c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)及篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)，包括c-Cbl蛋白、熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白、熒光分子標(biāo)記泛素-UbCH7蛋白，三者的摩爾比為(0.4μM～2μM)：(0.4μM～2μM)：(20nM～40μM)。本發(fā)明還公開了一種c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選方法。本發(fā)明c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選方法可以準(zhǔn)確、有效地篩選c-Cbl蛋白泛素化抑制劑，為篩選代謝性相關(guān)疾病的藥物打下良好的基礎(chǔ)，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說明】
c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)及篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及C-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)和篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002]Cbl (Casitas B-1ineage lymphoma)蛋白是一類在生物體內(nèi)廣泛分布的細(xì)胞內(nèi)蛋白，屬于泛素連接酶E3系。c-Cbl在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，但主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。c-Cbl由N-端高度保守的酪氨酸激酶結(jié)合功能域(Tyrosine kinase binding domain,TKB)、環(huán)狀功能域(RING)、富含脯氨酸功能域、C-端與泛素結(jié)合(Ubiquitin_associated,UBA)的功能域及與之重疊的亮氨酸拉鏈功能域組成。c-Cbl分子中的TKB及其他功能域可以識別并結(jié)合靶蛋白，RING功能域負(fù)責(zé)募集泛素結(jié)合酶E2，從而啟動泛素化降解途徑。c-Cbl通過調(diào)控信號蛋白參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控，這對于維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。
[0003]2型糖尿病(舊稱非胰島素依賴型糖尿病或成人糖尿病)，是一種嚴(yán)重的代謝性疾病，患者的主要特征為胰島素抵抗、相對胰島素缺乏和高血糖，常需要給予藥物或胰島素治療，但也可通過增加體育運動和膳食控制病情。在發(fā)達(dá)國家，近年來2型糖尿病患者數(shù)迅速增加，美國疾病控制和預(yù)防中心已將2型糖尿病歸入流行病之一。2型糖尿病過去在40歲以上的成年人中發(fā)病，而今越來越多的未成年人也身患此病，其原因可能是由于該年齡段的高肥胖率所致，2型糖尿病常與肥胖、高血壓、高膽固醇(混合型高血脂癥)以及“代謝綜合征”(又稱X綜合癥、Reavan’ s綜合征、CHAOS綜合癥)相關(guān)，同時也與肢端肥大、柯興氏綜合征以及許多其他內(nèi)分泌疾病相關(guān)。2型糖尿病復(fù)雜且多因素的代謝改變常導(dǎo)致多個器官的損傷和功能損害，其中最重要的累及部位即是心血管系統(tǒng)，導(dǎo)致患者心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著上升，因此2型糖尿病已成為當(dāng)前嚴(yán)重的世界性問題并引起了眾多醫(yī)生以及科研人員的關(guān)注，特別是對胰島素的敏感度降低以及糖脂代謝的研究更是目前國際關(guān)注的熱點之一。在過去的幾十年里，一系列調(diào)控食欲、食物吸收以及增加肌肉組織或脂肪組織能量消耗的基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其中c-Cbl基因就參與了全身能量消耗的調(diào)控。2004年CooneyGJ研究發(fā)現(xiàn)，c-Cbl在調(diào)控全身能量平衡中起著重要的作用。2006年，該組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)證明c-Cbl通過調(diào)節(jié)胰島素敏感度參與了全身能量平衡的調(diào)控以及c-Cbl泛素連接酶E3功能域參與了身體能量平衡的調(diào)控。
[0004]綜上，c-Cbl蛋白功能域參與了機體能量平衡的調(diào)控，是潛在的治療代謝性相關(guān)疾病的藥物靶點，然而目前對c-Cbl蛋白抑制劑的研究尚為空白。如果我們能成功篩選出抑制c-Cbl蛋白的抑制劑，那么通過抑制c-Cbl蛋白對身體能量平衡的調(diào)控，將可以增加機體氧氣消耗量，胰島素敏感度以及能量消耗量，從而有效降低體重以及調(diào)控其機體能量平衡，同時本研究將有助于鑒定和確證c-Cbl蛋白作為新的藥物靶點的可能性，有助于闡明c-Cbl的某些病理生理學(xué)意義，對于治療糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的新型藥物研發(fā)以及為靶向c-Cbl蛋白的藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和實踐指導(dǎo)。
[0005]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的檢測技術(shù)是近年來被應(yīng)用于藥物高通量篩選(HTS)的重要方法之一。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移(即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)。FRET是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程，使供體熒光強度降低，而受體可以發(fā)射更強于本身的特征熒光(敏化熒光)，也可以不發(fā)熒光(熒光猝滅)，同時也伴隨著熒光壽命的相應(yīng)縮短或延長。能量轉(zhuǎn)移的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等因素有關(guān)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)和篩選方法。
[0007]本發(fā)明c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)，包括c-Cbl蛋白、熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白、熒光分子標(biāo)記泛素-UbCH7蛋白，三者的摩爾比為(0.4μΜ?2μΜ):(0.4 μ M ?2 μ Μ): (20ηΜ ?40 μ Μ)。
[0008]ΖΑΡ-70 蛋白:ξ 鏈連接蛋白(Zap-70)。
[0009]UbCH7蛋白:泛素連接酶蛋白。
[0010]所述熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白為銪熒光標(biāo)記的ZAP-70蛋白。
[0011]所述銪熒光標(biāo)記的ZAP-70蛋白按照如下方法制備:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白在室溫下孵育10?30分鐘，即可。
[0012]所述抗-651^113+-抗體與651'-2六卩70蛋白摩爾比為2?6:1，優(yōu)選4:1。
[0013]所述熒光分子標(biāo)記的泛素_UbCH7蛋白為別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素-UbCH7蛋白。
[0014]所述別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白按照如下方法制備:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub-UbCH7蛋白在室溫下孵育10?30分鐘。
[0015]所述抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白的摩爾比為10?30:1，優(yōu)選20:1。
[0016]本發(fā)明c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選方法，包括如下步驟:
[0017](I)取ZAP-70蛋白和泛素-UbCH7蛋白，分別用熒光標(biāo)記，得熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白、熒光分子標(biāo)記泛素_UbCH7蛋白，混合，得混合溶液；
[0018](2)取待測樣品，加入c-Cbl蛋白溶液，再加入步驟(I)所得混合溶液混合，測定熒光值；
[0019](3)根據(jù)熒光值，判斷待測化合物是否為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑。
[0020]所述熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白為銪熒光標(biāo)記的ZAP-70蛋白。
[0021]將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白在室溫下孵育10?30分鐘，即可。
[0022]所述抗-651^113+-抗體與651'-2六?70蛋白摩爾比為2?6:1，優(yōu)選4:1。
[0023]所述熒光分子標(biāo)記的泛素_UbCH7蛋白為別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素-UbCH7蛋白。
[0024]所述別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白按照如下方法制備:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub-UbCH7蛋白在室溫下孵育10?30分鐘。
[0025]所述抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白的摩爾比為10?30:1，優(yōu)選20:1。
[0026]步驟(I)中，所述混合溶液中，熒光分子標(biāo)記泛素_UbCH7蛋白的濃度為I?5 μ M，終濃度為0.4μΜ?2μΜ ;熒光分子標(biāo)記的ΖΑΡ-70蛋白的濃度為20ηΜ?40ηΜ。
[0027]步驟⑵中，所述待測樣品的濃度為5μΜ?15μΜ。優(yōu)選地，所述待測樣品的濃度為 10 μ Μ。
[0028]步驟⑵中，所述待測樣品的濃度為0.4 μ M?2 μ Μ。
[0029]步驟⑵中，所述待測樣品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的體積比為(0.5?1.5): (1.5?2.5): (1.5?2.5)。優(yōu)選地，所述待測樣品、c_Cbl蛋白溶液和混合溶液的體積比為1:2:2。
[0030]本發(fā)明根據(jù)c-Cbl蛋白(E3)與泛素化_UbCH7蛋白(E2)結(jié)合進(jìn)而將泛素蛋白轉(zhuǎn)移給其底物ZAP70蛋白這一泛素化過程，用熒光(銪和別藻藍(lán)蛋白)標(biāo)記泛素化_UbCH7蛋白以及ZAP70蛋白，以熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)對待測化合物進(jìn)行高通量篩選以確證待測化合物對c-Cbl泛素化的抑制作用。
[0031]本發(fā)明高通量篩選方法，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)篩選c-Cbl蛋白泛素化抑制齊U，Z因子達(dá)到0.62，可信度高，穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高，操作簡便，成本低廉，應(yīng)用前景良好。
[0032]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0033]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗示意圖；
[0035]圖2熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗溫度穩(wěn)定性測定；
[0036]圖3熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗DMSO穩(wěn)定性測定；
[0037]圖4熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗時間穩(wěn)定性測定；
[0038]圖5熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗質(zhì)量評估。

【具體實施方式】
[0039]縮略語:生物素-泛素-標(biāo)記的UbCH7蛋白:B1tin-Ub-UbCH7 ;銪熒光標(biāo)記ZAP-70:Eu-ZAP70 ;別藻藍(lán)熒光蛋白:APC。
[0040]抗-GST-Eu3+-抗體、GST-ZAP70蛋白、抗-B1tin-APC 抗體、B1tin-Ub_UbCH7 蛋白，均為市售品。
[0041]實施例1c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選
[0042]1、實驗材料
[0043]銪熒光標(biāo)記ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得EU-ZAP70。
[0044]別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得APC-Ub-UbCH7。
[0045]2、篩選方法
[0046]用10% DMSO制備終濃度為10 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為0.4μ M的C-Cbl蛋白的溶液。將20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的終濃度為20nM。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0047]若待測化合物抑制50%的熒光信號，則為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0048]突光共振能量轉(zhuǎn)移實驗示意圖如圖1所示。
[0049]實施例2c_Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選
[0050]1、實驗材料
[0051]銪熒光標(biāo)記ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得EU-ZAP70。
[0052]別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得APC-Ub-UbCH7。
[0053]2、篩選方法
[0054]用10% DMSO制備終濃度為10 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為0.4μΜ的C-Cbl蛋白的溶液。將20μ1 C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的終濃度為40nM。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0055]若待測化合物抑制50%的熒光信號，則為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0056]實施例3c_Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選
[0057]1、實驗材料
[0058]銪熒光標(biāo)記ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比2:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得EU-ZAP70。
[0059]別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得APC-Ub-UbCH7。
[0060]2、篩選方法
[0061]用10% DMSO制備終濃度為15 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為2 μ M的C-Cbl蛋白的溶液。將20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的終濃度為2 μ M，EU-ZAP70蛋白的終濃度為20ηΜ。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0062]若待測化合物抑制50%的熒光信號，則為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0063]實施例4c_Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選
[0064]1、實驗材料
[0065]銪熒光標(biāo)記ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得EU-ZAP70。
[0066]別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得APC-Ub-UbCH7。
[0067]2、篩選方法
[0068]用10% DMSO制備終濃度為10 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為2 μ M的C-Cbl蛋白的溶液。將20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的終濃度為2 μ M，EU-ZAP70蛋白的終濃度為40ηΜ。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0069]若待測化合物抑制50%的突光信號,則為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0070]實施例5c_Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選
[0071]1、實驗材料
[0072]銪熒光標(biāo)記ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得EU-ZAP70。
[0073]別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘，即得APC-Ub-UbCH7。
[0074]2、篩選方法
[0075]用10% DMSO制備終濃度為10 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為0.6μ M的C-Cbl蛋白的溶液。將20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的終濃度為I μ M，Eu_ZAP70蛋白的終濃度為30nM。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0076]若待測化合物抑制50%的突光信號,則為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0077]實施例6c_Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選
[0078]1、實驗材料
[0079]銪熒光標(biāo)記ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比2:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育10分鐘，即得EU-ZAP70。
[0080]別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比10:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育10分鐘，即得APC-Ub-UbCH7。
[0081]2、篩選方法
[0082]用10% DMSO制備終濃度為5 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為0.4 μ M的C-Cbl蛋白的溶液。將20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的終濃度為20ηΜ (。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0083]若待測化合物抑制50%的熒光信號，則為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0084]實施例7c_Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選
[0085]1、實驗材料
[0086]銪熒光標(biāo)記ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比6:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育30分鐘，即得EU-ZAP70。
[0087]別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比30:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育30分鐘，即得APC-Ub-UbCH7。
[0088]2、篩選方法
[0089]用10% DMSO制備終濃度為15 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為0.4μ M的C-Cbl蛋白的溶液。將20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的終濃度為40nM。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0090]實驗例8本發(fā)明方法的參數(shù)優(yōu)選實驗
[0091]1、實驗方法
[0092](I)將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0093](2)將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0094](3)配置終濃度為0.4 μ M的c-Cbl的溶液。將20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的終濃度為40nM。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在20，25，30，40以及50°C下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液，于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0095]2、實驗結(jié)果
[0096]實驗結(jié)果如圖2所示，實驗所測的熒光值隨溫度的改變而改變，當(dāng)溫度達(dá)到30°C時，所測的熒光值下降到20°C時的80%左右；當(dāng)溫度達(dá)到40°C時，所測的熒光值下降到20°C時的70%左右；當(dāng)溫度達(dá)到50°C時，所測的熒光值下降到20°C時的50%左右。
[0097]因此，本發(fā)明高通量篩選的溫度應(yīng)當(dāng)不高于40°C，優(yōu)選為室溫(20±5°C )。
[0098]實驗例9本發(fā)明方法的參數(shù)優(yōu)選實驗
[0099]1、實驗方法
[0100](I)將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0101](2)將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub-UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0102](3)將10 μ I終濃度為0，2，5，10以及30%的DMSO (ν/ν)加入96孔板。配置終濃度為0.4 μ M的C-Cbl的溶液。將20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC_Ub_UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的終濃度為40ηΜ。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合,使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0103]2、實驗結(jié)果
[0104]實驗結(jié)果如圖3所示，實驗所測的熒光值隨DMSO濃度的增加而增加，當(dāng)DMSO濃度到達(dá)10%時，所測的熒光值被抑制20%左右；當(dāng)DMSO濃度到達(dá)30%時，所測的熒光值被抑制50%左右。
[0105]DMSO用于溶解不易溶解在水中的化合物，因此本發(fā)明高通量篩選方法中，DMSO濃度可以為2?10%，定優(yōu)選為2%。
[0106]實驗例10本發(fā)明方法的參數(shù)優(yōu)選實驗
[0107]1、實驗方法
[0108](I)將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0109](2)將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0110](3)將10μ1終濃度為2%的DMS0(v/v)加入96孔板。配置終濃度為0.4μΜ的c-Cbl的溶液。將20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC_Ub_UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的終濃度為40ηΜ。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育O?30分鐘(每分鐘測定一次樣品)，加入200 μ I反應(yīng)終止液，于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。
[0111]2、實驗結(jié)果
[0112]實驗結(jié)果如圖4所示，實驗所測的熒光值隨時間的增加而上升，當(dāng)實驗到達(dá)15分鐘時，熒光度趨近飽和，此后熒光值一直保持飽和。
[0113]本發(fā)明高通量篩選方法中，反應(yīng)時間不高于15min,優(yōu)選為10分鐘。
[0114]以下用實驗例的方式說明本發(fā)明的有益效果:
[0115]實驗例I本發(fā)明方法的可信度
[0116]1、實驗方法
[0117](I)將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0118](2)將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub-UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0119](3)將10μ1終濃度為2%的DMS0(v/v)加入96孔板。配置終濃度為0.4μΜ的c-Cbl的溶液。將20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ I APC_Ub_UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的終濃度為40ηΜ。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合,使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。重復(fù)上述實驗，將不同批次的實驗結(jié)果進(jìn)行比較，計算Z因子的數(shù)值。
[0120]Z因子=1_3(σρ+ση)/| μρ-μη|)進(jìn)行計算，其中σ =標(biāo)準(zhǔn)差，ρ =信號，η =背景)，得到該極化熒光實驗的Z因子數(shù)值。
[0121]2、實驗結(jié)果
[0122]實驗結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)RET實驗的有效劑量窗口為?12000RFu，信噪比高，重復(fù)性好，可用于高通量篩選。
[0123]同時，Z因子達(dá)到0.62，說明本發(fā)明方法可信度高，穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高。
[0124]實驗例2采用本發(fā)明方法篩選化合物
[0125]1、實驗方法
[0126](I)將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比4:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0127](2)將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩爾比20:1進(jìn)行混合，在室溫下孵育20分鐘。
[0128](3)用10% DMSO制備終濃度為10 μ M待測化合物。將10 μ I待測化合物加入96孔板。配置終濃度為0.4 μ M的C-Cbl的溶液。將20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。將20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的終濃度為40ηΜ。震動96孔板30秒充分混勻反應(yīng)液后在室溫下孵育10分鐘，加入200 μ I反應(yīng)終止液,于測試前震動96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2讀板器對樣品熒光值進(jìn)行讀取。若待測化合物抑制50%的熒光信號，則為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0129]2、實驗結(jié)果
[0130]利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移通過對10，000中藥化合物進(jìn)行c-Cbl泛素化抑制的高通量篩選，得到28個c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的備選藥物。
[0131]綜上，c-Cbl蛋白參與了機體能量平衡的調(diào)控，是潛在的治療代謝性相關(guān)疾病的藥物靶點，本發(fā)明c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的篩選方法可以準(zhǔn)確、有效地篩選c-Cbl蛋白泛素化抑制劑，為篩選代謝性相關(guān)疾病的藥物打下良好的基礎(chǔ)，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種C-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)，其特征在于:包括C-Cbl蛋白、熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白、熒光分子標(biāo)記的泛素_UbCH7蛋白，三者的摩爾比為(0.4 μ M?2 μ Μ): (0.4 μ M ?2 μ Μ): (20ηΜ ?40 μ Μ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于:所述熒光分子標(biāo)記的ΖΑΡ-70蛋白為銪熒光標(biāo)記的ΖΑΡ-70蛋白； 優(yōu)選地，所述銪熒光標(biāo)記的ΖΑΡ-70蛋白按照如下方法制備:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比為(2?6):1的比例混合，在室溫下孵育10?30分鐘，即可；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述摩爾比為4:1，孵育時間為20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于:所述熒光分子標(biāo)記的泛素_UbCH7蛋白為別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記的生物素-泛素_UbCH7蛋白； 優(yōu)選地，所述別藻藍(lán)熒光蛋白標(biāo)記的生物素-泛素-UbCH7蛋白按照如下方法制備:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub-UbCH7蛋白，以摩爾比為(10?30):1的比例混合，在室溫下孵育10?30分鐘；進(jìn)一步優(yōu)選地所述摩爾比為20:1，孵育時間為20min。
4.一種c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取ZAP-70蛋白和泛素-UbCH7蛋白，分別用熒光標(biāo)記，得熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白、熒光分子標(biāo)記的泛素_UbCH7蛋白，混合，得混合溶液； (2)取待測樣品，加入c-Cbl蛋白溶液，再加入步驟(I)所得混合溶液混合，測定熒光值； (3)根據(jù)熒光值，判斷待測化合物是否為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于:步驟(I)中，所述熒光分子標(biāo)記的ZAP-70蛋白為銪熒光標(biāo)記的ZAP-70蛋白； 優(yōu)選地，所述銪熒光標(biāo)記的ZAP-70蛋白按照如下方法制備:將抗-GST-Eu3+-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比為(2?6):1的比例混合，在室溫下孵育10?30分鐘，即可；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述摩爾比為4:1，孵育時間為20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于:步驟(I)中，所述熒光分子標(biāo)記的泛素-UbCH7蛋白為別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記的生物素-泛素_UbCH7蛋白； 優(yōu)選地，所述別藻藍(lán)熒光蛋白(APC)標(biāo)記的生物素-泛素_UbCH7蛋白按照如下方法制備:將抗-B1tin-APC抗體與B1tin-Ub-UbCH7蛋白，以摩爾比為(10?30):1的比例混合，在室溫下孵育10?30分鐘；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述摩爾比為20:1，孵育時間為20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述混合溶液中，熒光分子標(biāo)記泛素_UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μ M?2 μ M ;熒光分子標(biāo)記的ΖΑΡ-70蛋白的濃度為20ηΜ ?40ηΜ。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述待測樣品的濃度為5 μ M ?15 μ M ； 優(yōu)選地，所述待測樣品的濃度為ΙΟμΜ。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述c-Cbl蛋白的濃度為0.4 μ M ?2 μ Μ。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述待測樣品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的體積比為(0.5?1.5): (1.5?2.5): (1.5?2.5)；
優(yōu)選地，所述待測樣品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的體積比為1:2:2。
【文檔編號】G01N21/64GK104458681SQ201410491980
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】孫毅毅, 謝興亮, 鐘玲, 林東 申請人:成都醫(yī)學(xué)院