專(zhuān)利名稱(chēng)：高效RNA干擾聯(lián)合Bt基因雙重防治番茄根結(jié)線蟲(chóng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病蟲(chóng)防治技術(shù)領(lǐng)域，高效RNA干渉基因和殺線蟲(chóng)Bt基因聚合轉(zhuǎn)化番茄，雙重效果共同防治根結(jié)線蟲(chóng)。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲(chóng)病嚴(yán)重危害我國(guó)蔬菜、棉花、花生、煙草等多種經(jīng)濟(jì)作物和水稻、玉米等糧食作物的重要生物災(zāi)害，近年來(lái)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)與布局調(diào)整后問(wèn)題進(jìn)一歩突出。目前對(duì)于作物線蟲(chóng)病害的防治主要依賴(lài)于殺線蟲(chóng)劑，由于殺線蟲(chóng)劑防治效果差導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)，加之不合理使用帶來(lái)了產(chǎn)品污染和生態(tài)環(huán)境破壞。因此，作物線蟲(chóng)病害的嚴(yán)重危害，直接威脅著我國(guó)的糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品安全。利用植物介導(dǎo)的RNAi沉默線蟲(chóng)的關(guān)鍵基因成為潛在的最有價(jià)值的防治策略，可實(shí)現(xiàn)對(duì)植物線蟲(chóng)RNAi介導(dǎo)的分子調(diào)控(Urwin et al., 2002; Atkinson etal.，2003; Victoria et al.，2008)。根結(jié)線蟲(chóng)和胞囊線蟲(chóng)的生長(zhǎng)和繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是通過(guò)寄生在植物根部提供，利用植物表達(dá)線蟲(chóng)特異基因的dsRNA可實(shí)現(xiàn)對(duì)植物線蟲(chóng)的RNAi介導(dǎo)的分子調(diào)控。從微生物資源中挖掘抗線蟲(chóng)基因是另ー個(gè)重要的途徑。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)產(chǎn)生的內(nèi)毒素是ー種對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、線蟲(chóng)等無(wú)脊椎動(dòng)物具有活性的殺蟲(chóng)晶體蛋白(Crystal protein)，對(duì)人、畜和ー些有益昆蟲(chóng)不產(chǎn)生毒害作用，且不會(huì)造成環(huán)境污染。目前全世界共獲得了 70種轉(zhuǎn)Bt基因的植物，種植面積達(dá)到26億公頃(James，2005)。雖然在80年代初就有公司對(duì)Bt對(duì)線蟲(chóng)具有毒殺作用進(jìn)行了專(zhuān)利保護(hù)。但是，人們對(duì)Bt殺線蟲(chóng)基因的研究卻較少。2000年,加州大學(xué)Marroquin等(Marroquin et al.，2000)證實(shí)Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)線蟲(chóng)具有毒殺作用，具有殺線劑的潛力。將晶體蛋白喂食模式線蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)出現(xiàn)不育，死亡等癥狀。2003年，加州大學(xué)的Wei等(Weiet al., 2003)研究表明，Cry5Aa> Cry5B> Cry6B> Cryl2A> Cryl3A> and Cryl4A> Cry21A 蛋白對(duì)模式線蟲(chóng)均有毒殺作用。隨后，Barrows等(Barrows et al.，2007)驗(yàn)證了 Cry5B對(duì)模式線蟲(chóng)的作用。但是Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的研究卻沒(méi)有進(jìn)展。直到2007年和2008年，美國(guó)加州大學(xué)才將對(duì)模式線蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)效果的Cry6A和Cry5B基因分別轉(zhuǎn)化到番茄(Li et al., 2007; Li et al.，2008)，接種南方根結(jié)線蟲(chóng)后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因番茄的根結(jié)數(shù)量和卵塊數(shù)量均明顯下降，說(shuō)明Bt殺線蟲(chóng)基因具有巨大的應(yīng)用潛力。目前，已發(fā)現(xiàn)cry5、cry6、cryl2、cryl3、cryl4和cry21基因?qū)€蟲(chóng)具有毒殺作用。蘇云金芽胞桿菌的晶體毒蛋白具有廣譜的毒殺線蟲(chóng)功能，其基因在轉(zhuǎn)基因抗線蟲(chóng)育種中將具有廣泛的利用前景，但仍需提高特異毒殺寄生線蟲(chóng)的活性。如通過(guò)轉(zhuǎn)基因疊加多個(gè)抗線蟲(chóng)功能基因來(lái)轉(zhuǎn)化培育作物廣譜高效的抗線蟲(chóng)新品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù) 創(chuàng)造新的抗線蟲(chóng)植物品系對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的防治，環(huán)境保護(hù)及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。但是，単一基因的轉(zhuǎn)化，其防效有限。因此，采用轉(zhuǎn)化作用不同的分子靶標(biāo)基因有助于提高植物的抗性。由于RNA干渉和Bt對(duì)植物線蟲(chóng)的作用分子靶標(biāo)不同，將這兩種基因以不同的進(jìn)行疊加轉(zhuǎn)化與功能聚合，將可達(dá)到高效、廣譜和持久抗線蟲(chóng)的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的空白和根結(jié)線蟲(chóng)防治的需要，提供一種高效RNA干渉基因和殺線蟲(chóng)Bt基因共同作用的抗線蟲(chóng)方法及品種資源，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種高效RNA干擾聯(lián)合Bt基因雙重防治番茄根結(jié)線蟲(chóng)的方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)以轉(zhuǎn)入有尺熟干擾載體？046(:1341づ6 11018熟1的轉(zhuǎn)基因番茄為宿主植物轉(zhuǎn)化外植體，(2)構(gòu)建含有外源基因的表達(dá)載體，所述外源基因指編碼蘇云金芽孢桿菌的Bt-Cry6A晶體蛋白的基因，(3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主植物轉(zhuǎn)化外植體中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。所述構(gòu)建好的重組表達(dá)載體指pBI121-06。所述將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主植物轉(zhuǎn)化外植體中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其特征在于采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌EHA105。所述將重組表達(dá)載體 轉(zhuǎn)入宿主植物轉(zhuǎn)化外植體中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，包括如下步驟:( I)準(zhǔn)備宿主植物轉(zhuǎn)化外植體，(2)制備根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液，(3)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液侵染外植體,然后共培養(yǎng)，(4)對(duì)共培養(yǎng)的外植體進(jìn)行選擇培養(yǎng)以分化愈傷組織，，(5)生根培養(yǎng)分化的愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株。所述準(zhǔn)備植物轉(zhuǎn)化外植體包括外植體預(yù)培養(yǎng)，指將取自番茄幼苗的外植體放置在MS+50 u g/ u Iこ酰丁香酮的固體培養(yǎng)基上，光照預(yù)培養(yǎng)2天，所述共培養(yǎng)指采用MS+100ii g/ii Iこ酰丁香酮固體培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)2天。所述選擇培養(yǎng)指采用MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧芐青霉素+50 y g/ml卡那霉素+IOy g/ml玉米素,26_28°C,光照培養(yǎng)16h,所述生根培養(yǎng)指長(zhǎng)到2 3厘米的分化良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基MS+0.25mg/LIAA+25 u g/ml 卡那霉素 +200 u g/ml 頭孢霉素上。所述制備根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液指采用1/2濃度的液體MS + 200 U g/ U I的こ酰丁香酮為懸浮劑懸浮菌體。本發(fā)明前期，將南方根結(jié)線蟲(chóng)的蛋白激酶基因MiMPKl基因的編碼區(qū)域的片段構(gòu)建成RNA干擾載體轉(zhuǎn)入番茄中，獲得轉(zhuǎn)MiMPKl基因RNA干擾載體的番茄植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄植株接種南方根結(jié)線蟲(chóng)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的根結(jié)和卵塊數(shù)量降低。本發(fā)明提供優(yōu)化的Bt_Cry6A核苷酸序列，為使Bt_Cry6A基因其更適合于在植物中表達(dá)，本發(fā)明對(duì)表達(dá)Bt_Cry6A晶體蛋白Seq ID No2的初始核苷酸序列Seq ID No3的密碼子進(jìn)行優(yōu)化并合成。合成后的核苷酸序列Seq ID N0.4。本發(fā)明將合成的Bt_Cry6A基因克隆至載體pB1121獲得表達(dá)載體pB1121-06，轉(zhuǎn)入PBI121-06，獲得轉(zhuǎn)雙基因的番茄植株——同時(shí)表達(dá)MiMPKl基因和Bt-Cry6A基因的Ttl代植株，將南方根結(jié)線蟲(chóng)的2齡幼蟲(chóng)接種到該植株的根部，45天后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)雙基因植株比對(duì)照植株的卵塊數(shù)量低70%，以轉(zhuǎn)化単一基因的陽(yáng)性植株為對(duì)照，表達(dá)2個(gè)基因的植株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的抗性明顯更強(qiáng)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明高效RNA干渉基因和殺線蟲(chóng)Bt基因共同作用的番茄品種是抗線蟲(chóng)的優(yōu)質(zhì)品種資源。在植物抗線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因工程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了可靠的有效的線蟲(chóng)防治策略。


圖1.載體pCAGC1341構(gòu)建流程圖2.載體 pCAGC1341_TGPM01RNAi 構(gòu)建流程圖3.T0代轉(zhuǎn)基因番茄植株靶標(biāo)基因的PCR檢測(cè)圖4 載體pBI121-06結(jié)構(gòu)示意5.轉(zhuǎn)Bt_Cry6A基因的Ttl代番茄植株靶標(biāo)基因的PCR檢測(cè)圖6.T0代轉(zhuǎn)雙基因番茄植株RT-PCR檢測(cè)圖7.轉(zhuǎn)基因番茄的根部接種線蟲(chóng)45天后的根結(jié)和卵塊情況。A:對(duì)照植株的根部；轉(zhuǎn)干擾基因植株的根部；B ■ 轉(zhuǎn)Bt基因植株的根部；D:轉(zhuǎn)雙基因植株的根部
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)試驗(yàn)及數(shù)據(jù)具體說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施和其取得的有益效果。生物材料: 南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita),本實(shí)驗(yàn)室保存。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105,本實(shí)驗(yàn)室保存。植物材料番爺(SolanumIycopersicum),品種 Moneymaker (在 MAGDALENAROSSI, FIONA L.G0GGIN, STEPHEN B.MILLIGAN, ISG0UHI KAL0SHIAN, DIANE E.ULLMAN, ANDVALERIE M.WILLIAMSON.The nematode resistance gene Mi of tomato confersresistance against the potato aphid.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA:95(1998):9750 -9754.中記載)，本實(shí)驗(yàn)保存。骨架載體pBI121為已知載體(見(jiàn)Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong/ihang, jmghua Xiao, /,hioiao fe.CaMi, a root—knot nematode resistance gene fromhot pepper(Capsium annuum L.) confers nematode resistance in tomat0.Plant CellRep (2007) 26:895 - 905),由本實(shí)驗(yàn)室保存。蘇云芽孢桿菌目的基因Bt-Cry6A，其序列已知，由本實(shí)驗(yàn)合成。申請(qǐng)人:聲明，以上生物材料均在申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。主要儀器和試劑儀器:冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、電子天平、高壓滅菌鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、水浴鍋、移液器、勻漿器、離心管、槍頭、燒杯和PH計(jì)等。
試劑:柱式DNA小量抽提試劑盒和柱式DNA膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNAMarker2Kplus和克隆所用的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞等均購(gòu)自全式金生物公司；TA克隆試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xba I等均購(gòu)自Takara生物公司。MS培養(yǎng)基粉末購(gòu)自SIGMA公司。TAE 緩沖液(50X ):Tris 堿 242g，冰醋酸 57.1ml,0.5mol/L EDTA (pH8.0) 100ml。LB 培養(yǎng)基:酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 10g/L。卡那霉素:溶于水中，配制濃度為10mg/ml,儲(chǔ)存于_20°C ；氨芐青霉素:溶于水中，配制濃度為10mg/ml，儲(chǔ)存于_20°C ；利福平:溶于甲醇中，配制濃度為10mg/ml，儲(chǔ)存于_20°C，使用時(shí)稀釋為34iig/ml ；頭孢霉素:溶于水中，200mg/ml,儲(chǔ)存于_20°C,使用時(shí)稀釋為400 y g/ml。こ酰丁香酮AS:100mM，用無(wú)水こ醇溶解，放置于_20°C。實(shí)施例1:載體 pCAGC1341_TGPM01RNAi 構(gòu)建流程RNA干擾誘導(dǎo)載體pFGC5941(英國(guó)立茲大學(xué)惠贈(zèng)，為常用載體，可在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到)上帶有抗除草劑(BAR)基因，并且酶切位點(diǎn)與插入片段重復(fù)，所以需要構(gòu)建含有潮霉素選擇標(biāo)記的RNA干擾誘導(dǎo)載體，將pFGC 5941上的RNA干擾功能區(qū)(3577bp)插入帶有潮霉素選擇標(biāo)記的克隆載體pCAMBIA1300(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)室保存，可向公眾發(fā)放)用EcoRI/PstI 分別雙酶切 pFGC5941 和 pCAMBIA1300，37。C 消化過(guò)夜，將PCAMBIA1300的酶切產(chǎn)物電泳后切膠回收8.9kb片段，pFGC5941的酶切產(chǎn)物電泳后切膠回收3.5kb片段，用T4 DNA連接酶連接，16° C溫育過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，挑取長(zhǎng)出的陽(yáng)性單菌落，37° C 230rpm搖菌培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒。對(duì)提取的質(zhì)粒用EcoRI/PstI酶切鑒定，如果能夠切出大小為3.5kb和8.9kb的兩條特異性的條帶，即可確認(rèn)轉(zhuǎn)化子為插入了上述3.5kb的RNA干擾功能片段的PCAMBIA1300。連接所得的新質(zhì)粒為適合番茄轉(zhuǎn)化的RNA干擾誘導(dǎo)載體，命名為pCAGC1341 (圖1)。擴(kuò)增目的基因MiMPKl干擾區(qū)段核苷酸序列所用引物: PM01F: 5’-CGCTCTAGAGCTCTGGAGAAGGTGCTTATGGAATG-3，，PM01R:5’-CGCGGATCCATGGCATAATTTCAGGCGCTCGATAC-3’ ，退火溫度為:65°C目的基因插入片段PMOl的序列為Sequence N0.1所不，兩端含有Ncol、Sac1、BamH1.Xbal四個(gè)酶切位點(diǎn)，長(zhǎng)度為531bp。將目的基因MiMPKl基因的干擾片段PMOl (Sequence N0.1)插入到重組子載體PCAGC1341 上。選擇重組子載體pCAGC1341的4個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn):Nco1、Sac1、BamHI和Xbal，識(shí)別位點(diǎn)分別為C丨CATGG，GAGCT丨C，G丨GATCC和T丨CTAGA。將PMOl接在T載體上標(biāo)注為T(mén)-PM01，測(cè)序驗(yàn)證后，T-PM01與pCAGC1341同時(shí)用NcoI/SacI雙酶切，使PMOl正向連接到載體中；PM01與上一步得到的含有PMOl正向插入的中間載體同時(shí)用BamHl/Xbal雙酶切，使PMOl反向插入了載體中得到RNA干擾載體pCAGC1341-TGPM01RNAi (圖2)。
兩步構(gòu)建過(guò)程中得到的載體均轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并用NcoI/SacI雙酶切檢測(cè)其正確性。實(shí)施例2:構(gòu)建表達(dá)Bt_Cry6A的植物表達(dá)載體-pBI 121-06根據(jù)植物對(duì)核苷酸密碼子的偏好性，人工合成Bt_Cry6A，其的核苷酸序列，如SeqID N0.4 所示。載體pBI121-06的構(gòu)建以常規(guī)載體pB1-121為骨架，用限制性?xún)?nèi)切酶Xba I和BamH I雙酶切，將合成的Bt-CryBA基因與骨架載體分別酶切，回收目的片段，連接，鑒定后轉(zhuǎn)化，獲得植物表達(dá)載體pBI121-06(圖 4)。實(shí)施例3 -M pCAGC1341-TGPM01RNAi載體番茄植株的獲得本實(shí)驗(yàn)以根瘤農(nóng)桿菌為介導(dǎo)，把裝載有MiMPKl基因片段的pCAGC1341-TGPM01RNAi載體轉(zhuǎn)化到番茄中。通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。2.1根瘤農(nóng)桿菌的培養(yǎng)1.將根瘤農(nóng)桿菌(EHA105)劃線接種在LB培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)2_3天；2.挑取單個(gè)菌落接種于基本培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h ;3.在離心管中收集菌體，加入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使0D600調(diào)節(jié)至0.20左右，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)6h，0D600升高到0.4左右時(shí)即可停止。2.2農(nóng)桿菌感受態(tài)制作:(I)挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于20ml液體LB培養(yǎng)基中(含有50mg/L的利福平)，28 0C，200rpm 培養(yǎng) 48h ；(2)轉(zhuǎn)接500 u I搖培的EHA105至50ml液體LB (含有50mg/L的利福平)培養(yǎng)基中，28°C，200rpm培養(yǎng)至0D600值為0.6左右；(3)將菌液冰浴 30min, 4°C, 5000rpm 離心 IOmin,棄上清；(4)用50ml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體,4°C, 5000rpm,離心IOmin,棄上清，收集菌體；(5)用25ml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體,4°C, 5000rpm,離心IOmin,棄上清，收集菌體；(6)用IOml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體,4°C, 5000rpm,離心IOmin,棄上清，收集菌體；(7)用l_2ml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體，分裝50 U I/管，液氮中速凍后_80°C保存。2.3電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌:1.冰上融化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞50 ill;2.將I ill pCAGC1341-TGPM01 RNiA加入到50 U I農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，在離心管中混勻后轉(zhuǎn)移到電擊杯中，冰浴30s-60s ；3.將電擊杯放在適當(dāng)?shù)?位置，按住電擊按鈕進(jìn)行電擊；4.加500 ill不含任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28 °C，220rpm,振蕩培養(yǎng)3h，活化菌體；5.用滅菌槍頭將菌液混勻，吸取100 U I均勻涂于LB固體培養(yǎng)基(卡那50mg/L和利福平50mg/L)上，28°C培養(yǎng)48h。6.提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定或通過(guò)菌液PCR進(jìn)行檢測(cè)。2.4侵染菌液的制備:1.取轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h，至單菌落出現(xiàn)；2.挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28°C，220rpm，振蕩培養(yǎng)，0D600達(dá)到0.6左右時(shí)終止；3.5000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀物即為收集的菌體；4.將菌體用1/2濃度的液體MS培養(yǎng)基洗滌兩遍。5.為提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率，加懸浮液懸浮菌體，懸浮液為1/2濃度的液體MS加入200 u g/ u I的こ酰丁香酮(AS),懸浮后立即用于侵染。2.5番茄轉(zhuǎn)化外植體的準(zhǔn)備1.番爺種子用無(wú)菌水浸泡洗漆兩遍。2.用70%的こ醇浸泡番茄種子2min。3.棄去こ醇，加無(wú)菌水洗滌兩次。4.棄去無(wú)菌水，用20%的次氯酸鈉消毒15min。輕搖容器，加大種子與溶液的接觸。 5.棄去次氯酸鈉，用無(wú)菌水漂洗5-6次后吸干多余水分。6.將種子移入裝有MS培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶20 30粒，均勻擺放。7.26_28°C避光培養(yǎng)出芽后光照培養(yǎng)6-7天至子葉張開(kāi)角度120度。2.6番茄轉(zhuǎn)化外植體的預(yù)培養(yǎng)將待切番茄幼苗放在牛皮上，用鑷子夾住幼苗胚軸部分，使兩片子葉重疊、平鋪于培養(yǎng)皿底部，將子葉頂端切去，然后在靠近葉柄部位切一刀，切下方形子葉塊；胚軸截為小段。放置在MS+50 ii g/ill AS培養(yǎng)基上，光照，預(yù)培養(yǎng)2天。2.7番茄外植體轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)1.將預(yù)培養(yǎng)2d的子葉和胚軸從培養(yǎng)皿中移出，放入盛有農(nóng)桿菌菌液的錐形瓶中，輕輕搖蕩，侵染lOmin，控制侵染時(shí)間，以免時(shí)間較長(zhǎng)農(nóng)桿菌過(guò)量，污染外植體，同時(shí)時(shí)間長(zhǎng)外植體容易褐化，時(shí)間短則侵染效率低。2.取出后用液體MS沖洗后置無(wú)菌濾紙上吸干，轉(zhuǎn)入MS+lOOiig/iUAS共培養(yǎng)基平皿。3.避光，共培養(yǎng)2天。2.8番茄轉(zhuǎn)化外植體選擇分化將共培養(yǎng)結(jié)束的外植體轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基上(MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧芐青霉素+20 u g/ml潮霉素+10 u g/ml玉米素)，加入玉米素促進(jìn)外植體分化。26-28°C，16h光照培養(yǎng)，分化緑色愈傷組織。2.9番茄轉(zhuǎn)化繼代每2周繼代一次，棄去愈傷生長(zhǎng)不良者，將苗移入新的培養(yǎng)基中。待小苗長(zhǎng)到2-3cm,再轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上(MS+0.25mg/L IAA+25 u g/ml卡那霉素+200 y g/ml頭孢霉素)，加入200 y g/ml頭孢霉素，在抑制農(nóng)桿菌的同時(shí)促進(jìn)跟的生長(zhǎng)，同時(shí)為了壯苗，抗生素濃度減半。待小苗長(zhǎng)出4-5條根，并有大量側(cè)根生出時(shí)進(jìn)行煉苗，待根系發(fā)達(dá)后移栽到滅菌的土中。待苗長(zhǎng)到四片葉時(shí)，取根和葉片進(jìn)行鑒定。2.10植物基因組DNA提取1.在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I，60°C水浴預(yù)熱。2.分別取番茄新鮮葉片和根尖，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動(dòng)混勻，60°C水浴保溫30-60分鐘(時(shí)間長(zhǎng)，DNA產(chǎn)量高)，不時(shí)搖動(dòng)。3.加入20ml氯仿/戊醇/こ醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘，使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。4.室溫下5000rpm離心5分鐘。5.仔細(xì)移取上清液至另ー 50ml離心管，加入I倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。6.在1.5ml eppendorf中加入Iml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán)，在干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含TE的離心管中，DNA很快溶解于TE。7.如DNA不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60°C水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。8.將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。9.加入 5 U I RNaseAdO U g/u I), 37 °C 10 分鐘，除去 RNA (RNA 對(duì) DNA 的操作、分
析一般無(wú)影響，可省略該步驟)。10.加入1/10體積的3mol/L NaAc及2X體積的冰こ醇混勻，_20°C放置20分鐘左右，DNA形成絮狀沉淀。11.用玻棒撈出DNA沉淀，70%こ醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。12.將 DNA 重溶解于 Iml TE, -20 貯存。13.取2 ill DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳，檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)取15 ill稀釋20倍，測(cè)定0D260/0D280，檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。2.11轉(zhuǎn)干擾基因番茄植株的PCR檢測(cè)取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株新鮮葉片提取的DNA作PCR擴(kuò)增模板。利用下列特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。能擴(kuò)增出特異條帶的植株即初步鑒定為陽(yáng)性植株。檢測(cè)MiMPKl基因RNA干擾片段的特異引物PMF:TGGAGAAGGTGCTTATGGAATG
PMR:CATAATTTCAGGCGCTCGATACPCR反應(yīng)體系:
權(quán)利要求
1.效RNA干擾聯(lián)合Bt基因雙重防治番茄根結(jié)線蟲(chóng)的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以轉(zhuǎn)入有1 嫩干擾載體？046(:1341-16 11011 嫩1的轉(zhuǎn)基因番茄為宿主植物轉(zhuǎn)化外植體， (2)構(gòu)建含有外源基因的表達(dá)載體，所述外源基因指編碼蘇云金芽孢桿菌的Bt-Cry6A晶體蛋白的基因， (3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主植物轉(zhuǎn)化外植體中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述構(gòu)建好的重組表達(dá)載體指PBI121-06。
3.據(jù)權(quán)利要求2任一所述的方法，所述將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主植物轉(zhuǎn)化外植體中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其特征在于采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌EHA105。
4.權(quán)利要求3所述的方法，所述將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主植物轉(zhuǎn)化外植體中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，包括如下步驟: (1)準(zhǔn)備宿主植物轉(zhuǎn)化外植體， (2)制備根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液， (3)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液侵染外植體,然后共培養(yǎng)， (4)對(duì)共培養(yǎng)的外植體進(jìn)行選擇培養(yǎng)以分化愈傷組織， (5)生根培養(yǎng)分化的愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述準(zhǔn)備植物轉(zhuǎn)化外植體包括外植體預(yù)培養(yǎng)，指將取自番茄幼苗的外植體放置在MS+50y g/ylこ酰丁香酮的固體培養(yǎng)基上，光照預(yù)培養(yǎng)2天， 所述共培養(yǎng)指采用MS+100y g/ylこ酰丁香酮固體培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)2天， 所述選擇培養(yǎng)指采用MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧芐青霉素+50 u g/ml卡那霉素+10 u g/ml玉米素，26-280C，光照培養(yǎng)16h， 所述生根培養(yǎng)指長(zhǎng)到2 3厘米的分化良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基MS+0.25mg/LIAA+25 u g/ml卡那霉素+200 u g/ml頭孢霉素上。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述制備根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液指采用1/2濃度的液體MS + 200 V- g/ u I的こ酰丁香酮為懸浮劑懸浮菌體。
全文摘要
本發(fā)明“高效RNA干擾聯(lián)合Bt基因雙重防治番茄根結(jié)線蟲(chóng)的方法”，屬于植物病蟲(chóng)防治領(lǐng)域。以轉(zhuǎn)入有RNA干擾載體pCAGC1341-TGPM01RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄為宿主植物轉(zhuǎn)化外植體，轉(zhuǎn)入表達(dá)Bt-Cry6A晶體蛋白的載體，獲得雙重抗根結(jié)線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因番茄品種。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因的優(yōu)化方法。本發(fā)明合成的基因是對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化的。將優(yōu)化后的編碼Bt-Cry6A晶體蛋白的人工基因以及轉(zhuǎn)有該基因的番茄品種，顯示比轉(zhuǎn)化單一基因的抗線蟲(chóng)效果好。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103088053SQ201210468420
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者陳國(guó)華, 王殿東, 田雪亮, 王運(yùn)生, 茆振川, 楊宇紅, 謝丙炎 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所