利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增擴(kuò)增第九外顯子及內(nèi)含子部分序列(315bp)和第九外顯子反義序列(155bp)，同時(shí)擴(kuò)增sbe2b啟動(dòng)子，將含有正反外顯子及內(nèi)含子的整體DNA片段連同啟動(dòng)子同時(shí)連入pCAMBIA3301載體的多克隆位點(diǎn)中；然后，將ss1啟動(dòng)子片段及ss1基因cDNA片段替換MCS中含sbe2b?RNAi三片段的pCAMBIA3301載體的35S及GUS片段，因此該表達(dá)載體同時(shí)含有sbe2b啟動(dòng)子控制的反義sbe2b?cDNA片段和ss1啟動(dòng)子控制的ss1全長(zhǎng)cDNA片段。本發(fā)明提供的表達(dá)載體中含有的sbe2b?RNAi片段能夠降低SBEIIb酶的活性，使淀粉合成時(shí)分支數(shù)降低，從而提高直鏈淀粉的相對(duì)含量；同時(shí)該載體中含有的ss1基因過(guò)表達(dá)片段能夠提高玉米胚乳SSI酶的活性，從而提高總淀粉含量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]要進(jìn)行目的基因介導(dǎo)的遺傳改良，應(yīng)首先構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。Fromm等(1986)最先開(kāi)展了玉米遺傳轉(zhuǎn)化工作，利用電擊法誘導(dǎo)玉米原生質(zhì)體吸收攜帶npt II (neomycin phosphotransferase II，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)的質(zhì)粒DNA,電擊處理后檢測(cè)到了該基因在玉米細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步將npt II基因轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織。Rhodes等(1988)利用電擊法將npt II酶基因轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體，成功建立玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，首次獲得了玉米轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)基因植株全部不育。1988年，Grimsly等將玉米條紋病毒基因構(gòu)建到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上，利用農(nóng)桿菌侵染玉米植株，導(dǎo)致了系統(tǒng)感染癥狀，首次證明了農(nóng)桿菌可以侵染玉米細(xì)胞。1991年Gould等用根癌農(nóng)桿菌與玉米莖尖共培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因植株。后來(lái)Gordon-Kamm(1990)等利用基因槍介導(dǎo)法分別將bar基因、⑶S基因和LUC基因(luciferase gene，螢光素酶)等轉(zhuǎn)入玉米，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。Lupotto等(2004)對(duì)農(nóng)桿菌侵染后玉米愈傷組織的培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件進(jìn)了研究，并成功獲得轉(zhuǎn)化株。Ishida等(1996年)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系A(chǔ)188未成熟胚，獲得了大量轉(zhuǎn)基因植株，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法高效轉(zhuǎn)化體系，此后這一方法在玉米的遺傳轉(zhuǎn)化中得到了廣泛的應(yīng)用。丁群星(1993)等利用微玻璃針注射授粉后10-20h的玉米子房，將蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)入玉米，獲得可育的轉(zhuǎn)基因植株。周逢勇王國(guó)英等(1998)博士在國(guó)內(nèi)率先建立了玉米的基因槍和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，將Bt殺蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)入玉米，獲得抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米植株。綜上所述，雖然在玉米轉(zhuǎn)化中采用的方法有電擊法、基因槍介導(dǎo)法、超聲波法、微注射法、PEG法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等，但基因槍介導(dǎo)法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法應(yīng)用的最為成功，技術(shù)已相當(dāng)成熟。授粉后18天左右的幼胚是普遍采用的受體材料，再生能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效果好 。對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法而言，適宜轉(zhuǎn)化的玉米基因型還比較有限，適宜的農(nóng)桿菌菌系有C58C1和LBA4404，共培養(yǎng)基中加入適量的乙酰丁香酮(AS)、脯氨酸、谷氨酰胺等物質(zhì)，有利于農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚和提高轉(zhuǎn)化效率。
[0003]基因工程改變淀粉主要集中于淀粉含量及品質(zhì)。在淀粉含量方面主要集中對(duì)ADPGPPase焦磷酸化酶基因的操作上，Stark等人(1992)利用突變的大腸桿菌菌株618來(lái)源的ADPGPPase基因glgC16 (對(duì)變構(gòu)調(diào)節(jié)不敏感)加上不同的啟動(dòng)子，構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到煙草的愈傷組織中，獲得了大量轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織。淀粉含量分析表明，轉(zhuǎn)基因煙草淀粉平均值占干重的10.7 %。有些轉(zhuǎn)基因煙草淀粉干重高達(dá)27%，而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因煙草卻僅含3.4%的淀粉。用上述表達(dá)載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化馬鈴薯，成功地獲得了轉(zhuǎn)化植株，在轉(zhuǎn)化植株中，淀粉含量平均提高了 35%。在減少淀粉含量方面，Muller-Rober等人(1992)利用含有不同啟動(dòng)子和反向連接的ADPGPPase大、小亞基cDNA基因構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化馬鈴薯，在35S加上反向連接的ADPGPPase大亞基cDNA的融合基因轉(zhuǎn)化植株中，葉片的ADPGPPase活性?xún)H為野生型的5% -30%，塊莖中ADPGPPase活性?xún)H為野生型的2%，分析轉(zhuǎn)化植株淀粉含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化植株塊莖淀粉含量?jī)H為野生型的5% -3.5%，伴隨著淀粉含量的下降，轉(zhuǎn)化植株細(xì)胞內(nèi)可溶性糖顯著升高蔗糖和葡萄糖分別占?jí)K莖干重的30%和8%。Wang等(2007)把來(lái)自于大腸桿菌的glgC16基因轉(zhuǎn)化到玉米中，提高了籽粒中ADPGPPase活性，增加了籽粒重量。在改變淀粉含量的研究之中，多數(shù)是針對(duì)ADPGPPase的，反映出ADPGPPase在控制淀粉合成速率方面的重要性，但值得指出的是，并非淀粉合成速率僅受AGPPase控制，在玉米中SSS(Soluble starch synthase,可溶性淀粉合成酶)或SBE的作用也相當(dāng)明顯(Jenner，1993)，對(duì)它們的表達(dá)進(jìn)行研究，對(duì)于提高淀粉含量也具有重要意義。
[0004]目前通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行遺傳改良以提高作物籽粒直鏈淀粉含量的方法主要是利用RNAi技術(shù)抑制淀粉分支酶基因的表達(dá)，以提高作物籽粒中的直鏈淀粉相對(duì)含量。國(guó)際專(zhuān)利W09722703A2報(bào)道了用玉米的sbe2b轉(zhuǎn)化玉米的研究，把sbe2b的cDNA基因或部分片斷正向或反向置于玉米zein蛋白啟動(dòng)子(胚乳特異性啟動(dòng)子)控制下，組成一系列植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)化sbe2b基因3’部分序列反義結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因玉米中內(nèi)源sbe2b基因受到了抑制，轉(zhuǎn)基因玉米淀粉粒中較長(zhǎng)糖鏈增加了近2倍。在5’部分序列反義結(jié)構(gòu)表達(dá)載體以及sbe2b基因全長(zhǎng)cDNA反義結(jié)構(gòu)表達(dá)載體中也獲得了類(lèi)似的結(jié)果。近年來(lái)研究表明=RNAi技術(shù)是更有效地抑制基因表達(dá)的方法之一，抑制效率和抑制效果均高于反義 RNA 技術(shù)(Smith et al, 2001 ；ffesley et al.2001 ；Stout jesdi jket.al，2002)。柴曉杰等(2005)克隆玉米淀粉分支酶基因，并構(gòu)建高效的RNAi表達(dá)體系，通過(guò)花粉管通道法將其導(dǎo)入玉米自交系，抑制淀粉分支酶基因的表達(dá)，提高玉米直鏈淀粉的含量。Li JH等(2007)對(duì)玉米淀 粉分支酶突變體研究中發(fā)現(xiàn)淀粉分支酶的失活可以顯著增加直鏈淀粉含量。
[0005]玉米籽粒淀粉合成相關(guān)酶類(lèi)往往形成特定的功能復(fù)合體，以一個(gè)整體結(jié)構(gòu)參與淀粉合成。利用RNA干涉或反義RNA技術(shù)降低了淀粉分支酶基因的表達(dá)，導(dǎo)致籽粒中直鏈淀粉的相對(duì)含量(直支比)升高，但由于功能復(fù)合體構(gòu)象發(fā)生了改變，導(dǎo)致其它相關(guān)蛋白的活性下降，導(dǎo)致總淀粉含量降低；同時(shí)由于RNAi技術(shù)使sbe2b基因不能正常表達(dá)，減少了淀粉合成過(guò)程中葡聚糖非還原末端，也引起SSI等關(guān)鍵酶活性的下降，造成糖鏈延長(zhǎng)末端不足，引起整個(gè)淀粉合成速度的降低，減少了總淀粉含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)由于RNAi技術(shù)使sbe2b基因不能正常表達(dá)，同時(shí)也引起SSI等關(guān)鍵酶活性的下降，本發(fā)明旨在通過(guò)構(gòu)建含有sbe2b啟動(dòng)子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動(dòng)子控制的ssl全長(zhǎng)cDNA片段的植物表達(dá)載體，在提高直鏈淀粉含量的同時(shí)使總淀粉含量得到一定的提聞。
[0007]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法包括:
[0008]sbe2b RNAi載體的構(gòu)建:玉米sbe2b基因在胚乳中特異表達(dá)，因此我們選用sbe2b啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)干涉片段的表達(dá)。通過(guò)對(duì)sbe2b基因進(jìn)行在線(xiàn)同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其第九外顯子特異性較高，因此我們?cè)O(shè)計(jì)引物擴(kuò)增第九外顯子及內(nèi)含子部分序列(315bp)和第九外顯子反義序列(155bp)，同時(shí)擴(kuò)增sbe2b啟動(dòng)子，將上述三片段同時(shí)連入pCAMBIA3301載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)中。
[0009]ssl過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建:利用ssl基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)玉米ssl基因的表達(dá)，將ssl啟動(dòng)子片段及ssl基因cDNA片段替換MCS中含sbe2b RNAi三片段的pCAMBIA3301載體的35S及⑶S片段，因此該表達(dá)載體同時(shí)含有sbe2b啟動(dòng)子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動(dòng)子控制的ssl全長(zhǎng)cDNA片段。
[0010]sbe2b RNAi載體的構(gòu)建方法包括:
[0011]①sbe2b啟動(dòng)子擴(kuò)增；
[0012]②sbe2b第九外顯子正反片段及內(nèi)含子擴(kuò)增；
[0013]③質(zhì)粒提取及酶切；
[0014]進(jìn)一步，sbe2b啟動(dòng)子擴(kuò)增，引物自行設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)為:
[0015]Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG
[0016]Psbe2b-R: gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
[0017]PCR反應(yīng)體系及程序如下:
[0018]將擴(kuò)增片段經(jīng)過(guò)電泳膠回收后連接入pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。
[0019]進(jìn)一步，sbe2b第九外顯子正反片段及內(nèi)含子擴(kuò)增，引物自行設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)為:
[0020]正義第九外顯子及內(nèi)含子部分序列315bp:
[0021]2b315-F: gaattcTTCATGACATCTGATCACCAG
[0022]2b315-R: ggatccGAATTGCTGACACCAACAGCT
[0023]第九外顯子反義序列155bp:
[0024]2bl55-F:ggatccTTATACACCCCAGGCTTTCGAC
[0025]2bl55-R:cccgggTTCATGACATCTGATCACCAG
[0026]PCR及后續(xù)T載體克隆實(shí)驗(yàn)見(jiàn)①sbe2b啟動(dòng)子擴(kuò)增。
[0027]進(jìn)一步，質(zhì)粒提取及酶切，sbe2b啟動(dòng)子用HindIII及EcoRI雙酶切；正義第九外顯子及內(nèi)含子部分序列315bp,用EcoRI及BamHI雙酶切；反義序列用BamHI及SmaI雙酶切；經(jīng)改造MCS中含NOS終止子的pCAMBIA3301載體用HindIII及SmaI雙酶切。
[0028]進(jìn)一步，ssl過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建方法為:
[0029]①ssl基因及啟動(dòng)子克隆；
[0030]②質(zhì)粒提取及酶切。
[0031]進(jìn)一步，ssl基因及啟動(dòng)子克隆，ssl啟動(dòng)子引物，:根據(jù)課題組首次克引物為:
[0032]Pssl-F:aagcttACGCTGCAGCGAGAGGCGGGATC
[0033]Pssl-R:ggatccTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG
[0034]ssl基因編碼區(qū)引物:
[0035]ssl-F:ggatccATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG
[0036]ssl-R:cacgtgTTACATGACATAGGGTCGATC。
[0037]進(jìn)一步，質(zhì)粒提取及酶切，ssl啟動(dòng)子用HindIII及BamHI雙酶切，ssl基因用BamHI及PmaCI雙酶切。
[0038]本發(fā)明提供的表達(dá)載體中含有的sbe2b RNAi片段能夠降低SBEIIb酶的活性，使淀粉合成時(shí)分支數(shù)降低，從而提高直鏈淀粉的相對(duì)含量；同時(shí)該載體中含有的ssl基因過(guò)表達(dá)片段能夠提高玉米胚乳SSI酶的活性，從而提高總淀粉含量。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的RNAi載體構(gòu)建相關(guān)片段的酶切電泳圖；
[0040]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的ssl過(guò)表達(dá)載體相關(guān)片段的酶切電泳圖；
[0041]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的同時(shí)含有sbe2b啟動(dòng)子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動(dòng)子控制的ssl全長(zhǎng)cDNA片段的完整載體圖(pSSIRNAi)。
【具體實(shí)施方式】
[0042]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0043]本發(fā)明實(shí)施例選用植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行目的載體的構(gòu)建。具體敘述如下:
[0044](I) sbe2b RNAi 載體的構(gòu)建。
[0045]①sbe2b啟動(dòng)子擴(kuò)增
[0046]引物自行設(shè)計(jì)，由上海英駿公司合成:
[0047]Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG`[0048]Psbe2b-R: gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
[0049]PCR反應(yīng)體系及程序見(jiàn)下:
[0050]表1PCR 反應(yīng)體系(20 μ L)
體系成分體積[_]KOD DNA 襲各每0.4 ML
K0D 而。3 μ?
2 X KOD buffer10 μ L
Psbe2b-F Primer0.6 μ L
[0052]
Psbe2b-R Primer0.6 μ L
基因組DNA模板I μ L
CidH2O4.4 μ L
[0053]表2PCR反應(yīng)程序
【權(quán)利要求】
1.一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法包括: sbe2b RNAi載體的構(gòu)建:玉米sbe2b基因在胚乳中特異表達(dá)，選用sbe2b啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)干涉片段的表達(dá)，通過(guò)對(duì)sbe2b基因進(jìn)行在線(xiàn)同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其第九外顯子特異性較高，因此我們?cè)O(shè)計(jì)引物擴(kuò)增第九外顯子及內(nèi)含子部分序列315bp和第九外顯子反義序列155bp，同時(shí)擴(kuò)增sbe2b啟動(dòng)子，將上述三片段同時(shí)連入pCAMBIA3301載體的多克隆位點(diǎn)MCS中；ssl過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建:利用ssl基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)玉米ssl基因的表達(dá)，將ssl啟動(dòng)子片段及ssl基因cDNA片段替換MCS中含sbe2b RNAi三片段的pCAMBIA3301載體的35S及⑶S片段，因此該表達(dá)載體同時(shí)含有sbe2b啟動(dòng)子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動(dòng)子控制的ssl全長(zhǎng)cDNA片段。
2.如權(quán)利要求1所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，sbe2b RNAi載體的構(gòu)建方法包括: ①sbe2b啟動(dòng)子擴(kuò)增； ②sbe2b第九外顯子正反片段及內(nèi)含子擴(kuò)增； ③質(zhì)粒提取及酶切。
3.如權(quán)利要求2所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，sbe2b啟動(dòng)子擴(kuò)增，引物自行設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)為:
Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG
Psbe2b-R:gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
PCR反應(yīng)體系及程序如下:` 將擴(kuò)增片段經(jīng)過(guò)電泳膠回收后連接入PMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。
4.如權(quán)利要求2所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，sbe2b第九外顯子正反片段及內(nèi)含子擴(kuò)增，引物自行設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)為: 正義第九外顯子及內(nèi)含子部分序列315bp:
2b315-F:gaattcTTCATGACATCTGATCACCAG
2b315-R:ggatccGAATTGCTGACACCAACAGCT
第九外顯子反義序列155bp:
2bl55-F:ggatccTTATACACCCCAGGCTTTCGAC
2bl55-R:cccgggTTCATGACATCTGATCACCAG PCR及后續(xù)T載體克隆實(shí)驗(yàn)見(jiàn)①sbe2b啟動(dòng)子擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求2所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，質(zhì)粒提取及酶切，sbe2b啟動(dòng)子用HindIII及EcoRI雙酶切；正義第九外顯子及內(nèi)含子部分序列315bp,用EcoRI及BamHI雙酶切；反義序列用BamHI及SmaI雙酶切；經(jīng)改造MCS中含NOS終止子的pCAMBIA3301載體用HindIII及SmaI雙酶切。
6.如權(quán)利要求1所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，ssl過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建方法為: ①ssl基因及啟動(dòng)子克?。? ②質(zhì)粒提取及酶切。
7.如權(quán)利要求6所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，ssl基因及啟動(dòng)子克隆，ssl啟動(dòng)子引物，:根據(jù)課題組首次克引物為:
Pssl-F:aagcttACGCTGCAGCGAGAGGCGGGATC
Pssl-R:ggatccTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG
ssl基因編碼區(qū)引物:
ssl-F:ggatccATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG
ssl-R:cacgtgTTACATGACATAGGGTCGATC。
8.如權(quán)利要求6所述的利用基因 工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構(gòu)建方法，其特征在于，質(zhì)粒提取及酶切，ssl啟動(dòng)子用HindIII及BamHI雙酶切，ssl基因用BamHI及PmaCI雙酶切。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103484494SQ201210334553
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】黃玉碧, 李煬平, 張軍杰, 劉漢梅, 胡育峰, 顧勇, 劉應(yīng)紅 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)