì)胞的制備(I)將BALB/c小鼠拉頸處死，自來(lái)水沖洗后，完全浸泡于75%酒精中l(wèi)Omin，移入超凈工作臺(tái)的平皿中，使其腹部朝上。(2)用鑷子提起小鼠胸腹部皮膚，用剪刀剪開(kāi)一小口，用兩把鑷子將皮膚撕開(kāi)一較大的口，然后重新?lián)Q用新的鑷子提起小鼠腹膜，剪開(kāi)，找到小鼠的胸腺，用鑷子，小剪刀小心將胸腺取出，放在一次性平皿中，細(xì)心剝?nèi)バ叵偕细綆У闹?、結(jié)締組織等，加入RPM1-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自Hyclone，貨號(hào)SH30809. 01) 5ml，研磨胸腺，過(guò)篩，將胸腺細(xì)胞懸液加入離心管中，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，離心洗滌兩次。(3)用5ml HAT培養(yǎng)液輕輕將細(xì)胞重懸并混和均勻，計(jì)數(shù)，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液至細(xì)胞濃度為I 2 X105/ml。(4)將細(xì)胞懸液滴入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，100 μ I/孔(兩滴)，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.免疫脾細(xì)胞懸液的制備(I)加強(qiáng)免疫3飛天后，選血清效價(jià)較高的BALB/c小鼠，摘除眼球，放血，收集并分離血清作為抗體檢測(cè)的陰性對(duì)照。(2)斷頸處死，自來(lái)水沖洗后浸泡于75%酒精中l(wèi)Omin，取出小鼠放在無(wú)菌超凈工作臺(tái)的平皿中，使其腹部朝上。 (3)用鑷子提起小鼠胸腹部皮膚，用剪刀剪開(kāi)一小口，再用兩把鑷子將皮膚撕開(kāi)一較大的口，然后重新?lián)Q用新的鑷子提起小鼠腹膜，剪開(kāi)，找到小鼠的脾臟，小心將脾臟取出，放在一次性平皿中，細(xì)心去除脂肪和結(jié)締組織。(4)用RPM1-1640洗液沖洗后，加入新的RPM1-1640洗液，用注射器針芯研磨，然后過(guò)篩，使脾細(xì)胞盡可能都通過(guò)網(wǎng)孔擠壓到溶液中，將脾細(xì)胞懸液移入離心管中，IOOOrpm離心IOmin,棄上清,離心洗漆兩次。(5)用10ml HAT培養(yǎng)液輕輕將脾細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)，備用。8SP2/0骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備(I)取4瓶IOOml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)好的骨髓瘤細(xì)胞(融合前一天換液，融合時(shí)細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，收集于50ml離心管中。(2) IOOOrpm離心5 10分鐘，棄上清。(3)沉淀中加入30ml RPM1-1640洗液，輕輕重懸，混勻，同法再離心洗滌一次。(4)用IOml HAT培養(yǎng)液輕輕將脾細(xì)胞重懸并混和均勻，計(jì)數(shù)，備用。9細(xì)胞融合
(I)輕輕吹下培養(yǎng)好的骨髓瘤細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，1000r/min離心7min,棄上清，IOmL培養(yǎng)基洗液懸浮,計(jì)數(shù)。(2)將含IX IO8個(gè)脾細(xì)胞的懸液和含2X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的懸液混合于一支50ml的離心管內(nèi)，補(bǔ)加培養(yǎng)基洗液至30ml,充分混勻。(3) IOOOrpm離心7分鐘，棄去上清，清洗兩次，盡量去上清。(4)用手輕輕彈離心管底，使細(xì)胞團(tuán)塊松散均勻呈糊狀。置37°C水浴，預(yù)熱5" Omin,以達(dá)到融合溫度。(5)從4°C冰箱中拿出已配好的50%PEG (MW4000)、RPM1-1640洗液，放在37°C水浴中，預(yù)溫備用。(6)將離心管放進(jìn)含有37 40°C水的燒杯中，轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，用Iml吸管吸取50%的PEG Iml,沿管壁逐滴、緩慢加入離心管，時(shí)間控制在60秒內(nèi)，然后再用30秒的時(shí)間吸取細(xì)胞懸液，靜置30秒，再在30秒內(nèi)將細(xì)胞緩緩吹入離心管內(nèi)。(7)加入預(yù)溫好的RPM1-1640洗液，使PEG稀釋而失去促融作用，具體方法前兩分鐘內(nèi)加2ml,第三分鐘加入3ml,最后在3min內(nèi)加入20ml。(8)室溫離心融合細(xì)胞，800rpm離心7min,棄上清。(9)加入HAT培養(yǎng)液(50X，購(gòu)自Sigma，貨號(hào)H0262)，輕輕吹吸、重懸沉淀細(xì)胞。(10)將融合細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，100 μ I/孔(兩滴)，然后將培養(yǎng)板置37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10陽(yáng)性克隆的篩選和克隆化培養(yǎng)融合后第3天開(kāi)始，每天觀察各孔細(xì)胞生長(zhǎng)情況，若有污染，立即用疊氮鈉處理。融合后第6d、9d用HAT培養(yǎng)液半量換液，HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT (50X，購(gòu)自Sigma，貨號(hào)H0137)培養(yǎng)液半量換液，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，f 2d換一次液，兩周后改用完全培養(yǎng)液。待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底面積的1/10時(shí)(約IOd左右)，吸取出現(xiàn)克隆的孔上清用于特異性檢測(cè)。采用間接ELISA法。交叉反應(yīng)用副溶血性弧菌弧菌(VP)、創(chuàng)傷弧菌(VV)及溶藻弧菌(VA)的鞭毛蛋白為抗原，包被96孔板，測(cè)定VC抗血清與3種弧菌的交叉反應(yīng)情況。用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定0D450，滿足P/N值> 2. O為陽(yáng)性。將VC抗原包被板檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其他細(xì)菌抗原包被板檢測(cè)結(jié)果呈陰性的雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底面積的1/10時(shí)再用同樣方法檢測(cè)，強(qiáng)陽(yáng)性孔再克隆。如此反復(fù)Γ4次，直到陽(yáng)性克隆率達(dá)到100%。11腹水制備與抗體鑒定對(duì)最后篩選出的陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并且已于2012年11月I日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址是中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6754。常規(guī)腹水體內(nèi)誘生方法制備單抗腹水。mAb的特性鑒定=(I)Ig類和亞類的檢測(cè)用小鼠mAb亞類檢測(cè)試劑盒測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中Ig的類和亞類，操作步驟按說(shuō)明書(shū)上進(jìn)行。(2)Western blot檢測(cè)采用常用Western blot實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定腹水在1:2000稀釋度下的特異性。(3)抗體純化及效價(jià)測(cè)定腹水用Protein G Sepharose親和層析法純化后得到抗體,純化后的抗體經(jīng)倍比稀釋后用間接ELISA法測(cè)定效價(jià)?？贵w經(jīng)SDS-PAGE分析純度。純化后抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳得到兩條清晰的條帶重鏈分子量50KDa，輕鏈分子量25KDa，圖3所示。抗體ELISA效價(jià)結(jié)果(見(jiàn)表I)可以看出，稀釋度為1:2187000情況下仍有很強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)。表1. mAb 的 ELISA 效價(jià)。
權(quán)利要求
1.霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6754的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
2.分泌產(chǎn)生霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC No.6754。
3.一種霍亂弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒，其特征在于，包括已包被霍亂弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體的固相載體和酶標(biāo)記的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過(guò)氧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性對(duì)照為霍亂弧菌鞭毛蛋白，所述陰性對(duì)照為未免疫霍亂弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀釋液。
7.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)霍亂弧菌的試劑盒中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在檢測(cè)霍亂弧菌中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3所述的試劑盒在檢測(cè)霍亂弧菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體及抗原捕獲ELISA試劑盒。該霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No.6754的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。該霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體可用于檢測(cè)霍亂弧菌。本發(fā)明還公開(kāi)了一種霍亂弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102993301SQ20121053229
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者曾靜, 張蕾, 馬丹, 張西萌, 魏海燕, 劉莉, 周熙城 申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心