專利名稱：酸性脲酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酸性脲酶的生產(chǎn)方法，屬于酶制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脲酶(Urease, urea amidohydrolase, EC 3. 5.),又稱尿素氨基水解酶，存在于大多數(shù)細(xì)菌、曲霉和高等植物里。它是一種酰胺酶、能使有機(jī)物質(zhì)分子中酶鍵水解。其作用極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和碳酸。有部分微生物產(chǎn)生的酸性脲酶(acid urease)不同于植物中提取的中性、偏堿性脲酶，酸性脲酶能耐受酸性環(huán)境，在ρΗ4· O 5. 5的體系中仍具有活性[1]。在國(guó)外，乳酸桿菌已經(jīng)被用于生產(chǎn)脲酶酶制劑，有效地減少葡萄酒中尿素含量[2_6]。在國(guó)內(nèi)，脲酶已經(jīng)被用于降低黃酒中尿素含量。但是，酒用脲酶在我國(guó)尚未形成生產(chǎn) 能力，目前所用的酶制劑均從國(guó)外進(jìn)口 [7]。例如，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司購(gòu)買日本生產(chǎn)的酒用酸性脲酶去除黃酒中的尿素，該酸性脲酶在紹興黃酒中作用時(shí)間48h左右，可有效除去黃酒中約80%的尿素[8]。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)酸性酒用脲酶的需求量不斷增加，迫切需要解決酒用脲酶在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)能力不足的現(xiàn)狀，因此酒用脲酶的研究對(duì)我國(guó)釀酒業(yè)的發(fā)展，拓展國(guó)際市場(chǎng)等方面均有深遠(yuǎn)的意義。目前，江南大學(xué)分離獲得腸出血性大腸埃希氏菌，利用該菌株生產(chǎn)出純度較高的酒用脲酶制劑，然后將酶制劑添加到黃酒中，24h后尿素去除率為70%以上[9]。由于酒用酸性脲酶被作為食品添加劑直接添加到葡萄酒或者黃酒中，而目前報(bào)道的產(chǎn)脲酶菌株都是細(xì)菌，普遍從動(dòng)物糞便(鳥糞、鼠糞、牛羊糞便)，農(nóng)田土壤，污泥等中分離獲得[9]，并且需要一系列復(fù)雜的酶純化提取工藝才能獲得高純度的酶制劑，從而極大的增加了生產(chǎn)成本,也增加了大規(guī)模生產(chǎn)的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供酸性脲酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是酸性脲酶的生產(chǎn)方法，包括如下步驟利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No. 6577 發(fā)酵，提取，得到脲酶制劑。進(jìn)一步的，所述的發(fā)酵是指將聚多曲霉接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，于3(T35°C、15(T250rpm、溶氧(P02)100%條件下發(fā)酵5 7天；其中，聚多曲霉的孢懸液濃度為105 106個(gè)/mL,孢懸液的體積占麥芽汁培養(yǎng)基體積的2%。。所述的PO2是發(fā)酵罐好氧培養(yǎng)時(shí)候的一個(gè)參數(shù)，即發(fā)酵罐在運(yùn)行時(shí)，溫度、攪拌速度、PH的實(shí)際值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，且通入空氣使溶氧值不再變化時(shí)，將溶氧值校準(zhǔn)為100%。校準(zhǔn)好后在進(jìn)行接種。優(yōu)選的，于35°C，150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為7天。進(jìn)一步的，所述的麥芽汁培養(yǎng)基的制備方法如下取大麥芽粉碎，加3飛倍(優(yōu)選4倍)于麥芽質(zhì)量的55飛(TC的水，在55飛(TC下保溫3 4h，過濾，煮沸，過濾，將麥芽汁濃度調(diào)整到5 7波美(°BX)(波美是糖度的單位，本發(fā)明中可用蒸餾水調(diào)糖度)，115°C下滅菌20分鐘備用。進(jìn)一步的，所述的提取指在發(fā)酵完畢后收集菌絲，干燥菌絲，粉碎菌絲。優(yōu)選的，收集菌絲時(shí)用無菌水洗滌菌絲。優(yōu)選的，粉碎菌絲過80目篩，收集菌絲粉末即得到酶制劑。本發(fā)明還提供了所述酸性脲酶的生產(chǎn)方法在生產(chǎn)酸性脲酶中的用途。本發(fā)明方法利用高產(chǎn)脲酶的聚多曲霉生產(chǎn)酸性脲酶。該菌株產(chǎn)脲酶活性可達(dá)到49. 7U。本發(fā)明根據(jù)聚多曲霉的特性，對(duì)發(fā)酵條件以及提取工藝進(jìn)行了研究?jī)?yōu)化，使得本發(fā)明的生產(chǎn)方法工藝簡(jiǎn)單、投入少，可規(guī)?；笊a(chǎn)。本發(fā)明方法為酸性脲酶的生產(chǎn)提供了新的選擇。 本發(fā)明的聚多曲霉(Aspergillus sydowii)JNC_U5于2012年9月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 6577，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。


圖1pH對(duì)脲酶活性的影響圖2尿素去除率測(cè)定
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的技術(shù)方案是酸性脲酶的生產(chǎn)方法，包括如下步驟利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No. 6577 發(fā)酵，提取，得到脲酶制劑。進(jìn)一步的，所述的發(fā)酵是指將聚多曲霉接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，于3(T35°C、15(T250rpm、溶氧(P02)100%條件下發(fā)酵5 7天；其中，聚多曲霉的孢懸液濃度為105 106個(gè)/mL,孢懸液的體積占麥芽汁培養(yǎng)基體積的2%。。所述的PO2是發(fā)酵罐好氧培養(yǎng)時(shí)候的一個(gè)參數(shù)，即發(fā)酵罐在運(yùn)行時(shí)，溫度、攪拌速度、PH的實(shí)際值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，且通入空氣使溶氧值不再變化時(shí)，將溶氧值校準(zhǔn)為100%。校準(zhǔn)好后在進(jìn)行接種。優(yōu)選的，于35°C，150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為7天。進(jìn)一步的，所述的麥芽汁培養(yǎng)基的制備方法如下取大麥芽粉碎，加3飛倍于麥芽質(zhì)量的55飛(TC的水，在55飛(TC下保溫3 4h，過濾，煮沸，過濾，將麥芽汁濃度調(diào)整到5 7°BX, 115°C下滅菌20分鐘備用。進(jìn)一步的，所述的提取指在發(fā)酵完畢后收集菌絲，干燥菌絲，粉碎菌絲。優(yōu)選的，收集菌絲時(shí)用無菌水洗滌菌絲，以去除發(fā)酵液中的培養(yǎng)基成分。優(yōu)選的，粉碎菌絲過80目篩，收集菌絲粉末即得到酶制劑。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，可用于生產(chǎn)酸性脲酶。本發(fā)明還提供了所述酸性脲酶的生產(chǎn)方法在生產(chǎn)酸性脲酶中的用途。實(shí)施例1菌株篩選1、菌株的初篩材料四川劍南春(集團(tuán))有限責(zé)任公司使用的酒曲
培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，葡萄糖18g，0. 4%酚酞溶液3mL，氯化鈉5. 0g，磷酸二氫鉀2. Og,瓊脂20. O,蒸餾水1000mL。除酚酞外，溶解上述各種成分，并調(diào)pH為6. 8-6. 9，然后加入酚酞指示劑。分裝三角瓶，121°C滅菌15min，待培養(yǎng)基冷至50_55°C時(shí)，加入預(yù)先過濾滅菌的20%尿素水溶液，使其在培養(yǎng)基中在最終濃度為2%，搖勻后備用。實(shí)驗(yàn)方法無菌條件下取10克酒曲于裝有90mL無菌水并放有玻珠的25mL三角瓶中，置搖床上室溫振蕩30分鐘。取菌液按10倍的梯度稀釋到10_6，取各稀釋度菌液ImL放入無菌平皿中，倒入滅菌后冷卻至50°C的培養(yǎng)基，混勻，待凝固后放入30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 5天，按菌落周圍是否變紅進(jìn)行初篩(結(jié)果見表I)。因?yàn)殡迕阜纸饽蛩禺a(chǎn)生氨使培養(yǎng)基呈堿性；酚酞遇堿變紅，顏色的深淺初步表示了菌株產(chǎn)脲酶能力的大小。挑選菌落周圍變紅的單菌落保存。初篩得到的菌株經(jīng)形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)主要為霉菌和細(xì)菌。表I初篩得到菌株的變紅時(shí)間及顏色深淺
權(quán)利要求
1.酸性脲酶的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟利用聚多曲霉Aspergillus sydowiiJNC-U5 CGMCC No. 6577發(fā)酵，提取，得到脲酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酸性脲酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的發(fā)酵是指將聚多曲霉接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，于30 35°C、15(T250rpm、溶氧100%發(fā)酵5 7天；其中，聚多曲霉的孢懸液濃度為10卜106個(gè)/mL，孢懸液的體積占麥芽汁培養(yǎng)基體積的廣2%0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酸性脲酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的發(fā)酵條件如下于 35°C，150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為7天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的酸性脲酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的麥芽汁培養(yǎng)基的制備方法如下取大麥芽粉碎，加3 5倍于麥芽質(zhì)量的55 60°C的水,在55 60 °C下保溫 3 4h，過濾，煮沸，過濾，將麥芽汁濃度調(diào)整到5 7波美，115°C下滅菌20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求Γ4任一項(xiàng)所述的酸性脲酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的提取為在發(fā)酵完畢后收集菌絲，干燥菌絲，粉碎菌絲。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的酸性脲酶的生產(chǎn)方法，其特征在于收集菌絲時(shí)用無菌水洗滌菌絲。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的酸性脲酶的生產(chǎn)方法，其特征在于粉碎菌絲后過80目篩，收集菌絲粉末即得到酶制劑。
8.權(quán)利要求f7任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法在生產(chǎn)酸性脲酶中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及酸性脲酶的生產(chǎn)方法，屬于酶制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)酸性脲酶的方法。本發(fā)明的酸性脲酶的生產(chǎn)方法，包括如下步驟利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No.6577發(fā)酵，提取，得到脲酶制劑。本發(fā)明方法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，可工業(yè)化大生產(chǎn)酸性脲酶。
文檔編號(hào)C12R1/66GK102994487SQ201210531870
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者唐清蘭, 徐姿靜, 魏勇, 徐占成, 劉孟華, 樊科權(quán), 焦小川 申請(qǐng)人:四川綿竹劍南春酒廠有限公司