番茄SlML1基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種番茄SlMLl基因，還涉及該基因在番茄 株系品質(zhì)、生物脅迫和非生物脅迫抗性以及貨架期中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子。MYB結(jié)構(gòu)域是一個(gè)含 有52個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合域。植物中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子以在其N端含有一段約52個(gè)氨 基酸組成的MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣?。玉米的Clorlessl (Cl)是植物中第一個(gè)被分離鑒定 的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子（Paz-Areset et al·，The re gulatory cl locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators. EMBO J，1987, 6:3553-3558)，隨后， 擬南芥(Romero et al. , More than80R2R3_MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal，1998, 14:273-284)、棉花(Loguerico et al，Differential regulation of si x novel MYB-domain genes defines two distinct expression patterns in allotetra ploid cotton(Gossypium hirsutum L )· Mol Gen Genet，1999, 261:660-671)，蘋果（Takos et al·，Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples. Plant Physiol. 2006,142:1216-1232)等植物中也分離鑒定出功能各異的MYB蛋白。對(duì)MYB類 轉(zhuǎn)錄因子的功能研究結(jié)果表明，MYB蛋白主要作用有：參與植物次級(jí)代謝過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞形 態(tài)，參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答，在植物對(duì)激素反應(yīng)中起作用，調(diào)節(jié)植物的生物 鐘，在細(xì)胞循環(huán)和增殖中起作用等（劉蕾等，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫中的作用及其 分子機(jī)理·遺傳，2008,30:1265-1271)。Vailleau 等（Vailleau F et al.，A R2R3-MYB gene, AtMYB30, acts as a positive regulator of the hypersensitive c ell death program in plants in response to pathogen attack. PNAS，2002,99:10179-10184)發(fā) 現(xiàn)在過量表達(dá)AtMYB30的擬南芥與病原細(xì)菌互作過程中表現(xiàn)出抗病反應(yīng)，而抑制AtMYB30 表達(dá)的擬南芥對(duì)幾種病原細(xì)菌的抗性下降；Van等（Van SC, et al.，Plant immune responses triggered by beneficial microbes[J]. Cur rent Opinion in Plant Biology，2008, 11:443-448)通過基因敲除的方法構(gòu)建MYB72缺陷型擬南芥，對(duì)假單胞菌、 寄生霜霉、鏈格孢菌、灰霉菌的抵抗能力降低，說明擬南芥MYB72在植物抗病方面起作用。 目前，越來越多的研究結(jié)果表明植物中MYB類轉(zhuǎn)錄因子在抗病性方面的功能。
[0003] MIXTA 是一種 MYB 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，Glover BJ 等（Glover BJet al.，Develop ment of several epidermal cell types can be specified by the same MYB-relate d plant transcription factor.Development，1998125:3497 - 3508)發(fā)現(xiàn) MIXTA 能夠控 制金魚草錐形細(xì)胞的形成，還能促進(jìn)金魚草毛狀體的形成，并且GloverBJ等（Glover BJet al., Convergent evolution within the genus Solanum: the spe cialised anther cone develops through alternative pathways. Gene，2004, 331:1_7.)還發(fā)現(xiàn)一個(gè)MIXTA-LIKE 基因能夠誘導(dǎo)歐白英表皮毛分化，同時(shí)Avila J等（Avi la Jet al·，Petunia hybrid genes related to the maize regulatory Clgene and to animal myb proto-oncogenes. Plant J，1993, 3:553-562)同樣找到一個(gè)MIXTA-LIKE基因能夠誘導(dǎo)矮牽?；ū砥っ姆只?。對(duì) MIXTA的研究表明，MIXTA是表皮毛形成所必須的，并且能夠促進(jìn)表皮毛的分化。表皮毛是 抗逆植物分子育種的豐富來源，在防御生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。SlMLl (Solanum lycopersic um MIXTA-Iikel)基因的克隆、轉(zhuǎn)基因材料的品質(zhì)、抗性以及貨架期等方面的 研究，為利用基因工程研究番茄提供了重要的理論和物質(zhì)基礎(chǔ)，在番茄的品質(zhì)改良、分子育 種等方面，具有很好的應(yīng)用前景。在本發(fā)明被公布前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng) 中所提及的番茄中SlMLl基因及其氨基酸序列的功能研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供了一種番茄SlMLl基因，其 序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種番茄SlMLl基因在提高番茄品質(zhì)、生物和非 生物脅迫抗性以及延長(zhǎng)貨架期中的研究應(yīng)用。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0007] 一種番爺SlMLl基因，其篩選過程是
[0008] 提取番爺總RNA,采用mRNA純化試劑盒（QuichprepTM Micro mRNA P urifiCation Kit, Pharmacia 公司）分離 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library Construction Kit (Cat. No. 634903)進(jìn)行建庫，原理為 SMA RT (switch mechanism at5' end of mRNA template)。隨機(jī)挑取5000個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。 根據(jù)膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。選擇條帶單一擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司 進(jìn)行測(cè)序，獲得一種番茄SlMLl基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 2所示。
[0009] -種番茄SlMLl基因在提高番茄品質(zhì)、生物和非生物脅迫抗性以及延長(zhǎng)貨架期中 的研究應(yīng)用：其過程如下：
[0010] 通過番茄野生型株系、轉(zhuǎn)SlMLl基因超表達(dá)株系和轉(zhuǎn)SlMLl基因 RNAi株系同步實(shí) 驗(yàn)，來研究SlMLl基因功能。
[0011] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)品質(zhì)研究：通過對(duì)番茄野生型株系、轉(zhuǎn)SlMLl基因 超表達(dá)株系和轉(zhuǎn)SlMLl基因 RNAi株系果實(shí)中番茄紅素、可溶性糖等的含量變化來進(jìn)行品質(zhì) 研究。
[0012] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)抗性研究：通過對(duì)番茄野生型株系、轉(zhuǎn)SlMLl基因 超表達(dá)株系和轉(zhuǎn)SlMLl基因 RNAi株系進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行番茄SlMLl基因在生物和非生 物脅迫抗性中的研究應(yīng)用：
[0013] (1).抗旱性研究
[0014] (2).抗真菌病害
[0015] (3).抗細(xì)菌性病害
[0016] (4).抗蟲性試驗(yàn)
[0017] (5).抗 TMV 實(shí)驗(yàn)
[0018] 本發(fā)明還對(duì)番茄野生型株系、轉(zhuǎn)SlMLl基因超表達(dá)株系和轉(zhuǎn)SlMLl基因 RN Ai株 系的表皮毛，果實(shí)的顏色、厚度、硬度以及貨架期進(jìn)行了比較研究。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 本發(fā)明首次對(duì)番茄SlMLl基因進(jìn)行了功能研究，并且成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因體系。通 過基因功能研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)SlMLl基因在番茄抗生物和非生物脅迫中起正調(diào)控作用，其過 量表達(dá)能夠提高番茄品質(zhì)和抗性，促進(jìn)表皮毛的形成，增加果實(shí)的厚度和硬度，提高貨架 期，RNAi則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。
【附圖說明】
[0021] 圖1為SlMLl功能域預(yù)測(cè)分析(來源于NCBI數(shù)據(jù)庫)。
[0022] 圖2為一種SlMLl基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0023] 圖3為一種表達(dá)載體PBI121-S1ML1構(gòu)建示意圖。
[0024] 圖4為一種轉(zhuǎn)基因番茄表皮毛結(jié)果示意圖。
[0025] a為葉片表皮毛結(jié)果示意圖，b為莖桿表皮毛結(jié)果示意圖。
[0026] 圖5為一種轉(zhuǎn)基因番爺果實(shí)顏色結(jié)果不意圖。
[0027] 圖6為一種轉(zhuǎn)基因番茄總類胡蘿卜素含量、總可溶物和可滴定酸研究結(jié)果示意 圖。
[0028] a為總類胡蘿卜素含量結(jié)果示意圖，b為總可溶物含量結(jié)果示意圖，c為可滴定酸 含量結(jié)果示意圖。
[0029] 圖7為一種轉(zhuǎn)基因番爺總糖含量研究結(jié)果不意圖。
[0030] 圖8為一種轉(zhuǎn)基因番茄番茄紅素、β -胡蘿卜素、八氫番茄紅素和葉黃素濃度研究 結(jié)果示意圖。
[0031] 圖9為一種轉(zhuǎn)基因番爺抗旱性研究結(jié)果不意圖。
[0032] a為未進(jìn)行旱脅迫處理的對(duì)照組，b為進(jìn)行旱脅迫處理實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果。
[0033] 圖10為一種轉(zhuǎn)基因番茄抗真菌病害結(jié)