一種具有Cupin結(jié)構(gòu)功能域的貯藏蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的生產(chǎn)和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工藝和食品加工領(lǐng)域，涉及一種具有Cupin結(jié)構(gòu)功能域的IC藏蛋 白類型α-淀粉酶抑制劑的生產(chǎn)和純化方法，具體涉及鷹嘴豆籽粒中貯藏蛋白類型α-淀 粉酶抑制劑的生產(chǎn)和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)這三種營養(yǎng)元素為人體提供絕大部分的能量，其中碳 水化合物提供的熱量約占全部的60% -70%，如果碳水化合物攝入量過多就會(huì)轉(zhuǎn)化成脂肪 囤積在機(jī)體內(nèi)，過多的攝入和剩余將會(huì)引發(fā)肥胖、高血糖、糖尿病等"富貴病"。
[0003] 鷹嘴豆，其籽粒尖如鷹嘴，又叫桃豆、羊頭豆、諾胡提等，在我國新疆已有2500多 年的栽培歷史。鷹嘴豆為維吾爾族常用藥材，具有很高的藥用價(jià)值，中醫(yī)用于調(diào)濕止瀉，解 毒消炎，強(qiáng)骨健胃等，此外，通過大量臨床經(jīng)驗(yàn)證明鷹嘴豆對70多種嚴(yán)重營養(yǎng)不良有明顯 的療效，因此鷹嘴豆成為開發(fā)對人類健康有益營養(yǎng)成分的重要植物材料。α -淀粉酶能將多 聚糖淀粉水解為單糖葡萄糖，進(jìn)而作為機(jī)體吸收的能量來源，在人們生活膳食中發(fā)揮著重 要的作用。α-淀粉酶抑制劑能夠有效地與人體口腔、胃腸道唾液α-淀粉酶及胰臟分泌 的α-淀粉酶結(jié)合形成酶-抑制劑的復(fù)合物，使α-淀粉酶活性喪失或降低來阻礙食物中 碳水化合物的水解和消化?；讦?淀粉酶抑制劑自身的特點(diǎn)，α-淀粉酶抑制劑在醫(yī)學(xué) 和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用前景，一方面α -淀粉酶抑制劑可以作為防治和治療高血糖、 糖尿病及高血脂等疾病的藥物，另一方面也可以應(yīng)用于日常生活中保健，控制飲食，減少肥 胖；同時(shí)α -淀粉酶抑制劑基因及產(chǎn)物對農(nóng)業(yè)昆蟲防治和減少殺蟲劑使用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境 有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 我們前期對鷹嘴豆種子α -淀粉酶抑制劑粗提液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、離子交換色 譜和反相色譜的分離純化后獲得一個(gè)具有抑制α -淀粉酶活性的蛋白，它屬于貯藏蛋白類 型（其在NCBI中編號為Q9SMJ4)，受Q9SMJ4基因控制，完全不同于已知的α -淀粉酶抑制 劑類型，是一種新的類型。該蛋白由alpha亞基（或蛋白鏈）和beta亞基（或蛋白鏈）2 個(gè)亞基組成，為蛋白前體，其在生物體內(nèi)最終將剪切生成alpha鏈和beta鏈。alpha肽鏈和 beta肽鏈蛋白空間結(jié)構(gòu)中各含有一個(gè)Cupin結(jié)構(gòu)（如圖1)。我們進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)凡具有 Cupin結(jié)構(gòu)（功能域）的蛋白普遍具有α-淀粉酶抑制活性，Cupin結(jié)構(gòu)為關(guān)鍵的功能域。 由于鷹嘴豆籽粒中該貯藏蛋白類型α -淀粉酶抑制劑含量很少，采用天然鷹嘴豆籽粒材料 進(jìn)行提取純化，過程復(fù)雜，成本昂貴，不適于此類蛋白的提取分離和開發(fā)利用。采用生物技 術(shù)，運(yùn)用合理的生物工藝流程可為鷹嘴豆中α-淀粉酶抑制劑的生產(chǎn)及純化提供新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種具有Cupin結(jié)構(gòu)功能域的貯 藏蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的生產(chǎn)和純化方法。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種具有Cupin結(jié)構(gòu)功能域的貯藏蛋白類型α -淀粉酶抑制劑的生產(chǎn)和純化方 法，包括以下步驟（1)和選自步驟（2)和步驟（3)中的一項(xiàng)或兩項(xiàng)：
[0008] (1)原核表達(dá)體系構(gòu)建及菌液培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)：
[0009] 將目的蛋白的ORF克隆至原核表達(dá)載體，并構(gòu)建Q9SMJ4蛋白大腸桿菌原核表達(dá)體 系；培養(yǎng)Q9SMJ4蛋白大腸桿菌原核表達(dá)體系，并誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)；其中所述的原核表達(dá) 載體含有His標(biāo)簽蛋白編碼基因；
[0010] ⑵原核表達(dá)可溶性蛋白純化：
[0011] a.每50mL培養(yǎng)菌液收集的菌體用IOmL緩沖液1重懸菌體，，并加入150~200 μ L 35% 的 TritonX-IOO 和 50 ~100 μ L IOOmM 的 PMSF ;
[0012] b.將重懸菌液置于冰上，超聲破碎菌體；
[0013] c.將超聲破碎過的菌液離心，收集上清，棄沉淀；
[0014] d.將含有His標(biāo)簽蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0. 5-1. OmL/min，直至上 清液完全流過Ni柱；
[0015] e.用6~10倍柱體積的緩沖液2沖洗Ni柱或直至A28tl值達(dá)到穩(wěn)定；
[0016] f.洗脫His標(biāo)簽表達(dá)蛋白采用梯度洗脫方式，每一梯度洗脫體積為4~5個(gè)柱體 積，收集各個(gè)梯度洗脫蛋白；
[0017] g.通過SDS-PAGE電泳檢測上一步中各洗脫梯度洗脫蛋白純度，確定適合收集的 洗脫組分；
[0018] h.將收集的洗脫蛋白液裝入截留分子量為3600Da的透析袋中，放入超純水中透 析20~24h除鹽，期間晃動(dòng)透析袋并更換超純水；
[0019] i.將透析結(jié)束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中濃縮至適當(dāng)體積，即 為原核表達(dá)并純化收集的目的可溶性蛋白溶液；
[0020] (3)原核表達(dá)包涵體蛋白純化及蛋白復(fù)性：
[0021] a.每50mL培養(yǎng)菌液收集的菌體用0.1 M磷酸緩沖液IOmL重懸菌體；
[0022] b.將重懸菌液置于冰上，超聲破碎菌體；
[0023] c.將超聲破碎過的菌液離心，收集沉淀，棄上清；
[0024] d.用0. 1~0. 3M磷酸緩沖液洗滌沉淀，離心，收集沉淀；
[0025] e.用IOmL溶解液溶解沉淀，在室溫下孵育l_2h ;
[0026] f.離心30~40min，收集上清液，棄沉淀不溶物；
[0027] g.用8~10倍柱體積緩沖液3平衡Ni柱，控制流速為0. 5-1. OmL/min ;
[0028] h.將步驟f中收集到的含有His標(biāo)簽蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速 0. 5-1. OmL/min，直至上清液完全流過Ni柱，上樣體積：柱體積比例最大為15:1 ;i.用4~ 6倍柱體積緩沖液3再次平衡Ni柱，控制流速0. 5-1. OmL/min ;
[0029] j.用2~3倍柱體積的緩沖液4沖洗Ni柱或直至A28tl值達(dá)到穩(wěn)定，流速控制為 1. OmL/min ；
[0030] k.用5~7倍柱體積的緩沖液5洗脫包涵體蛋白流速控制為1.0 mL/min ;
[0031] I. SDS-PAGE電泳檢測上一步洗脫蛋白純度及純化效果；
[0032] m.在4°C條件下將洗脫收集到的包涵體蛋白自然復(fù)性，向溶液中慢慢加入超純 水，使溶液中脲濃度進(jìn)行梯度稀釋；
[0033] η.將復(fù)性結(jié)束的蛋白溶液裝入截留分子量為3600Da的透析袋中，放入超純水中 透析20~25h除鹽，期間晃動(dòng)透析袋并更換超純水；
[0034] 〇·將透析結(jié)束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中濃縮至適當(dāng)體積，即 為原核表達(dá)純化收集并復(fù)性的目的包涵體蛋白溶液。
[0035] cupin結(jié)構(gòu)是指由至少6個(gè)β-折疊片形成的桶狀結(jié)構(gòu)，cupin結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)保守 的基本區(qū)域組成，每個(gè)區(qū)域中個(gè)含有兩個(gè)β折疊二級結(jié)構(gòu)，兩個(gè)基本保守區(qū)域之間通過一 段可變化的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相連接；一個(gè)保守區(qū)域的基本構(gòu)成為G(X) 5HXH(X)mE(X)6G，另一個(gè)保 守區(qū)域基本構(gòu)成為G (X) 5PXG (X) 2H(X) 3Ν，但保守區(qū)域中的氨基酸在一些cupin家族蛋白中 表現(xiàn)出非保守性。
[0036] 所述的cupin蛋白結(jié)構(gòu)域來源于高等綠色植物、芽孢桿菌、子囊菌中，含有cupin 結(jié)構(gòu)域蛋白家族包括種子IlS和7S貯藏蛋白、萌發(fā)素以及多種功能性蛋白。
[0037] 作為本發(fā)明方法的一種優(yōu)選，所述的具有Cupin結(jié)構(gòu)功能域的貯藏蛋白類型 α -淀粉酶抑制劑為鷹嘴豆籽粒中貯藏蛋白類型α -淀粉酶抑制劑，該抑制劑在NCBI中編 號為Q9SMJ4,命名為Q9SMJ4蛋白。所述的鷹嘴豆貯藏蛋白Q9SMJ4蛋白含有2個(gè)cupin結(jié) 構(gòu)域，分別位于其α和β亞基鏈上。
[0038] 作為本發(fā)明方法的一種優(yōu)選，所述的（1)原核表達(dá)體系構(gòu)建及菌液培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá) 進(jìn)一步優(yōu)選包括：
[0039] a.以鷹嘴豆發(fā)育種子的cDNA為模板，通過PCR方法獲得編碼貯藏蛋白類型α -淀 粉酶抑制劑的ORF序列；
[0040] b.利用PCR技術(shù)在編碼Q9SMJ4蛋白ORF序列的5'和3'端分別添加限制性酶切 位點(diǎn)序列EcoR I和Not I，獲得目的基因片段；其中Q9SMJ4蛋白ORF序列去除編碼蛋白 信號肽序列；
[0041] c.利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I對步驟b中獲得的目的基因片段以及 pET-28a(+)原核表達(dá)載體質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，膠回收處理過的目的基因片段和質(zhì)粒DNA片 段；
[0042] d.將上一步獲得的已用限制性內(nèi)切酶處理過的DNA片段用1\連接酶在16°C條件 下連接，獲得重組原核表達(dá)載體；
[0043] e.將獲