專利名稱：基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地講是一種基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，近年來興起的基因工程方法可以生產(chǎn)天然方法難以大量制備的目的蛋白質(zhì)，廣泛地用于人類醫(yī)療等方面，由于質(zhì)粒載體對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)時(shí)受多種因素影響而呈現(xiàn)表達(dá)效率高低不一，下游純化難易程度不一樣，因而國內(nèi)外學(xué)者紛紛通過強(qiáng)啟動(dòng)子、強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子、強(qiáng)翻譯終止密碼、合理的SD區(qū)及引導(dǎo)序列等元件改進(jìn)來提高表達(dá)目的蛋白效率，或者使用原核生物細(xì)胞偏好密碼子重新改造目的基因，或改造終止密碼下游序列，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性來提高目的蛋白表達(dá)效率，上述工作雖都取得一定效果，但仍不盡如人意。同時(shí)，現(xiàn)有的目的蛋白純化、收集程序繁鎖復(fù)雜，得率較低，運(yùn)行成本偏高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，通過在原有基因工程生產(chǎn)用原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的起始密碼下游選擇性嵌入3個(gè)接頭，改變其結(jié)構(gòu)，而提供一新的高效原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5，該質(zhì)粒載體能大大提高目的基因的表達(dá)效率，從而提高目的蛋白的產(chǎn)量，同時(shí)本發(fā)明還能簡化重組蛋白的純化程序，降低生產(chǎn)成本，且重組蛋白很容易還原成天然蛋白。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)在含有雙啟動(dòng)子、雙SD區(qū)、rrnb轉(zhuǎn)錄終止子的pKpL4原核質(zhì)粒載體的起始碼下游嵌入人工合成的六聚組氨酸編碼區(qū)、16s rRNA 3’端互補(bǔ)區(qū)、凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭，三個(gè)接頭的5’端分別含限制性核酸內(nèi)切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存堿基。
所說的六組氨酸編碼區(qū)接頭接正鏈序列為CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，負(fù)鏈為CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六組氨酸接頭N端和C端分別含有甘氨酸，六組氨酸編碼區(qū)下游含Bam HI識(shí)別位點(diǎn)。
16s rRNA3’端匹配序列接頭正鏈序列為GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，負(fù)鏈序列為CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG為16s rRNA3’端互補(bǔ)區(qū)，3’端含有Bam HI和Xba I識(shí)別位點(diǎn)。
所說的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)序列接頭正鏈序列為CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，負(fù)鏈序列為CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA編碼的Val-Pro-Arg-Gly為凝血酶識(shí)別位點(diǎn)，序列的3’端含有Bam HI識(shí)別點(diǎn)。
原核表達(dá)質(zhì)粒載體pKpL5的構(gòu)建方法如下(1)分別將六組氨酸接頭的正、負(fù)鏈，16s rRNA3’端匹配接頭正、負(fù)鏈和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)序列接頭正負(fù)鏈各自混合后在100℃變性與復(fù)性后，組裝成構(gòu)成三個(gè)接頭，3個(gè)接頭的5’端分別含Nco I、BamHI、Bam HI殘存堿基備用；(2)制備pKpL4.1取pKpL4質(zhì)粒DNA，經(jīng)Bam HI消化后，以Klenow酶和dNTP修飾成平端，再以Nco I消化，1.0％瓊脂糖凝膠電泳后回收載體臂DNA，再用CIP脫磷酸化后，加入的六聚組氨酸接頭，用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCL2法制備的感受態(tài)大腸桿菌pop2136細(xì)胞，以六聚組氨酸接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選重組陽性克隆，陽性重組子即為pKpL4.1，以限制性核酸內(nèi)切酶消化驗(yàn)證插入序列的正確性。(3)制備pKpL-4.2質(zhì)粒DNA取pKpL4.1質(zhì)粒DNA用Xba I消化后，以klenow和dNTP修飾成平端，再以Bam HI消化制成載體臂，用T4 DNA連接酶與16s rRNA3’端匹配序列接頭，以16s rRNA3’端匹配序列接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選陽性重組克隆，陽性重組子即為pKpL4.2，并以相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶法驗(yàn)證插入序列的正確性。(4)制備pKpL5質(zhì)粒DNA以構(gòu)建pKpL4.2相同的方法制備pKpL4.2質(zhì)粒載體臂，與凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭連接，并以凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選陽性重組子，陽性重組子即為pKpL5，并以相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶法驗(yàn)證插入序列的正確性。
pKpL5構(gòu)建過程中，在起始密碼下游嵌入六聚組氨酸接頭，使目的蛋白與金屬鋰鹽能特異結(jié)合，僅通過含金屬鋰鹽的凝膠或其它基質(zhì)一步法進(jìn)行親和純化，不僅減少純化步驟，而且能顯著提高目的蛋白的純度，并且在六聚組氨酸上游引入兩個(gè)甘氨酸，保護(hù)六聚組氨酸的完整性，在六聚組氨酸下游亦嵌入大量甘氨酸，這不僅能使六聚組氨酸基因更好地形成獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，而且能暴露于目的蛋白分子的表面，增強(qiáng)基團(tuán)的電荷和消除空間阻礙，有利于目的蛋白與金屬鋰鹽層析柱間緊密結(jié)合。在六聚組氨酸接頭下游，嵌入16s rRNA3’端匹配序列接頭，該接頭能顯著提高mRNA與核糖體間的結(jié)合力，從而顯著增強(qiáng)目的基因的翻譯。在16s rRNA3’端匹配序列接頭下游嵌入了凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭，并在下游嵌入了Bam HI識(shí)別位點(diǎn)用于目的基因克隆，目的蛋白純化后，使用凝血酶進(jìn)行消化，使目的蛋白氨基酸序列還原，與天然蛋白比較，N端僅增添了Gly-Ser，這兩個(gè)氨基酸不含側(cè)鏈，難與下游氨基酸間形成氫鍵，對(duì)目的蛋白的生物活性影響較小。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)增強(qiáng)了目的基因的表達(dá)，提高目的蛋白產(chǎn)量，性能穩(wěn)定可靠，為生物工程下游產(chǎn)品的純化提取提供了簡捷措施。基因表達(dá)試驗(yàn)取得令人滿意的效果，具體試驗(yàn)結(jié)果如下(1)篩選重組陽性克隆試驗(yàn)本發(fā)明pKpL4載體臂與六聚組合氨酸接頭連接產(chǎn)物、pKpL4.1載體臂與16s rRNA3’端匹配序列接頭連接物及pKpL4.2載體臂與凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌pop2136細(xì)胞后，在含氨芐青霉素LB平板上生長的細(xì)菌克隆進(jìn)行小量擴(kuò)增培養(yǎng)，飽和酚、氯仿一步法制備DNA模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增篩選，并且以限制性核酸內(nèi)切酶鑒定相應(yīng)接頭的重組方向，pKpK4.1以限制性內(nèi)切酶Bam HI、KpnI進(jìn)行消化，具有Bam HI而不含KpnI識(shí)別位點(diǎn)者正確。pKpL4.2以限制性內(nèi)切酶Bam HI、XbaI消化，同時(shí)具備Bam HI與XbaI識(shí)別位點(diǎn)者為正確。pKpL5以限制性內(nèi)切酶Bam HI、XbaI消化，僅具備Bam HI識(shí)別位者為正確。結(jié)果在每次重組后均可篩選到重組陽性克隆。
(2)目的基因的表達(dá)試驗(yàn)參考本研究所保存的pT survivin、pT-surviving double、pT-LACK質(zhì)粒內(nèi)人生存素單體、雙體和利什曼原蟲LACK抗原基因編碼區(qū)序列(生存素單體基因編碼區(qū)長429nt，編碼142個(gè)氨基酸；人生存素雙體編碼區(qū)長為900nt，編碼299個(gè)氨基酸；利什曼原蟲LACK抗原基因編碼區(qū)長為948nt，編碼315個(gè)氨基酸)，分別設(shè)計(jì)目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在目的基因上游引物中嵌入Bam HI位點(diǎn)，在下游引物中嵌入Hind III位點(diǎn)，將這3個(gè)目的基因編碼區(qū)分別克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pQE32、pKpL4和pKpL5內(nèi)Bam HI和Hind III位點(diǎn)間，pQE32-survivin、pQE32-surviving double、pQE32-LACK分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌M15，分別挑取單個(gè)菌落，以含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液于37℃培養(yǎng)致對(duì)數(shù)生長中期，加入IPTG至終濃度1mM，高速振蕩培養(yǎng)4小時(shí)(300轉(zhuǎn)/分)，離心收集細(xì)菌，裂解后以SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達(dá)量。pKpL4-survivin、pKpL4-surviving double、pKpL4-LACK、pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double及pKpL5-LACK分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌pop2136，于32℃擴(kuò)增培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期，于42℃高速震蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)4小時(shí)后，離心收集細(xì)菌，分析相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)量。并超聲粉碎細(xì)菌，制備包涵體，進(jìn)一步確認(rèn)目的蛋白表達(dá)。
結(jié)果含pQE32、pQE32-survivin、pQE32-surviving double、pQE32-LACK的大腸桿菌M15進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)未見明顯的目的蛋白條帶，再將含pKpL4-survivin、pKpL4-surviving double、pKpL4-LACK的大腸桿菌pop2136進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，與含pKpL4的大腸桿菌pop2136相比較，亦未見明顯的目的蛋白表達(dá)條帶，而pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double、pKpL5-LACK的大腸桿菌pop2136經(jīng)熱誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后，均可見明顯的目的蛋白表達(dá)條帶，經(jīng)Quantity ONE(Bio-Rab公司)軟件分析，目的蛋白的表達(dá)量分別占全菌總蛋白量的5.1％，19％和35％。將pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double、pKpL5-LACK進(jìn)行大量表達(dá)后，超聲粉碎細(xì)菌制備包涵體，將包涵體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，可見相應(yīng)目的蛋白條帶進(jìn)一步增強(qiáng)，一方面說明目的蛋白表達(dá)的真實(shí)性，另一方面證明了相應(yīng)目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，詳見圖2。如圖2所示，通過SDS-PAGE電泳蛋白質(zhì)檢測(cè)，本發(fā)明的原核載體pKpL5對(duì)目的基因的表達(dá)真實(shí)可靠，可大大提高目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，圖2中MS豎向?yàn)榉肿恿浚瑱M向數(shù)字說明如下1、蛋白質(zhì)分子量；2、pQE32對(duì)照；3、pQE32-Survivin；4、pQE32-Survivin double；5、pQE32-LACK；6、pKpL4對(duì)照；7、pKpL4-Survivin；8、pKpL4-Survivin double；9、pKpL4-LACK；10、pKpL5-Survivin；11、pKpL5-Survivin包涵體；12、pKpL5-Survivin double；13、pKpL5-Survivindouble包涵體；14、pKpL5-LACK；15、pKpL5-LACK包涵體。
原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5可用作通用原核高效表達(dá)質(zhì)粒載體表達(dá)各種目的的基因。


圖1為本發(fā)明原核表達(dá)載體pKpL5構(gòu)建流程圖圖2為本發(fā)明目的基因表達(dá)效果圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1如圖1所示，按下列步驟進(jìn)行原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5構(gòu)建，(1)首先根據(jù)發(fā)明目的設(shè)計(jì)并人工合成出六聚組氨酸編碼區(qū)、16s rRNA3’端互補(bǔ)區(qū)、凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭，三個(gè)接頭的5’端分別含限制性核酸內(nèi)切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存堿基，上述三個(gè)接頭可以自行合成，也可委托相關(guān)生物工程公司合成，本實(shí)施例三個(gè)接頭均系委托上海生工公司人工合成。
所說的六組氨酸編碼區(qū)接頭接正鏈序列為CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，負(fù)鏈為CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六組氨酸接頭N端和C端分別含有甘氨酸，六組氨酸編碼區(qū)下游含Bam HI識(shí)別位點(diǎn)。
16s rRNA3’端匹配序列接頭正鏈序列為GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，負(fù)鏈序列為CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG為16s rRNA3’端互補(bǔ)區(qū)，3’端含有Bam HI和Xba I識(shí)別位點(diǎn)。
所說的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)序列接頭正鏈序列為CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，負(fù)鏈序列為CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA編碼的Val-Pro-Arg-Gly為凝血酶識(shí)別位點(diǎn)，序列的3’端含有Bam HI識(shí)別點(diǎn)；(2)分別將六組氨酸接頭的正、負(fù)鏈，16s rRNA3’端匹配接頭正、負(fù)鏈和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)序列接頭正負(fù)鏈各自混合后在100℃變性與復(fù)性后，組裝構(gòu)成三個(gè)接頭，3個(gè)接頭的5’端分別含NcoI、Bam HI、Bam HI殘存堿基備用；(3)制備pKpL4.1取pKpL4質(zhì)粒DNA(含雙啟動(dòng)子、雙SD區(qū)、rrnb轉(zhuǎn)錄終止子，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子免疫室提供，中華基因網(wǎng)2004.06.12曾予報(bào)道)，經(jīng)Bam HI消化后，以Klenow酶和dNTP修飾成平端，再以Nco I消化，1.0％瓊脂糖凝膠電泳后，以美國生命技術(shù)公司產(chǎn)DNA凝膠回收試劑盒，按操作說明回收載體臂DNA，再用小牛腸磷酸脂酶(CIP)脫磷酸化后，加入的六聚組氨酸接頭，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCL2法制備的感受態(tài)大腸桿菌pop2136細(xì)胞，以六聚組氨酸接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選重組陽性克隆，陽性重組子即為pKpL4.1，以限制性核酸內(nèi)切酶消化試驗(yàn)驗(yàn)證插入序列的正確性；(4)制備pKpL-4.2質(zhì)粒DNA取pKpL4.1質(zhì)粒DNA用Xba I消化后，以大腸桿菌大片段聚合酶(klenow)和dNTP修飾成平端，再以Bam HI消化制成載體臂，用T4DNA連接酶與16s rRNA3’端匹配序列接頭，以16srRNA3’端匹配序列接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選陽性重組克隆，陽性重組子即為pKpL4.2，并以相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證插入序列的正確性；(5)制備pKpL5質(zhì)粒DNA以構(gòu)建pKpL4.2相同的方法制備pKpL4.2質(zhì)粒載體臂，與凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭連接，并以凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選陽性重組子，陽性重組子即為pKpL5，并以相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶法驗(yàn)證插入序列的正確性。本發(fā)明中插入的3個(gè)接頭拼接后的核酸序列及編碼蛋白質(zhì)序列為ATG GGC CAT CAT CAT CAC CAT CAC AGC AGCGGA TCC CAT GCC TTA CAA AGC GGA TCC AGC GGA CTG GTTCCG CGTGGA TCCGBamH IMet Gly His His His His His His Ser Ser Gly Ser HisPro Leu Glu Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser本發(fā)明所用酶如內(nèi)切酶、Taq酶和連接酶等，購自美國基因公司和美國Invitrogen公司，大腸桿菌pop2136(含C1857溫度敏感阻遏子)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子免疫室提供。
核苷酸氨基酸序列表<110>川北醫(yī)學(xué)院<120>基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體pKpL及其構(gòu)建方法<160>4<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>1catgggccat catcatcacc atcacagcag cggatccg38<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>RBS<400>2gatcgcatgc cttacaaagc ggatcctcta gag 33<210>3<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>3catcgagcgg actggttccg cgtggatccg30<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(37...57)<400>4atg ggc cat cat cat cac cat cac agc agc ggatcc cat gcc tta caa agc gga tcc agc gga ctggtt ccg cgtgga tccgBamH IMet Gly His His His His His His Ser Ser Gly Ser His1 5 10Pro Leu Glu Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser15 20 2權(quán)利要求
1.一種基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5，其特征在于在含有雙啟動(dòng)子、雙SD區(qū)、rrnb轉(zhuǎn)錄終止子的pKpL4原核質(zhì)粒載體的起始碼下游嵌入人工合成的六聚組氨酸編碼區(qū)、16s rRNA3’端互補(bǔ)區(qū)、凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭，三個(gè)接頭的5’端分別含限制性核酸內(nèi)切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5，其特征在于所說的六組氨酸編碼區(qū)接頭接正鏈序列為CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，負(fù)鏈為CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六組氨酸接頭N端和C端分別含有甘氨酸，六組氨酸編碼區(qū)，其下游含Bam HI識(shí)別位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5，其特征在于16s rRNA3’端匹配序列接頭正鏈序列為GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，負(fù)鏈序列為CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG為16srRNA3’端互補(bǔ)區(qū)，3’端含有Bam HI和Xba I識(shí)別位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5，其特征在于所說的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)序列接頭正鏈序列為CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，負(fù)鏈序列為CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA編碼的Val-Pro-Arg-Gly為凝血酶識(shí)別位點(diǎn)，序列的3’端含有Bam HI識(shí)別點(diǎn)。
5.權(quán)利1所述的一種基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體—pKpL5構(gòu)建方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行；(1)分別將六組氨酸接頭的正、負(fù)鏈，16s rRNA3’端匹配接頭正、負(fù)鏈和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)序列接頭正負(fù)鏈各自混合后在100℃變性與復(fù)性后，組裝成構(gòu)成三個(gè)接頭，3個(gè)接頭的5’端分別含Nco I、Bam HI、Bam HI殘存堿基備用；(2)制備pKpL4.1取pKpL4質(zhì)粒DNA，經(jīng)Bam HI消化后，以Klenow酶和dNTP修飾成平端，再以Nco I消化，1.0％瓊脂糖凝膠電泳后回收載體臂DNA，再用CIP脫磷酸化后，加入的六聚組氨酸接頭，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCL2法制備的感受態(tài)大腸桿菌pop2136細(xì)胞，以六聚組氨酸接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選重組陽性克隆，陽性重組子即為pKpL4.1，以限制性核酸內(nèi)切酶消化驗(yàn)證插入序列的正確性；(3)制備pKpL-4.2質(zhì)粒DNA取pKpL4.1質(zhì)粒DNA用Xba I消化后，以klenow和dNTP修飾成平端，再以Bam HI消化制成載體臂，用T4DNA連接酶與16s rRNA3’端匹配序列接頭，以16srRNA3’端匹配序列接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選陽性重組克隆，陽性重組子即為pKpL4.2，并以相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶法驗(yàn)證插入序列的正確性；(4)制備pKpL5質(zhì)粒DNA以構(gòu)建pKpL4.2相同的方法制備pKpL4.2質(zhì)粒載體臂，與凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭連接，并以凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭正鏈和rrnb轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)鏈為引物，PCR法篩選陽性重組子，陽性重組子即為pKpL5，并以相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶法驗(yàn)證插入序列的正確性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程生產(chǎn)用原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5及其構(gòu)建方法，其特征在于在含有雙啟動(dòng)子、雙SD區(qū)、rrnb轉(zhuǎn)錄終止子的pKpL4原核質(zhì)粒載體的起始碼下游嵌入人工合成的六聚組氨酸編碼區(qū)、16s rRNA3’端互補(bǔ)區(qū)、凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)接頭，三個(gè)接頭的5’端分別含限制性核酸內(nèi)切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存堿基。該質(zhì)粒載體能大大提高目的基因的表達(dá)效率，從而提高目的蛋白的產(chǎn)量，我們使用該質(zhì)粒載體表達(dá)人生存素單體、雙體和利什曼原蟲LACK抗原，經(jīng)SDS－PAGE電泳后用Quantity ONE(Bio－Rad公司)軟件分析，目的蛋白的表達(dá)量分別占全菌總蛋白量的5.1％，19％和35％。同時(shí)本發(fā)明還能簡化目的蛋白的純化程序，降低目的蛋白的生產(chǎn)成本。原核表達(dá)質(zhì)粒載體——pKpL5可用作原核高效表達(dá)通用質(zhì)粒載體表達(dá)各種目的的基因。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1966690SQ20061002154
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月5日
發(fā)明者敬保遷, 馬大龍, 張潔 申請(qǐng)人:川北醫(yī)學(xué)院