專利名稱：用于基因工程的載體、緩沖液及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及用于基因工程的ー種新型載體、ー種新型緩沖液及它們的使用方法。
背景技術(shù)：
基因工程(genetic engineering)又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù),是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)，在體外構(gòu)建重組DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品等。此外，基因工程還為研究基因和基因組結(jié)構(gòu)與功能提供了最基本的手段，已成為 生命科學(xué)中不可缺少的基本研究方法，在許多方面都有重要應(yīng)用，包括但不限于基因組組織結(jié)構(gòu)研究、基因表達(dá)研究、重組蛋白生產(chǎn)、轉(zhuǎn)基因生物、基因治療、藥物篩選、動(dòng)植物的抗逆性等。在經(jīng)典的基因工程實(shí)驗(yàn)中，通常包括以下主要步驟I.選擇受體細(xì)胞和載體盡管有許多種受體細(xì)胞和載體在使用，但絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)是從E. coli實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)?？寺≥d體起步的。由于其技術(shù)完備、通用性強(qiáng)、獲取容易，E. coli和質(zhì)粒載體早已成為本領(lǐng)域的首選。但是，如果要克隆的DNA特別大，例如數(shù)十萬(wàn)堿基對(duì)或更大，在需要使用細(xì)菌人工染色體或酵母菌人工染色體(hizuya H, Birren B, Kim UJ等人，Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 89(18) :8794-7)。2.準(zhǔn)備載體和目的片段DNA在經(jīng)典的基因工程研究中，為了把目的片段克隆到載體上，載體DNA和目的DNA應(yīng)當(dāng)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(下稱內(nèi)切酶)酶切從而產(chǎn)生匹配的末端以便把目的DNA連接到載體上。內(nèi)切酶的選擇要考慮載體和目的片段能產(chǎn)生互相匹配的末端。在經(jīng)典基因工程實(shí)驗(yàn)中，這ー過(guò)程是用相同的內(nèi)切酶或內(nèi)切酶組合分別切割載體DNA和目的片段實(shí)現(xiàn)的。如果用平端內(nèi)切酶、單個(gè)粘性末端酶或同尾酶處理載體，還需要用堿性磷酸酶對(duì)載體進(jìn)行處理，以防止載體自連。無(wú)論是用粘性末端酶還是用平端酶切酶，處理過(guò)的載體都要經(jīng)過(guò)純化以去除對(duì)后續(xù)的連接等過(guò)程有影響的成分。兩個(gè)非同尾酶(例如BamHI和EcoRI)切割DNA分子產(chǎn)生的片段末端不互補(bǔ)，因此不能自連。在經(jīng)典基因工程操作中，帶有兩個(gè)不能自連的非同尾末端的載體是最普遍使用的。用內(nèi)切酶切割上述來(lái)源的DNA使其產(chǎn)生可與前述準(zhǔn)備好的帶粘性末端或平末端的載體相匹配的末端。目的片段上沒(méi)有與載體相匹配的位點(diǎn)時(shí)，可以通過(guò)添加接頭(Brown, Terry(2006). Gene cloning and DNA analys is: an introduction ( 因克隆和DNA分析介紹)。劍橋，馬薩諸塞州；布萊克韋爾出版社ISBN 1-4051-1121-6和Russell, David ff. ;Sambrook, Joseph(2001). Molecular cloning:a laboratory manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))。冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室)或通過(guò)PCR使其兩端帶上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)。3.制備重組DNA分子
用上述預(yù)處理過(guò)的載體和目的片段制備重組DNA分子是通過(guò)多個(gè)簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)步驟完成的。其中，最主要的是連接反應(yīng)。即把上述準(zhǔn)備的合格載體和目的DNA片段按一定比例混合，加入DNA連接酶和相應(yīng)的緩沖液，保溫一定時(shí)間后帶有匹配末端的兩個(gè)DNA片段就可以連接成重組DNA分子。在基因工程研究中，DNA連接酶是ー種常用工具酶，它可以把兩個(gè)具有匹配末端的DNA分子連接成重組DNA分子?；蚬こ虒?shí)驗(yàn)中常用T4DNA連接酶。4.把重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞把重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有多種，其名稱因所用實(shí)驗(yàn)過(guò)程而異。這些方法包括但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染和電擊等(Brown, Terry (2006).Gene cloning and DNA analysis:an introduction (基因克隆和 DNA 分析介紹)。劍橋，馬薩諸塞州；布萊克韋爾出版社ISBN 1-4051-1121-6和Russell, Davidff. ; Sambrook, Joseph (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))。冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。5.篩選帶有載體序列的細(xì)胞無(wú)論用什么方法導(dǎo)入，受體細(xì)胞中只有一小部分?jǐn)z取了 DNA。為了從轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞群體中篩選出頻率很低的攝取了 DNA的細(xì)胞(稱為轉(zhuǎn)化子)，科學(xué)家巧妙地運(yùn)用抗抗生素基因等方法使那些沒(méi)有攝取DNA的細(xì)胞被殺死，只有可自我復(fù)制并帶有選擇標(biāo)記基因的載體的細(xì)胞才能存活下來(lái)(Brown, Terry (2006) · Gene cloning and DNA analysis: anintroduction (基因克隆和DNA分析介紹)。劍橋，馬薩諸塞州；布萊克韋爾出版社ISBN1-4051-1121-6 和 Russell, David ff. ; Sambrook,Joseph(2001). Molecular cloning:alaboratory manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)0。冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。無(wú)論受體細(xì)胞是細(xì)菌、動(dòng)植物細(xì)胞還是其他受體細(xì)胞,都是通過(guò)抗性基因完成篩選的。在細(xì)菌中通常使用抗抗生素基因，如抗氨芐青霉素基因bla等。6.篩選帶有目的片段和生物學(xué)特性的克隆流行的載體帶有ー個(gè)來(lái)自大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(IacZ)的啟動(dòng)子和前146個(gè)氨基酸的編碼區(qū)。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)。這種載體與支持α -互補(bǔ)的受體細(xì)胞(帶有可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列)構(gòu)成十分有效的篩選體系。受體細(xì)胞和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)能產(chǎn)生可催化X-Gal產(chǎn)生呈色反應(yīng)使菌落成為藍(lán)色菌斑。如果在多克隆位點(diǎn)插入了目的片段，則LacZ的功能被破壞，不能發(fā)生呈色反應(yīng)，菌落為白色。借此，可以很容易地識(shí)別插入了目的片段的克隆。在基因工程研究中，可以插入外源DNA并能在受體細(xì)胞中復(fù)制的DNA結(jié)構(gòu)稱之為載體。通常，載體是質(zhì)粒、噬菌體或病毒，也可以是用來(lái)自于質(zhì)粒、噬菌體或病毒的某些元件人工重建的遺傳單元。一個(gè)載體至少是ー個(gè)能夠自我復(fù)制的最小遺傳單位，因此它必須具有至少ー個(gè)復(fù)制起始序列。載體可分為克隆載體和表達(dá)載體兩大類。
克隆載體是基因克隆的關(guān)鍵工具。一些商業(yè)公司開發(fā)出多種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、可以方便地克隆包括但不限于結(jié)構(gòu)基因和其他功能DNA片段的克隆載體，為基因工程研究提供了廣泛使用的工具。這些載體包括但不限于pUC系列、pBlueScript系列等。表達(dá)載體是基因工程的另ー關(guān)鍵工具，可用于使目的基因表達(dá)為蛋白。與克隆載體一祥，它帶有一個(gè)在大腸桿菌中有效的復(fù)制起始序列和一個(gè)在大腸桿菌中有效的抗抗生素基因，使其在大腸桿菌中繁殖并可用其制備質(zhì)粒DNA。與克隆載體相比，表達(dá)載體還有ー個(gè)由啟動(dòng)子和一個(gè)終止序列組成的空載(不帶有結(jié)構(gòu)基因)表達(dá)框。在啟動(dòng)子和終止序列之間有ー個(gè)可用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)，用于插入各種來(lái)源的目的片段。為了使表達(dá)載體能在受體細(xì)胞(如酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等)中穩(wěn)定傳代，還帶有在受體細(xì)胞中有效的復(fù)制起始序列(如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用SV40的復(fù)制起始序列)和抗抗生素基因等抗性基因(如Neo、Hygromycin等)。目前已經(jīng)有適用于包括但不限于動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌或真菌細(xì)胞表達(dá)基因產(chǎn)物用的表達(dá)載體，例如pET系列、pcDNA系列等商業(yè)供應(yīng)的表達(dá)載體。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，無(wú)論是克隆載體還是表達(dá)載體，都必須有至少ー個(gè)多克隆位點(diǎn)以便插入目的片段。多克隆位點(diǎn)是載體的基本結(jié)構(gòu)，它決定了克隆目的片段所需要的實(shí)驗(yàn)操作。廣泛使用的載體已經(jīng)很多。在提供了有效研究工具的同吋，這些載體的多克隆位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)決定了用它們克隆目的片段時(shí)無(wú)法避免在克隆DNA片段前用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶等エ具對(duì)載體進(jìn)行預(yù)處理。因此，在經(jīng)典的基因工程實(shí)驗(yàn)中，在連接前需要對(duì)載體和目的片段進(jìn)行酶切、酶切后純化、載體的自連率檢定等繁瑣的程序。這是ー個(gè)冗長(zhǎng)且不容易控制的程序，常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或不夠理想。這是現(xiàn)有克隆方法中需要改進(jìn)的重要方面。同吋，由于在對(duì)載體DNA進(jìn)行酶切和連接時(shí)總有ー些分子不能被切割和產(chǎn)生自連產(chǎn)物(統(tǒng)稱為自連產(chǎn)物)，轉(zhuǎn)化后總會(huì)長(zhǎng)出一些帶有原始載體的克隆。這種克隆也同樣出現(xiàn)在帶有插入片段的連接產(chǎn)物中。如果自連產(chǎn)生的克隆比例過(guò)高，則會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)嚴(yán)重干擾。因此，每ー批酶切處理的載體都要經(jīng)過(guò)自連率檢測(cè)以評(píng)價(jià)預(yù)處理載體的質(zhì)量。如果自連率過(guò)高，則不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)際工作中，自連率過(guò)高是導(dǎo)致準(zhǔn)備載體失敗的常發(fā)因素，有可能造成連續(xù)失敗。這種情況也是現(xiàn)有載體需要改進(jìn)的重要方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的在于根據(jù)某些內(nèi)切酶或內(nèi)切酶組合產(chǎn)生的末端可出現(xiàn)“識(shí)別位點(diǎn)沉默”這ー現(xiàn)象提供ー種新型的載體，以使得基因工程中目的DNA片段與載體連接的過(guò)程更加簡(jiǎn)單、有效和可靠。本發(fā)明的另ー個(gè)目的在于提供ー種支持多種酶單獨(dú)或共同工作的緩沖液。本發(fā)明的另ー個(gè)目的在于提供ー種將目的DNA片段與載體連接的方法。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了ー種載體，其特征在于所述載體包含ー個(gè)或多個(gè)多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與其他DNA片段連接產(chǎn)生不被所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別的重組分子。在本發(fā)明提供的載體中，所述限制性內(nèi)切酶可以是同尾酶、酶切位點(diǎn)在識(shí)別序列之外的限制性內(nèi)切酶或其組合。在本發(fā)明提供的載體中，所述限制性內(nèi)切酶可包括但不限XbaI、StyI, NcoI,NheI、Spel、BamHI、Bglll、Bell、Sail、HincII、Xhol、Mlul、Paul、EcoRI、Muni、PstI、NsiI、SmaI> SmiI> PmlI> StuI> EcoRV、PvuII> Alw26I、BseGI> BseMI、BseNI、Eco31I、Eaml 1041 >MnlI、BseXI、MboII、SchI、BoxI、BsaBI、BseJI、BseLI、DraIII、Eco91I、SfiI、Van91I、PpiI、AjuI、AlfI、AloI、BdaI、BplI、Hin4I、TscaAI 和 TstI0在本發(fā)明提供的載體中，所述載體的多克隆位點(diǎn)序列可包含SEQ ID NO: I或5。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的載體在基因工程中的應(yīng)用。在本發(fā)明提供的所述載體的應(yīng)用中，所述基因工程可以是定向克隆或非定向克 隆。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了ー種支持多種工具酶單獨(dú)或共同工作的緩沖液，其特征在于包含 50mM Tris-こ酸，IOOmM こ酸鉀，15mM こ酸鎂、ImM DTT,O. 1%BSA、0. 5mM ATP,pH為7. 5-8. 3，優(yōu)選地，為7. 7,7. 9,8. 0,8. 1,8. 3，更優(yōu)選地為8. 3，所述工具酶包括但不限于T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、多聚核苷酸激酶和Klenow片段。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了第三方面所述的緩沖液在基因工程中的應(yīng)用。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了ー種將目的DNA片段與載體連接的方法，其特征在于使用第一方面所述的載體在同一個(gè)步驟中完成所述目的DNA片段與所述載體的酶切和連接。本發(fā)明提供的方法，其特征在于可使用第三方面所述的緩沖液。本文中，術(shù)語(yǔ)“目的DNA片段”，簡(jiǎn)稱“目的片段”是指所有需要研究的DNA分子。目的片段可以來(lái)自基因組DNA，也可以來(lái)自cDNA、人工合成的DNA，而當(dāng)前最多的是PCR產(chǎn)物(包括RT-PCR產(chǎn)物)。術(shù)語(yǔ)“載體”是指在基因工程研究中，可以插入外源DNA井能在受體細(xì)胞中復(fù)制的DNA結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“多克隆位點(diǎn)”是指DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。術(shù)語(yǔ)“限制性內(nèi)切酶”，簡(jiǎn)稱“內(nèi)切酶”，是ー類在DNA分子上有特定的識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)的DNA水解酶。至2005年初，共發(fā)現(xiàn)3681內(nèi)切酶，有221種特異性。內(nèi)切酶是基因エ程的關(guān)鍵工具酶之一。術(shù)語(yǔ)“同尾酶”是指內(nèi)切酶中存在一些識(shí)別序列不同但可以產(chǎn)生相同序列粘性末端的內(nèi)切酶。有些內(nèi)切酶產(chǎn)生平末端。由于所有平末端都可以互相連接，與上述的同尾酶關(guān)系相似，本發(fā)明中把平端內(nèi)切酶也歸為同尾酶術(shù)語(yǔ)“切點(diǎn)沉默”是指把兩種同尾酶切割的DNA片段連接后，原來(lái)的識(shí)別序列將不存在，因而不能被原來(lái)的內(nèi)切酶識(shí)別和切割。術(shù)語(yǔ)“沉默切點(diǎn)”是指切點(diǎn)沉默所產(chǎn)生的序列 術(shù)語(yǔ)“沉默前序列”是指能夠經(jīng)內(nèi)切酶酶切和連接產(chǎn)生沉默切點(diǎn)的序列。術(shù)語(yǔ)“基因工程”是指將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。


圖I.本發(fā)明中設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)(A)及其序列。圖2. pUC57MC多克隆位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)序列見SEQ ID NO: I。圖3.Buffer X支持多種內(nèi)切酶的實(shí)驗(yàn)。圖A是本發(fā)明的19種主要內(nèi)切酶對(duì)PUC57MC的酶切結(jié)果，圖B是圖A中19種匹 配位點(diǎn)內(nèi)切酶對(duì)帶有單個(gè)匹配位點(diǎn)的pUC57M的酶切結(jié)果。圖4.以pUC57MC為載體、用雙酶雙粘性末端和單酶雙粘性末端獲得的重組DNA轉(zhuǎn)化后的籃/白斑情況。A.雙酶雙粘性末端，B.單酶雙粘性末端圖5.所構(gòu)建的pCi-Neo/11-GFPq轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后發(fā)射熒光的情況。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.新型載體多克隆位點(diǎn)的設(shè)計(jì)一、同尾酶的利用在設(shè)計(jì)新的多克隆位點(diǎn)時(shí)，主要考慮了兩個(gè)原則(1)盡量多地置入包括平端內(nèi)切酶內(nèi)的同尾酶使載體有更多的同尾酶可用，從而滿足載體對(duì)多克隆位點(diǎn)的需求。(2)優(yōu)先選用那些價(jià)格低廉的限制酶以降低使用成本。根據(jù)上述兩個(gè)原則選定以下內(nèi)切酶用于多克隆位點(diǎn)的設(shè)計(jì)(*為平端內(nèi)切酶):表I選定的用于切割載體的內(nèi)切酶及與之匹配的內(nèi)切酶
小:耍位/.': XbaIBamHI KpnI HindIII MluI Apa EcoRI PstII
匹配位點(diǎn) Styl/Ncol Bglll/Bcll N/A N/A Paul N/A MunI NsiI/Nhel/Spel
主要位點(diǎn) SacI/EcoICRI Sall/HincII SmaI* SmiI* PmlI* StuI FcoRV PvuII
**琢氺*:
匹配位點(diǎn)N/A//XhoI//根據(jù)上面的選定，以主要位點(diǎn)組成載體的多克隆位點(diǎn)，匹配位點(diǎn)用于目的片段，從而可方便地獲得匹配的粘性末端或其他結(jié)構(gòu)的末端。用幾個(gè)平端和其他常用內(nèi)切酶位點(diǎn)散布于主要位點(diǎn)中，可在難以找到其他匹配位點(diǎn)時(shí)使用。為方便對(duì)克隆片段進(jìn)行酶切鑒定，在多克隆位點(diǎn)的近末端分別置入兩個(gè)PstI位點(diǎn)，以便用單酶對(duì)插入片段的大小進(jìn)行鑒定。此外，還在該多克隆位點(diǎn)中插入了方向相反的兩個(gè)BsaI位點(diǎn)，以便用單酶切獲得不同的粘性末端。如果在目的片段的兩段置入與之匹配的位點(diǎn)，即可只用ー種內(nèi)切酶與連接酶一起完成定向克隆。把上述選定的內(nèi)切酶的編碼序列按一定順序排列后，即可得到多克隆位點(diǎn)的DNA序列(圖 I 和 SEQ ID NO :1)。二、特殊內(nèi)切酶的利用有一些特殊內(nèi)切酶，其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外。這類酶有兩類，一類是正負(fù)鏈各有一個(gè)切點(diǎn)且在識(shí)別序列的同一側(cè)，例如Alw26I，一類是在識(shí)別序列兩側(cè)的正負(fù)鏈上都有一個(gè)切點(diǎn)，例如PpiI。以Alw26I為例說(shuō)明其應(yīng)用。該酶切點(diǎn)在載體上的序列應(yīng)為
正向序列為GTCTCNI NNNN 反向序列為I NNNN-NGAGACGAGGAN-NNNN 丨NNNN 丨 NCTCTG如果載體上同時(shí)存在如下所示的兩個(gè)背靠背的反向Alw26I位點(diǎn)，則切割時(shí)可產(chǎn)生如圖所示的粘性末端(為敘述方便，以Al表示兩個(gè)位點(diǎn)中的某些指定為載體序列中的特定堿基，大寫字母與相應(yīng)的小寫字母代表互補(bǔ)堿基。下同。)-----I abcd-ngagac gtctcn I EFGH------------ABCD f nctctgcagagn-efgh f-----載體的上述位點(diǎn)被切割后，小寫字母部分被從載體上移掉，兩端分別留下3’ -端粘性末端ABCD和EFGH。在目的片段的兩側(cè)也各放置一個(gè)Alw26的切點(diǎn)，只是方向與載體上的相反。其末端的四個(gè)N指定為目的片段末端的四個(gè)堿基AB⑶/abcd或EFGH/efgh。GTCTCN I abcd—XXXXXXXXXXXXXXXXXXX I EFGH-NGAGACGAGGAN-ABCD 丨 xxxxxxxxxxxxxxxxxxx -efgh 丨 NCTCTG用Alw26I切割后，大寫部分被移除，兩側(cè)各留下與載體上的粘性末端互補(bǔ)的3’ -粘性末端。這種載體和目的片段的粘性末端是互補(bǔ)的，可以方便地進(jìn)行連接。應(yīng)當(dāng)注意的是，(I)這里留下的粘性末端與識(shí)別位點(diǎn)倒轉(zhuǎn)重復(fù)的內(nèi)切酶留下的粘性末端不同，它不是倒轉(zhuǎn)重復(fù)的，而且(2)酶切留下的兩側(cè)粘性末端序列可以不同，(3)如同成對(duì)使用的同尾酶位點(diǎn)一樣，因切掉的部分中該酶的識(shí)別位點(diǎn)已經(jīng)喪失，一旦相應(yīng)片段被連接到該位點(diǎn)，則不可再被Alw26I切割，因此單獨(dú)使用即可實(shí)現(xiàn)定向克隆。被切掉的小片段有可能按照原來(lái)方向重新被連接到原來(lái)位置，但是可重新被切割；被切掉的小片段不可能以相反的方向被連接到另外一端。因此，這種方法也可以不對(duì)載體預(yù)處理單管完成酶切和連接。根據(jù)此類酶的特點(diǎn)，在本發(fā)明的多克隆位點(diǎn)中置入了兩個(gè)方向相反的Alw26I位點(diǎn)。有幾種切點(diǎn)特殊的內(nèi)切酶在克隆中有重要應(yīng)用價(jià)值，其名稱、識(shí)別位點(diǎn)和切割位置列于下表。其中，Alw26I、BsaI和SchI最為適用。表2在識(shí)別位點(diǎn)外單側(cè)正負(fù)鏈均有切點(diǎn)的內(nèi)切酶、識(shí)別序列及切割點(diǎn)
權(quán)利要求
1.一種載體，其特征在于所述載體包含一個(gè)或多個(gè)多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與其他DNA片段連接產(chǎn)生不被所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別的重組分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載體，其中所述限制性內(nèi)切酶是同尾酶、酶切位點(diǎn)在識(shí)別序列之外的限制性內(nèi)切酶或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其中所述限制性內(nèi)切酶包括但不限于XbaI、StyI,NcoI, NheI, SpeI, BamHI, BglII, Bell、Sail、HincII, XhoI, Mlul、Paul、EcoRI, Muni、PstI、Nsil、SmaI, Smil、Pmll、StuI、EcoRV、PvuII、Alw26I、BseGI、BseMI、BseNI、Eco31I、Eaml 1041, MnlI, BseXI, MboII, SchI, BoxI, BsaBI, BseJI、BseLI、DraIII, Eco91I、Sfil、Van91I、PpiI、AjuI、AlfI、AloI、BdaI、BplI、Hin4I、TscaAI 和 TstI0
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載體,其中所述載體的多克隆位點(diǎn)序列包含SEQID NO: I或5。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的載體在基因工程中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述基因工程是定向克隆或非定向克隆。
7.一種支持多種工具酶單獨(dú)或共同工作的緩沖液，其特征在于包含50mMTris-乙酸，IOOmM 乙酸鉀，15mM 乙酸鎂、ImM DTT,0. 1%BSA、0. 5mM ATP，pH 為 7. 5-8. 3，優(yōu)選地，為 7. 7、7.9,8.0,8. 1,8. 3，更優(yōu)選地為8. 3，所述工具酶包括但不限于T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、多聚核苷酸激酶和Klenow片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的緩沖液在基因工程中的應(yīng)用。
9.一種將目的DNA片段與載體連接的方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的載體在同一個(gè)步驟中完成所述目的DNA片段與所述載體的酶切和連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求7中所述的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型的載體、一種支持多種工具酶單獨(dú)或共同工作的緩沖液以及它們的使用方法。與傳統(tǒng)方法相比，使用本發(fā)明的載體和緩沖液進(jìn)行目的DNA片段與載體連接的過(guò)程更加簡(jiǎn)單、有效和可靠。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102732546SQ20121015779
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者劉慶法 申請(qǐng)人:無(wú)錫天演生物技術(shù)有限公司