專利名稱：表達(dá)綠色熒光蛋白的乳酸桿菌基因工程體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的乳酸桿菌基因工程體，為構(gòu)建用于研究乳酸桿菌和動物機(jī)體間互作的乳酸桿菌基因工程體，屬基礎(chǔ)生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿科學(xué)。
背景技術(shù)：
幾個世紀(jì)以來，乳酸桿菌作為重要的益生菌已廣泛地應(yīng)用于食品及飲料加工業(yè)，以乳酸桿菌作為發(fā)酵菌的食品工業(yè)所創(chuàng)造出的經(jīng)濟(jì)價值占全球總的發(fā)酵類食品的20％。數(shù)千年，乳酸桿菌被人類大量食用，沒有引起任何已知的健康問題，但是其對機(jī)體的免疫機(jī)理及與動物腸道是如何相互作用等一系列問題尚不清楚，同時乳酸桿菌可以作為抗原遞送載體誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答和全身免疫應(yīng)答，這引起了研究者們很大的興趣。為了觀測到機(jī)體內(nèi)乳酸桿菌的運(yùn)動情況及免疫機(jī)理，首先需要對其進(jìn)行標(biāo)記。
1乳酸桿菌對黏膜免疫的影響乳酸桿菌是人體和動物腸道中一種正常的益生菌，具有多種生理功能，如控制腸道感染、增加某些食物的營養(yǎng)價值、控制血清膽固醇水平、改善乳糖代謝、誘導(dǎo)體內(nèi)特異性及非特異性免疫應(yīng)答以及抗腫瘤活性等功能，在科學(xué)界越來越顯示出強(qiáng)大的生命力。作為一種重要的益生菌，多年來乳酸桿菌被大量用于食品的制造中，如干酪、酸乳酪和干臘腸。數(shù)千年來人們大量的消費這些食品，從未引起任何的健康問題。作為口服疫苗，乳酸桿菌還具有很好的安全性。因此，乳酸桿菌非常適宜作為安全的口服疫苗和其他病原體的抗原載體。
進(jìn)入胃腸道中的乳酸桿菌具備抗膽汁酸和在胃腸道中持續(xù)存在的能力。與一般微生物抗原一樣，乳酸桿菌在誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答時或是經(jīng)過小腸上皮之間的微皺褶細(xì)胞(microfold cell，M細(xì)胞)，或者通過上皮下的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)進(jìn)入固有層，激活Th2淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生大量的白介素(IL)-5，后者是有效的IgA刺激因子，可激活B細(xì)胞，分泌IgA，IgA與腸黏膜上皮產(chǎn)生的分泌片段結(jié)合，形成黏膜表面抗體sIgA(分泌型IgA)，阻止致病菌的吸附和入侵。許多乳酸桿菌由于抗酸、抗膽汁鹽，能夠順利通過胃和回腸，大量存在于小腸和大腸的上游處。乳酸桿菌進(jìn)入胃腸道后可持續(xù)誘導(dǎo)局部細(xì)胞免疫和體液免疫，并具有減少變態(tài)反應(yīng)、增強(qiáng)腸道屏障功能和治療自身免疫病等功能。
乳酸桿菌能顯著增加腸道中非特異性和特異性抗體水平。對0-6個月健康新生兒的研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)的乳酸桿菌和雙歧桿菌定植的時間越早，外周血中IgA定向細(xì)胞出現(xiàn)得就越早；隨著腸內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)目的增加，外周血中的IgA定向細(xì)胞的數(shù)量也增加；在輪狀病毒導(dǎo)致的腹瀉嬰兒中，喂食乳酸桿菌株后可使病程減短，病情減輕；減毒的Salmonella typhi感染小鼠后，如果口服含有L.acidophilus Lal發(fā)酵乳，小鼠體內(nèi)針對S.typhi的血清總IgA水平均升高。乳酸桿菌還可明顯促進(jìn)小腸中細(xì)胞免疫反應(yīng)，如乳酸桿菌能增強(qiáng)腸上皮淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒活性，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種淋巴因子；激發(fā)固有層CD4+細(xì)胞產(chǎn)生干擾素；增強(qiáng)單核—吞噬細(xì)胞的吞噬作用，從而殺滅腸道病毒和腸道內(nèi)的其他細(xì)菌，小鼠口服含有大量乳酸桿菌的Kefir奶可以協(xié)助特異性抗原提高小腸特異性黏膜免疫反應(yīng)。乳酸桿菌中含有大量未甲基化的CpG DNA，脂磷壁酸(lipoteichoic acids，LTA)和肽聚糖，通常這些物質(zhì)可與Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)結(jié)合，刺激先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。所以口服乳酸桿菌對增強(qiáng)小腸特異和非特異性免疫應(yīng)答均具有重要作用。
2口服黏膜免疫研究進(jìn)展口服黏膜免疫方法簡便、安全，不僅在黏膜局部和其他黏膜組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可引起全身性體液免疫應(yīng)答，多年來受到國內(nèi)外免疫學(xué)家的密切關(guān)注。目前兒童廣泛口服的脊髓灰質(zhì)炎糖丸就是一個消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰質(zhì)炎口服疫苗的應(yīng)用，使全球小兒麻痹發(fā)病得到有效控制，為口服疫苗的研制與應(yīng)用起到了指導(dǎo)作用。但是在實踐中，口服疫苗經(jīng)過消化道時常受到消化液的降解，疫苗很容易被破壞，影響免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的應(yīng)用和推廣受到限制。近年來疫苗投遞系統(tǒng)成為研究傳染病防御領(lǐng)域新技術(shù)的熱點之一。尤其是細(xì)菌活載體疫苗因具有培養(yǎng)方便，外源基因容量大，刺激細(xì)胞免疫力強(qiáng)等優(yōu)點具有巨大的應(yīng)用潛力。細(xì)菌載體疫苗是新興現(xiàn)代疫苗的重要發(fā)展方向，所謂細(xì)菌載體疫苗是將所需的編碼病原菌特異性抗原的DNA片段插入減毒的病原菌或者共生菌中，提呈表達(dá)所編碼的抗原，以期達(dá)到預(yù)防一種或多種疾病的目的。通過活菌載體遞送疫苗抗原不僅可刺激腸道局部免疫應(yīng)答，又可針對特異性抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，使機(jī)體可以獲得全面的保護(hù)力。
以前的研究表明一些減毒細(xì)菌可作為疫苗抗原的載體，如沙門氏菌、弱毒李斯特菌等。國外學(xué)者以減毒沙門氏菌為載體在真核細(xì)胞中成功表達(dá)了lacZ基因、綠色熒光蛋白(GFP)基因、HIV-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等。但沙門氏菌為載體傳遞DNA疫苗也存在潛在危險性。首先，減毒細(xì)菌可能存在毒力返強(qiáng)的危險；其次，質(zhì)粒DNA可能會整合到宿主細(xì)胞基因組，從而引起調(diào)控細(xì)胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失控、體細(xì)胞癌變、細(xì)胞轉(zhuǎn)型等一系列問題。此外，減毒細(xì)菌對一些老弱病殘個體可能有潛在致病性。因此，選擇理想的疫苗抗原載體是建立生物學(xué)新技術(shù)的關(guān)鍵。理想的輸送抗原的載體應(yīng)該是能夠在體內(nèi)較長時間存在，本身對機(jī)體既安全又能產(chǎn)生持續(xù)免疫力的一些微生物。
乳酸桿菌是安全的益生菌，利用一些乳酸桿菌在胃腸道、泌尿、生殖系統(tǒng)中或黏膜部位黏附存活且無病原性等特點，開展活菌口服疫苗和黏膜疫苗載體的研究，日益受到了廣泛的重視。理想的疫苗載體系統(tǒng)能夠把表達(dá)的外源性蛋白抗原分泌到細(xì)胞外。外源蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)在生物技術(shù)上一直是一個挑戰(zhàn)。乳酸桿菌的一些菌株具有S層(S-layer)，由單一的蛋白亞單位組成規(guī)則排列的類晶格結(jié)構(gòu)。與大腸桿菌相比，乳酸桿菌僅有一層細(xì)胞膜，目的蛋白可在S層蛋白信號肽的引導(dǎo)下直接分泌到細(xì)胞外，從而容易獲得目的蛋白。將目的抗原與乳酸桿菌S層蛋白信號肽序列融合，將其克隆于乳酸桿菌表達(dá)質(zhì)粒啟動子下游，通過電轉(zhuǎn)化可以獲得穩(wěn)定表達(dá)抗原的乳酸桿菌。雖然一些革蘭氏陰性菌也具有S層，但革蘭氏陰性菌存在一定缺點，如在大腸桿菌中，重組蛋白易被內(nèi)毒素污染并易以不溶的包涵體形式在細(xì)胞質(zhì)中堆積；而乳酸桿菌則能穩(wěn)定的將異源性重組蛋白表達(dá)于細(xì)胞外。但是前幾年乳酸桿菌的遺傳和分子生物學(xué)研究進(jìn)展較為緩慢，主要是由于乳酸桿菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究的不夠深入。
3乳酸桿菌的標(biāo)記在研究乳酸桿菌啟動小腸免疫應(yīng)答的機(jī)制時，需要對乳酸桿菌進(jìn)行標(biāo)記以便于觀察。對乳酸桿菌的分子生物學(xué)研究已經(jīng)有了很大的發(fā)展，許多工具已開發(fā)并運(yùn)用于乳酸桿菌上了。如DNA探針已作為一種特異性方法用來在復(fù)雜的環(huán)境中確認(rèn)一些微生物。食物中的細(xì)菌可以通過PCR擴(kuò)增特異性片斷來確認(rèn)。這些技術(shù)具有種屬特異性以及很好的敏感性，但是不能觀測到單個細(xì)菌的情況。另外，由于要從復(fù)雜的環(huán)境中提取核酸以及PCR效率問題，這些都會限制這些標(biāo)記技術(shù)的運(yùn)用。近年來構(gòu)建了一系列外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，使乳酸桿菌成為表達(dá)外源基因的良好工程菌株。許多的報告基因，如大腸埃希菌(Escherichiacoli)β-葡苷酸酶(β-glucoronidase)基因、腸膜狀明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(α-amylase)基因、弧菌屬細(xì)菌(Vibrio fischeri)熒光素酶(luciferase)基因和金黃色葡萄球菌(S.aureus)核酸酶(nuclease)基因已經(jīng)用于乳酸桿菌的功能表達(dá)和細(xì)菌的定位。為了檢測到這些表達(dá)報告基因的重組乳酸桿菌，通常需要依賴于外源性底物，因此它們很難運(yùn)用于體內(nèi)試驗。從jellyfish Aequorea Victoria分離到的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)報告系統(tǒng)可以很好的解決這個問題，GFP是一種完美的熒光標(biāo)記分子，與其他生物發(fā)光或熒光指示分子不同，該蛋白能夠自身催化形成發(fā)光結(jié)構(gòu)并在紫外或藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。作為熒光標(biāo)記分子，GFP具有很多優(yōu)點，如檢測方便，熒光穩(wěn)定，易于構(gòu)建載體且對活細(xì)胞無毒害，對目的基因的功能沒有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞可以繼續(xù)傳代。因此，GFP是穩(wěn)定的非種屬限制的標(biāo)記分子，能夠檢測活體細(xì)胞的運(yùn)動。
許多學(xué)者在不同的細(xì)菌中表達(dá)GFP，觀察表達(dá)GFP的這些重組菌與宿主間的相互聯(lián)系。Dhandayuthapani等在牛的結(jié)核分支桿菌成功地表達(dá)了GFP，并研究了該分支桿菌與巨噬細(xì)胞的相互作用。Stephan Khler等在布魯氏菌中成功的表達(dá)了GFP，該布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞，在24h和48h后成功地在巨噬細(xì)胞中觀察到了布魯氏菌的增殖情況，這將有利于我們更好的了解布魯氏菌是如何消除巨噬細(xì)胞的殺菌機(jī)制的。鼠傷寒沙門氏菌能夠穿過很多動物(包括人)胃腸道的上皮屏障，在粘膜下層和淋巴結(jié)附近增殖。海魚分枝桿菌可以引起冷血動物的慢性系統(tǒng)感染，同時也會引起人體肢端的感染。Valdivia RH等在鼠傷寒沙門氏菌和海魚分枝桿菌中表達(dá)了GFP，且鼠傷寒沙門氏菌和海魚分枝桿菌對宿主細(xì)胞的侵入和增殖能力并不會隨著GFP的表達(dá)而改變。表達(dá)GFP的海魚分枝桿菌感染青蛙五周后，可在青蛙的脾和肺觀察到該細(xì)菌。
總之，乳酸桿菌最令人感興趣的新領(lǐng)域之一是利用乳酸桿菌作為口服疫苗的載體。TTFC在乳酸桿菌中的成功表達(dá)證明將乳酸桿菌應(yīng)用于黏膜免疫是完全可行的。在許多動物模型中進(jìn)行的黏膜疫苗的研究，都取得了較好的免疫效果，但這些結(jié)果和結(jié)論能否適用于人類，仍存在一定距離?，F(xiàn)在構(gòu)建乳酸桿菌口服基因工程苗的表達(dá)載體的條件都已逐漸完善，只是乳酸桿菌如何誘導(dǎo)小腸產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。我們所面對的巨大挑戰(zhàn)是如何使機(jī)體對表達(dá)任何抗原的乳酸桿菌都能產(chǎn)生需要的免疫應(yīng)答。有了乳酸桿菌的標(biāo)記系統(tǒng)，弄清乳酸桿菌如何誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)的機(jī)制只是時間上的問題。乳酸桿菌很有希望成為口服基因工程苗的表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的乳酸桿菌工程體，將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)化從雞分離的乳酸桿菌，作為一種標(biāo)記分子，有利于以后觀察乳酸桿菌在腸道內(nèi)的運(yùn)動分布情況。更為將來乳酸桿菌作為抗原遞送載體提供基礎(chǔ)技術(shù)。
技術(shù)方案本發(fā)明的基因工程體的特征在于將gfp基因插入質(zhì)粒pLEM415，構(gòu)建成gfp表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化從雞小腸分離到的乳酸桿菌，即成本發(fā)明的基因工程體-lactobacillus-pLEM415-gfp。
菌種分類德氏乳桿菌乳亞種命名-lactobacillus-pLEM415-gfp其主要基因為gfp基因本發(fā)明乳酸桿菌的基因工程體，其特征在于用以下方法構(gòu)建而成1)pldhL-gfp片段的獲取根據(jù)質(zhì)粒pRV85的基因序列，設(shè)計1對包含啟動子pldhL的gfp基因的引物L(fēng)1和L2L15’TTAGGGCCCACTGAGAAGTTGCTCTC3’Apa IL2 5’TTAATCGATTTATTTGTAGAGCTCATCC3’Cla I以pRV85質(zhì)粒為摸板，用PCR擴(kuò)增出片斷pldhL-gfp；2)gfg::pLEM415質(zhì)粒的構(gòu)建將上述提取的pldhL-gfp基因插入pLEM415質(zhì)粒，構(gòu)建gfp::pLEM415重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，用Kpn I和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒為三條帶，大小分別為6288bp、727bp和279bp，PCR擴(kuò)增得到為1006bp的pldhL-gfp基因片段，表明構(gòu)建成功；3)電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌將新構(gòu)建的gfg::pLEM415重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化從雞胃腸道分離的乳酸桿菌，轉(zhuǎn)化后選擇抗性菌落鑒定即可得到轉(zhuǎn)化子，從乳酸桿菌轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，用Kpn I和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒為三條帶，大小分別為6288bp、727bp和279bp，PCR擴(kuò)增得到為1006bp的pldhL-gfp基因片段表明乳酸桿菌的電轉(zhuǎn)化成功；4)綠色熒光蛋白表達(dá)的觀察液體培養(yǎng)基中的乳酸桿菌離心后收集沉淀，用鹽溶液潤洗，涂抹在載玻片上，Leica熒光顯微鏡下觀察，同時以未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的乳酸桿菌作為對照，結(jié)果觀察到綠色熒光，證明綠色熒光蛋白的表達(dá)，證明本發(fā)明的基因工程體-lactobacillus(德氏乳桿菌乳亞種)-pLEM415-gfp的構(gòu)建成功。
有益效果 本發(fā)明提供的表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的乳酸桿菌工程體，將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)化從雞分離的乳酸桿菌，作為一種標(biāo)記分子，有利于以后觀察乳酸桿菌在腸道內(nèi)的運(yùn)動分布情況。
本發(fā)明基因工程體有綠色熒光蛋白的表達(dá)，且在30C下熒光強(qiáng)度最大。
本發(fā)明所提供的基因工程體可用大量擴(kuò)增培養(yǎng)，用于研究乳酸桿菌在體內(nèi)的運(yùn)動情況及與腸道的相互作用機(jī)理。提取該乳酸桿菌的質(zhì)粒后，可插入各種抗原、活性肽和藥物等，廣泛的用于科研，生產(chǎn)等各種領(lǐng)域。為將來乳酸桿菌作為抗原遞送載體提供基礎(chǔ)技術(shù)。
本發(fā)明構(gòu)建了乳酸桿菌的標(biāo)記系統(tǒng)，有利于弄清乳酸桿菌如何誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)的機(jī)制。乳酸桿菌很有望成為非常具有吸引力的口服基因工程苗的表達(dá)載體。
四

圖1 pLEM415::gfp的PCR產(chǎn)物及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定電泳圖譜A 1 Marker DL2000 2 PCR產(chǎn)物B 1 Marker DL2000 2 pLEM415::gfp 3 pLEM415::gfp Kpn I和EcoRI雙酶切4 Marker λ-HindIII圖2熒光顯微鏡下的觀察10×40A表達(dá)綠色熒光蛋白的德氏乳桿菌乳亞種R4B未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的德氏乳桿菌乳亞種R4(陰性對照)圖3 Kpn I和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒五具體實施方式
1 pldhL-gfp片段的獲取根據(jù)pRV85(公知公用載體，Gory L，Montel MC，Zagorec M.Use of green fluorescentprotein to monitor Lactobacillus sakei in fermented meat products.FEMS Microbiol Lett2001；194127-133)和pLEM415(公知公用載體，Serror，P.，T.sasaki，S.D.Ehrlich，and E.Maguin.Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L.delbrueckii subsp.lactis with various plasmids.Appl.Environ.Microbiol 2002；6846-52.)兩個質(zhì)粒的基因序列設(shè)計了一對引物L(fēng)1、L2，引物及其包含的酶切位點如下L1 5’TTAGGGCCCACTGAGAAGTTGCTCTC 3’(Apa I)，L2 5’TTAATCGATTTATTTGTAGAGCTCATCC 3’(Cla I)，PCR擴(kuò)增出pldhL-gfp片斷，共1006bp.
PCR反應(yīng)體系(50μL)10×buffer5μL；Mg2+4μL，dNTP(2.5mmpl/L)1μL；引物F(20pmol/L)0.25μL，R0.25μL；Taq酶(1U/μL)0.5μL；模板DNA為質(zhì)粒pRV85(50ng/μL)1uL；ddH2O38μL。引物由三博遠(yuǎn)志生物有限公司合成，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，32個循環(huán)后72℃延伸5min。
2 gfg基因的酶切將pldhL-gfp片斷用限制性內(nèi)切酶Apa I和Cla I消化(37℃，6h))，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切下凝膠中pldhL-gfp基因片斷，將切下的DNA片段用DNA回收試劑盒回收，得到的帶粘性末端的gfp基因(GenBank accession no.U62636)，即可用于連接反應(yīng)。
3 pLEM415質(zhì)粒的酶切回收質(zhì)粒pLEM415是乳酸桿菌和大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒，有一多克隆位點，具有氨芐青霉素抗性和紅霉素抗性。載體質(zhì)粒pLEM415用限制性內(nèi)切酶Apa I和Cla I消化(37℃，6h))，取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，切下凝膠中線性化的pLEM415。將切下的DNA片段用DNA回收試劑盒回收，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 4 連接回收的線性化質(zhì)粒pLEM415與pldhL-gfp基因片斷以1∶3(物質(zhì)的量比)混合，加入T4DNA連接酶，按DNA連接藥盒說明書進(jìn)行，其反應(yīng)體系如下pLEM415質(zhì)粒雙酶切回收產(chǎn)物 5μlgfg基因雙酶切回收產(chǎn)物 9μlT4連接酶 3μlT4連接酶緩沖液2μlddH2O1μl混勻后，置16℃過夜反應(yīng)，即為重組表達(dá)質(zhì)粒pLEM415::gfp，立即可用于轉(zhuǎn)化。
5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備參照《分子克隆實驗指南》(第三版)(2002，96-98，科學(xué)出版社)介紹的方法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
6 轉(zhuǎn)化取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照《分子克隆實驗指南》(第三版)(2002，99-102，科學(xué)出版社)介紹的方法進(jìn)行。取200μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布含Amp 50mg/ml的LB瓊脂平板，同時設(shè)未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌作對照(陰性對照)，接種后置37℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)18h，觀察對照板(感受態(tài)DH5α菌)上無細(xì)菌，而轉(zhuǎn)化后的DH5α板上有細(xì)菌。
7 重組表達(dá)質(zhì)粒pLEM415::gfp克隆株的篩選挑選上述培養(yǎng)平板中的單個菌落，在含有氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h。堿裂解法提取大腸桿菌中的質(zhì)粒，進(jìn)一步做PCR鑒定和酶切鑒定(圖1)。
8 重組質(zhì)粒的PCR鑒定和酶切鑒定質(zhì)粒pLEM415有1個多克隆位點，用Apa I和Cla I消化后，將回收的gfp基因定向地插入載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒pLEM415::gfp.以該重組質(zhì)粒為模板，用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約為1006bp的片段表明gfp基因已被克隆入載體質(zhì)粒中，結(jié)果見圖1(圖1A)。用Kpn I和EcoRI雙酶切消化pLEM415::gfp，電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒(圖3)被切為三條帶，大小分別為6288bp、727bp和279bp。驗證結(jié)果與酶切圖譜(圖1B)相吻合，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
9 重組質(zhì)粒的提取質(zhì)粒的提取按《分子克隆實驗指南》(第三版)(2002，27-29，科學(xué)出版社)介紹的方法進(jìn)行。
10 乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取乳酸桿菌德氏乳桿菌乳亞種R4(公知公用菌種，于卓騰毛勝勇朱偉云，雞腸黏膜乳酸菌的抗菌能力及其對抗菌素的藥敏特性，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，24(4)，2005376-379)菌落在MRS中培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物以1∶50稀釋，37℃培育3.5-4h(OD600值約為0.5)。冰浴使細(xì)菌停止生長，4℃，4000g離心10min。無菌條件下棄上清，用冰預(yù)冷的10％甘油溶液沖洗三遍，充分洗盡離心管中的雜質(zhì)和離子。最后加入1ml的10％甘油重新懸浮，獲得乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞。
11 乳酸桿菌的電轉(zhuǎn)化取2μL水溶的質(zhì)粒和40μL待轉(zhuǎn)化的乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞混合，然后移入供轉(zhuǎn)化用的電極杯中(間距0.2cm)，冰上放置5min。移入BioRad基因脈沖儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，本試驗固定電阻為200Ω，電容為25μF，改變電場強(qiáng)度進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。在電壓為1.5kV時獲得最大轉(zhuǎn)化效率，之后隨電壓增加轉(zhuǎn)化效率下降。這與Charlene等轉(zhuǎn)化乳酸桿菌時的電擊參數(shù)一致。電脈沖轉(zhuǎn)化后，在電擊杯中加入400μLMRS培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移入1.5mLEP管中于37℃靜止培養(yǎng)2h，取100μL轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含氨芐青霉素(50μg/mL)MRS平板上，培養(yǎng)36h，選擇抗性菌落鑒定即可得到轉(zhuǎn)化子。按照Anderson和McKay的方法從乳酸桿菌轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，用Kpn I和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒(圖3)為三條帶，大小分別為6288bp、727bp和279bp(圖1B)，PCR擴(kuò)增得到約為1006bp的pldhL-gfp基因片段表明乳酸桿菌的電轉(zhuǎn)化成功(圖1A)。
12 綠色熒光蛋白表達(dá)的觀察液體培養(yǎng)基中的乳酸桿菌離心后收集沉淀，用鹽溶液(NaCl 8.5g/L)潤洗，然后涂抹在載波片上，于Leica熒光顯微鏡下觀察，同時以未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的乳酸桿菌作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子中有綠色熒光蛋白的表達(dá)(圖2)，且在30℃下熒光強(qiáng)度最大，在其它的溫度條件下，熒光的亮度有所降低。
以上實驗重復(fù)兩次，所得結(jié)果一致。
應(yīng)用本發(fā)明所提供的基因工程體可用大量擴(kuò)增培養(yǎng)，用于研究乳酸桿菌在體內(nèi)的運(yùn)動情況及與腸道的相互作用機(jī)理。提取該乳酸桿菌的質(zhì)粒后，可插入各種抗原、活性肽和藥物等，廣泛的用于科研，生產(chǎn)等各種領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的乳酸桿菌工程體，其特征在于將gfp基因插入大腸桿菌-乳酸桿菌的穿梭質(zhì)粒pLEM415中，構(gòu)建成gfp::pLEM415質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后提取該質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化從雞胃腸道分離的乳酸桿菌，即成本發(fā)明的乳酸桿菌工程體-lactobacillus(德氏乳桿菌乳亞種)-pLEM415-gfp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程體，其特征在于，由以下方法構(gòu)建而成1)pldhL-gfp片段的獲取根據(jù)質(zhì)粒pRV85的基因序列，設(shè)計1對包含啟動子pldhL的gfp基因的引物L(fēng)1和L2L15’TTAGGGCCCACTGAGAAGTTGCTCTC 3’Apa IL2 5’TTAATCGATTTATTTGTAGAGCTCATCC 3’Cla I以pRV85質(zhì)粒為摸板，用PCR擴(kuò)增出片斷pldhL-gfp；2)gfp::pLEM415質(zhì)粒的構(gòu)建將上述提取的pldhL-gfp基因插入pLEM415質(zhì)粒，構(gòu)建gfp::pLEM415重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，用Kpn I和EcoR I雙酶切重組質(zhì)粒為三條帶，大小分別為6288bp、727bp和279bp，PCR擴(kuò)增得到為1006bp的pldhL-gfp基因片段，表明構(gòu)建成功；3)電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌將新構(gòu)建的gfp::pLEM415重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化從雞胃腸道分離的乳酸桿菌，轉(zhuǎn)化后選擇抗性菌落鑒定即可得到轉(zhuǎn)化子，從乳酸桿菌轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，用Kpn I和EcoR I雙酶切重組質(zhì)粒為三條帶，大小分別為6288bp、727bp和279bp，PCR擴(kuò)增得到為1006bp的pldhL-gfp基因片段表明乳酸桿菌的電轉(zhuǎn)化成功；4)綠色熒光蛋白表達(dá)的觀察液體培養(yǎng)基中的乳酸桿菌離心后收集沉淀，用鹽溶液潤洗，涂抹在載玻片上，Leica熒光顯微鏡下觀察，同時以未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的乳酸桿菌作為對照，結(jié)果觀察到綠色熒光，證明綠色熒光蛋白的表達(dá)，證明本發(fā)明的基因工程體-lactobacillus(德氏乳桿菌乳亞種)-pLEM415-gfp的構(gòu)建成功。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的乳酸桿菌基因工程體，包括將gfp基因插入質(zhì)粒pLEM415，構(gòu)建成gfp表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化從雞小腸分離到的乳酸桿菌，即成本發(fā)明的基因工程體－lactobacillus－pLEM415－gfp。在轉(zhuǎn)化子中有綠色熒光蛋白的表達(dá)，且在30℃下熒光強(qiáng)度最大。本發(fā)明所提供的基因工程體可用于大量擴(kuò)增培養(yǎng)，用于研究乳酸桿菌在體內(nèi)的運(yùn)動情況及與腸道的相互作用機(jī)理，提取該乳酸桿菌的質(zhì)粒后，可插入各種抗原、活性肽和藥物等，廣泛的用于科研，生產(chǎn)等各種領(lǐng)域。乳酸桿菌很有望成為口服基因工程苗的表達(dá)載體。
文檔編號C12N15/10GK1793336SQ20051012629
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日
發(fā)明者楊倩, 庾慶華 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)